專利名稱：骨髓來源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及細(xì)胞的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
巨噬細(xì)胞廣泛分布于全身各器官、組織，在保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、機(jī)體防御、炎癥調(diào)控、促進(jìn)組織損傷修復(fù)方面起著重要作用。巨噬細(xì)胞在不同微環(huán)境下具有不同的表型，使巨噬細(xì)胞處于不同的功能狀態(tài)。這些功能狀態(tài)迥異的巨噬細(xì)胞在不同生理及病理?xiàng)l件下發(fā)揮不同的生理功能；與腫瘤、代謝綜合癥、糖尿病等嚴(yán)重疾病的發(fā)生、發(fā)展都有密切的聯(lián)系。靜息巨噬細(xì)胞在不同刺激條件下可激活分化為表型和功能迥異的兩大類型M1型和M2型。Ml型巨噬細(xì)胞主要引起Thl型免疫反應(yīng)，起著細(xì)菌感染防御的作用；加重炎癥反應(yīng)導(dǎo)致組織損傷。M2型巨噬細(xì)胞則主要誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng)，在防御寄生蟲感染，促進(jìn)組 織修復(fù)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方面起著重要作用。骨髓來源的巨噬細(xì)胞具有靜息巨噬細(xì)胞的特點(diǎn)即同源性好，通過不同的刺激條件可分別誘導(dǎo)分化為Ml型(經(jīng)典激活型)和M2(選擇激活型)。另外，骨髓來源的巨噬細(xì)胞還具有產(chǎn)量高，易轉(zhuǎn)染，生長周期長等優(yōu)點(diǎn)；其他巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，如從血液、腹腔、組織中分離提取獲得的巨噬細(xì)胞在體外培養(yǎng)。這種獲得巨噬細(xì)胞的方法雖簡單方便，得到的巨噬細(xì)胞往往均一性較差，產(chǎn)量低、存活時間短。特別是針對一些較難獲得的珍貴血液或組織標(biāo)本，骨髓來源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種巨曬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法穩(wěn)定性佳，能提高外誘導(dǎo)培養(yǎng)的骨髓來源的巨噬細(xì)胞的純度。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為骨髓來源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，具體為將骨髓來源單個核細(xì)胞懸液在體外用培養(yǎng)基培養(yǎng)，在加入培養(yǎng)基培養(yǎng)前，還包括骨髓來源單個核細(xì)胞懸液的預(yù)處理步驟，具體為將所述骨髓來源單個核細(xì)胞懸液用濾孔為40 75 的濾器過濾，取過濾液進(jìn)行培養(yǎng)。進(jìn)一步，所述培養(yǎng)基為含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基。進(jìn)一步，將所述骨髓來源單個核細(xì)胞懸液用濾孔為40 75 Pm的濾器過濾，將過濾液在1000 1500rmp/min條件下離心不多于10分鐘，去上清液，用含M-CSF的PRMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞制備單個核細(xì)胞懸液。進(jìn)一步，含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基中含M-CSF的濃度為20ng/ml。所述的骨髓來源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法的優(yōu)選方案具體包括以下步驟A骨髓來源的細(xì)胞混合液的制備
