專利名稱：一種重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-i的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組蛋白的制備工藝，特別是利用基因重組技術(shù)制備重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的制備方法。
背景技術(shù)：
上世紀(jì)五十年代，Salmon和Daughaday發(fā)現(xiàn)有這么一類生物活性物質(zhì)，它能促進(jìn)軟骨對(duì)硫的吸收，從而促進(jìn)人體骨骼的生長(zhǎng)，當(dāng)時(shí)他們將之命名為“硫化因子”(Sulphate
Factor SF)。后來(lái)經(jīng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該因子具有與胰島素相類似的功能，如降血糖、降血脂的作用，所以又被冠名為“胰島素樣生長(zhǎng)因子”(Insulin-like Growth Factors, IGFs),該稱謂就延用至今(Macauley VM, Annu Rev Physiol 1993:55:131-153)。已知胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGFs)是由兩類物質(zhì)組成，即IGF-I和IGF-II (Klapper,et al.,(1983)Endocrinol 112 2215and Rinderknecht,et al.,(1978)Febs. Lett. 89:283)。在人體內(nèi)，IGF-I是主要部分，能分泌IGF-I的人體細(xì)胞有肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、脾細(xì)胞等多達(dá)十幾種。而IGF-II更多的是參與胚胎的發(fā)育，在人體內(nèi)的重要性及功能的廣泛性不及IGF-I。胰島素樣生長(zhǎng)因子-I (IGF-I)基因位于12號(hào)染色體，編碼分子量為7648的70個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，含三個(gè)二硫鍵。它的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)與胰島素有相似之處。有關(guān)研究證明IGF-I介導(dǎo)生長(zhǎng)激素的作用而促進(jìn)生物的生長(zhǎng)，因此像骨骼生長(zhǎng)、細(xì)胞復(fù)制和另外一些與生長(zhǎng)相關(guān)的過(guò)程均受IGF-I水平的影響(Timsit J. et al, J. Clin.Endocrinol. Metab, 192 ；75 :183_188)。現(xiàn)已證明IGF-I在人體內(nèi)有極其重要并且豐富的生物學(xué)功能，如促生長(zhǎng)、促分化、參與糖代謝、蛋白質(zhì)代謝和脂肪代謝等，與生長(zhǎng)荷爾蒙的作用相類似，都是起非常作用的生長(zhǎng)因子。胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的生理濃度受甲狀腺疾病、糖尿病和營(yíng)養(yǎng)不良的影響(Hormet al. , Blood 1983 ;4 :108)胰島素樣生長(zhǎng)因子-I與另外一些生長(zhǎng)因子有協(xié)同作用，如它可以促進(jìn)軟組織和間葉組織損傷的修復(fù)(Suh DY, et al. , Endocrinology 1992:131:2399-2403)，它可以促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)等(Burleigh et al.American Biotech Lab 1986 ;4 :48)。近年來(lái)胰島素樣生長(zhǎng)因子-I在國(guó)外主要用于ALS(肌營(yíng)養(yǎng)不良性脊髓側(cè)索硬化癥)、周圍神經(jīng)疾病、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病和脊髓灰質(zhì)炎后綜合癥。C印halon公司的基因工程產(chǎn)品重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I已獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)，投入市場(chǎng)，用于治療原發(fā)性IGF-I缺陷引起的侏儒癥。另有Pharmcia用之于生長(zhǎng)激素受體缺乏癥(GHRD)的治療和生長(zhǎng)遲緩抗體陽(yáng)性GH缺乏癥LA的治療也已進(jìn)入三期臨床工作。此外Genentech公司用于糖尿病的治療和Chiron公司用于腎衰的治療也都進(jìn)入了二期臨床實(shí)驗(yàn)階段。美國(guó)兒科學(xué)院和美國(guó)臨床內(nèi)分泌學(xué)院將在人群平均高度以下大于兩倍標(biāo)準(zhǔn)差的高度定義為身材矮小癥。身材矮小癥患兒身高在類似年齡和性別的兒童的97. 5%以下，一般男孩和女孩的最終成年高度不超過(guò)約5’4”和4’ 11”。根據(jù)兒科內(nèi)分泌學(xué)家的評(píng)估，估計(jì)美國(guó)有380,000兒童患有身材矮小癥。身材矮小癥更通常與低水平IGF-I有關(guān)而不是與GH低分泌相關(guān)。此外，身材矮小癥與低水平IGF-I的相關(guān)性比與低水平GHBP (生長(zhǎng)激素結(jié)合蛋白)的相關(guān)性更好。正如醫(yī)生用標(biāo)準(zhǔn)差評(píng)分(SDS)表征身高，IGF-I標(biāo)準(zhǔn)差評(píng)分(IGF-I SDS)說(shuō)明了一個(gè)人的IGF-I水平距離相似年齡和性別的人群的平均水平有多少個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。還有，已發(fā)現(xiàn)，許多患有極嚴(yán)重或嚴(yán)重身材矮小癥(身高-3SDS)的兒童的GH分泌至少是正常值，但非常缺乏IGF，即他們的IGF-I水平是-3SDS評(píng)分或更低。這些患者的特征是患有嚴(yán)重的原發(fā)性胰島素樣生長(zhǎng)因子-I缺陷(IGFD)。臨床研究表明，給予原發(fā)性胰島素樣生長