用注射器吸取PBS緩沖液插入離體動物股骨兩端的軟骨處沖出股骨內(nèi)的骨髓，收集骨髓來源的細(xì)胞混合液；B單個核細(xì)胞懸液的制備將步驟A所得的收集骨髓來源的細(xì)胞混合液混懸，得骨髓來源的單個核細(xì)胞懸液，用濾孔為70iim的濾器過濾,將過濾液在1500rmp/min條件下離心10分鐘,去上清液，用含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備細(xì)胞重懸液；C第一階段細(xì)胞培養(yǎng)將步驟B所得細(xì)胞重懸液調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)成濃度為1-2X106個/mL，置于培養(yǎng)箱中37°C、5%孵育24 30小時后，吸棄上清，另加入所述含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48小時；D第二階段培養(yǎng) 在第一階段細(xì)胞培養(yǎng)完成后，不超過24小時對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行換液，另培養(yǎng)3-4日，得分化成熟的巨噬細(xì)胞。本發(fā)明的有益效果在于在骨髓來源的細(xì)胞混合液的制備過程中，不破壞股骨，在保持兩端完整的情況下利用壓力將單核細(xì)胞沖出股骨，然而阻止大量紅細(xì)胞和骨髓組織混入單細(xì)胞懸液。直接剪開股骨兩端將骨髓沖出，骨髓組織及凝結(jié)的紅細(xì)胞也都會隨之沖出，去除的股骨也含有大量細(xì)胞，此方法勢必會影響骨髓來源單個核細(xì)胞的分離和數(shù)量。然而，在保持兩端完整的情況下沖洗股骨，大大提高了單核細(xì)胞的純度和數(shù)量，降低紅細(xì)胞的數(shù)量，保證了單個核細(xì)胞懸液的質(zhì)量。提高單核細(xì)胞的純度、降低紅細(xì)胞的數(shù)量會大大利于骨髓來源的巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。在骨髓來源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程中，紅細(xì)胞雖然會逐漸死亡，但是紅細(xì)胞的多少會大大影響巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞的理化環(huán)境進(jìn)而影響骨髓來源的巨噬細(xì)胞的分化成熟過程。從本實(shí)施例中發(fā)現(xiàn)，與剪開股骨兩端的情況相比，在保持兩端完整的情況下分離提取骨髓來源的單個核細(xì)胞后在體外誘導(dǎo)分化的骨髓來源的巨噬細(xì)胞的純度得到了大大提升。從本實(shí)施例中實(shí)際的培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在保持兩端完整的情況下分離提取的骨髓來源的單個核細(xì)胞在第一階段的培養(yǎng)過程中，貼附在細(xì)胞培養(yǎng)板的巨噬細(xì)胞前體細(xì)胞數(shù)目大大增加，分化成熟所需的時間也縮短了。本實(shí)施例中培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分化成熟所需的時間與原來相比縮短了 I 2天。在細(xì)胞懸液的處理中，經(jīng)過濾的細(xì)胞與未過濾的細(xì)胞相比，骨髓來源祖細(xì)胞的純度提高；未過濾的骨髓來源祖細(xì)胞的純度僅約為17%，經(jīng)過濾后，骨髓來源祖細(xì)胞的純度提升到30%-40%。混入組織雜細(xì)胞污染的幾率也大大降低。未進(jìn)行過濾處理的細(xì)胞懸液常常遭遇組織雜細(xì)胞的污染，組織雜細(xì)胞的長勢會蓋過巨噬細(xì)胞，從而使巨噬細(xì)胞不能分化成熟甚至死亡。進(jìn)行過濾處理后的細(xì)胞懸液從未遭遇組織雜細(xì)胞的污染。


圖I為分化前的細(xì)胞照片。圖2為分化成熟的巨噬細(xì)胞照片。圖3為采用一次性細(xì)胞過濾器后得到的單個核細(xì)胞的純度檢測。圖4為未采用一次性細(xì)胞過濾器的單個核細(xì)胞的純度檢測。圖5為分化成熟的骨髓來源的巨噬細(xì)胞純度檢測圖，其中，A為空白對照，B為FITC-F4/80 單標(biāo)，C 為 APC-CDllb 單標(biāo)，D 為 FITC-F4/80、APC-CDllb 雙標(biāo)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件進(jìn)行或配置，未注明來源的產(chǎn)品均可通過市場途徑獲得。PBS緩沖液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05 %吐溫-20的pH7. 4的磷酸鹽緩沖液(簡稱為PBS緩沖液)；配制方法為稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4),磷酸氫二鈉(Na2HPO4* 12H20)，氯化鈉(NaCl)，氯化鉀(KCl)，吐溫-20，加水。PBS緩沖液IL配方pH7. 4 :磷酸二氫鉀(KH2P04)0. 27g，磷酸氫二鈉(Na2HP04) :1.42g，氯化鈉(NaCl) :8g，氯化鉀(KCl) 0. 2g，加去離子水約800mL充分?jǐn)嚢枞芙?，然后加入濃鹽酸調(diào)pH至7. 4，最后定容到1L。高溫高壓滅菌后室溫保存。本實(shí)施例中采用的PBS緩沖液來自Hyclone SH30031. 02AVJ79106。M-CSF(巨曬細(xì)胞集落刺激因子)(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)來自 RD M-CSF Recombinant mouse M-CSF416-ML-010/CF ME1811071。PRMI1640 培養(yǎng)基來自 GIBCOC11875500BT。實(shí)施例I骨髓來源的細(xì)胞混合液的制備取6 8周大小鼠，脫頸致死，浸入體積為70%酒精中。運(yùn)用鑷子夾起腹部上皮，用剪刀在小鼠腹部下方橫著剪開一個小口，分別夾住開口兩端向不同方向分開，暴露出小鼠腿部，用手拔出小鼠股骨和脛骨，使小鼠股骨與小鼠身體及脛骨從關(guān)節(jié)處分離，保持兩端完整。采用酒精浸潤的紗布去除股骨兩端關(guān)節(jié)連接處殘留的組織及軟骨。將取出的股骨在體積濃度為70%酒精中漂洗2 3次，再在PBS緩沖液中漂洗；提前準(zhǔn)備5 IOml的PBS在離心管內(nèi)，用ImL的注射器吸取離心管內(nèi)的PBS緩沖液插入股骨的兩端的軟骨處，迅速沖出骨髓，重復(fù)2 3次，直到股骨變白，得骨髓來源的細(xì)胞混合液。此方法的優(yōu)勢在于不破壞股骨，在保持兩端完整的情況下利用壓力將單核細(xì)胞沖出股骨，然而阻止大量紅細(xì)胞和骨髓組織混入單細(xì)胞懸液。與以往的方法相比，在保持兩端完整的情況下沖洗股骨，大大提高了單核細(xì)胞的純度和數(shù)量，降低紅細(xì)胞的數(shù)量，保證了單個核細(xì)胞懸液的質(zhì)量。提高單核細(xì)胞的純度、降低紅細(xì)胞的數(shù)量會大大利于骨髓來源的巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。在骨髓來源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程中，紅細(xì)胞雖然會逐漸死亡，但是紅細(xì)胞的多少會大大影響巨噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞的理化環(huán)境進(jìn)而影響骨髓來源的巨噬細(xì)胞的分化成熟過程。從本實(shí)施例中發(fā)現(xiàn)，與剪開股骨兩端的情況相比，在保持兩端完整的情況下分離提取骨髓來源的細(xì)胞后在體外誘導(dǎo)分化的骨髓來源的巨噬細(xì)胞的純度得到了大大提升。采用的方法分離提取的骨髓來源的細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化的骨髓來源巨噬細(xì)胞純度達(dá)到了 90-95%以上,分化前的細(xì)胞如圖I所示,分化成熟的細(xì)胞如圖2所示；從圖2中可知，F(xiàn)4/80陽性率為90. 8%，⑶Ilb陽性率為98. 2% ;分化成熟的骨髓來源巨噬細(xì)胞F4/80、CDllb雙陽性率達(dá)到了 90. 6%。本實(shí)施例子中采用的方法分離提取的骨髓來源的細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化的骨髓來源巨噬細(xì)胞純度達(dá)到了 90. 6%以上。與其他方法相比，純度得到了大大提升。其中，圖3,圖4和圖5中涉及純度檢測的試驗(yàn)方法參見www. BioleRend.com Cell Surface Immunofluorescence Staining Protocol。Joachim Weischenfeldt and Bo Porse在實(shí)驗(yàn)方法中釆用剪刀剔除股骨及兩端殘留的組織及軟骨，且用剪刀直接打開股骨的兩端釋放骨髓。這個方法的缺點(diǎn)在于股骨上及兩端殘留的組織不易清除干凈而且在清除時極易損傷股骨導(dǎo)致骨髓污染；用剪刀直接打開股骨兩端不僅大大增加股骨的污染幾率，而且股骨中大塊的骨髓組織也會被沖洗出來，這樣不利于后續(xù)的單個核細(xì)胞懸液的制備。實(shí)施例2細(xì)胞懸液的處理將所述骨髓來源的細(xì)胞混合液輕輕用移液器吹打幾次制備單個核細(xì)胞懸液。吸取細(xì)胞懸液經(jīng)過75 y m濾器(經(jīng)多次試驗(yàn)證明，40 m濾器也可實(shí)現(xiàn))，轉(zhuǎn)入IOml的離心管中，1000 1500rmp/min離心不多于lOmin。去上清，用含有M-CSF (20ng/ml)的PRMI1640完全培養(yǎng)基輕輕吹打重懸細(xì)胞懸液制備單個核細(xì)胞懸液?！癐shii M，Wen HT,Corsa CAS,Liu TJ,Coelho AL, Allen RM, et al. Epigenetic regulation of the alternatively activatedmacrophage phenotype. Blood. 2009 ；114 (15) :3244_54” 一文中米用的骨髓來源的巨卩遼細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法沒有這一步；增加了這一步會大大提高骨髓來源祖細(xì)胞的純度，更、重要的也減少其他雜細(xì)胞污染的機(jī)會；如前面所述的操作步驟中股骨及兩端殘留的組織細(xì)胞的污染。本發(fā)明中采用了一次性的70 的過濾器過濾制備好的單核細(xì)胞懸液，過濾器會過濾掉骨髓組織和混入的大塊組織以及凝集的紅細(xì)胞。經(jīng)過濾的細(xì)胞與未過濾的細(xì)胞相t匕，骨髓來源祖細(xì)胞的純度提高，混入組織雜細(xì)胞污染的幾率也大大降低。實(shí)施例3骨髓來源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)對經(jīng)實(shí)施例2過濾處理后的骨髓來源細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，確定細(xì)胞濃度，稀釋細(xì)胞懸液并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至I 2X IO6個/ml。鋪板，將IX IO6個/ml的細(xì)胞懸液接種到6空培養(yǎng)板中，3ml/每孔。放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37°C、5%孵育30小時后，吸棄上清，并加入新的含M-CSF (20ng/ml)的PRMI1640完全培養(yǎng)基。吸棄上清的步驟非常關(guān)鍵，此步驟的意義在于純化巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞，提高誘導(dǎo)分化的巨噬細(xì)胞的純度。未經(jīng)吸棄上清這個關(guān)鍵步驟而直接將獲得的單個細(xì)胞懸液在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，部分死細(xì)胞或則非巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞沒有得到及時清除會影響最后的骨髓來源的巨噬細(xì)胞的純度，在第一階段培養(yǎng)結(jié)束時，大部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)呈梭形、棒狀，培養(yǎng)過程中細(xì)胞不斷增殖和分化，細(xì)胞數(shù)目不斷增加，細(xì)胞慢慢由梭形向橢圓形轉(zhuǎn)變。這時更換新的M-CSF(20ng/ml)的PRMI 1640完全培養(yǎng)基，從第4天開始，每隔一天替換一次新的M-CSF(20ng/ml)的1640PRMI完全培養(yǎng)基。一定要及時更換培養(yǎng)基，因?yàn)榇藭r細(xì)胞大量增殖、分化，對M-CSF的需求量大。在第七天的時候，細(xì)胞逐漸變大，形態(tài)從梭形變?yōu)闄E圓形，此時，骨髓來源的細(xì)胞已經(jīng)分化成成熟的巨噬細(xì)胞。本實(shí)施例中培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分化成熟所需的時間與原來相比縮短了 I 2天。在細(xì)胞懸液的處理中，經(jīng)過濾的細(xì)胞與未過濾的細(xì)胞相比，骨髓來源祖細(xì)胞的純度提高；未過濾的骨髓來源祖細(xì)胞的純度最低僅約為17% ;如圖4所示，未過濾的骨髓來源祖細(xì)胞的純度最低僅約為19. 8%。經(jīng)過濾后，骨髓來源祖細(xì)胞的純度提升到30% -40% ;如圖3所示骨髓來源祖細(xì)胞的純度提升到33.3%?；烊虢M織雜細(xì)胞污染的幾率也大大降低。未進(jìn)行過濾處理的細(xì)胞懸液常常遭遇組織雜細(xì)胞的污染，組織雜細(xì)胞的長勢會蓋過巨噬細(xì)胞，從而使巨噬細(xì)胞不能分化成熟甚至死亡。進(jìn)行過濾處理后的細(xì)胞懸液從未遭遇組織雜細(xì)胞的污染。最后說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技 術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求
1.骨髓來源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其為將骨髓來源單個核細(xì)胞懸液在體外用培養(yǎng)基培養(yǎng)，其特征在于在加入培養(yǎng)基培養(yǎng)前，還包括骨髓來源單個核細(xì)胞懸液的預(yù)處理步驟，具體為將所述骨髓來源單個核細(xì)胞懸液用濾孔為40 75 μ m的濾器過濾，取過濾液進(jìn)行培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的骨髓來源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的骨髓來源的巨噬 細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于將所述骨髓來源單個核細(xì)胞懸液用濾孔為40 75 μ m的濾器過濾,將過濾液在1000 1500rmp/min條件下離心不多于10分鐘，去上清液，用含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞制備單個核細(xì)胞懸液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的骨髓來源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于，含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基中含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的濃度為20ng/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的骨髓來源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，具體包括以下步驟 A骨髓來源的細(xì)胞混合液的制備 用注射器吸取PBS緩沖液插入離體動物股骨兩端的軟骨處沖出股骨內(nèi)的骨髓，收集骨髓來源的細(xì)胞混合液； B單個核細(xì)胞懸液的制備 將步驟A所得的收集骨髓來源的細(xì)胞混合液混懸，得骨髓來源的單個核細(xì)胞懸液，用濾孔為40 70 μ m的濾器過濾，將過濾液在1000 1500rmp/min條件下離心5 10分鐘，去上清液，用含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備細(xì)胞重懸液； C第一階段細(xì)胞培養(yǎng) 將步驟B所得細(xì)胞重懸液調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)成濃度為1-2X IO6個/mL，置于培養(yǎng)箱中37°C、5%孵育24 30小時后，吸棄上清，另加入所述含巨噬細(xì)胞集落刺激因子的PRMI1640完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48小時； D第二階段培養(yǎng) 在第一階段細(xì)胞培養(yǎng)完成后，不超過24小時對培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行換液，另培養(yǎng)3 4日，得分化成熟的巨噬細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及細(xì)胞的培養(yǎng)方法，骨髓來源的巨噬細(xì)胞的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，具體為將骨髓來源單細(xì)胞懸液在體外用含M-CSF的PRMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，在加入培養(yǎng)基培養(yǎng)前，還包括骨髓來源單細(xì)胞懸液的預(yù)處理步驟，具體為將所述骨髓來源單細(xì)胞懸液用濾孔為40～75μm的濾器過濾，取過濾液進(jìn)行培養(yǎng)；本實(shí)施例中培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分化成熟所需的時間與原來相比縮短了1～2天；在細(xì)胞懸液的處理中，經(jīng)過濾的細(xì)胞與未過濾的細(xì)胞相比，骨髓來源祖細(xì)胞的純度提高；未過濾的骨髓來源祖細(xì)胞的純度僅約為17％～20％，經(jīng)過濾后，骨髓來源祖細(xì)胞的純度提升到30％-40％。
文檔編號C12N5/0786GK102732482SQ20121014811
公開日2012年10月17日 申請日期2012年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月14日
發(fā)明者吳玉章, 姜曼, 張志仁, 楊曉風(fēng), 楊琴 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)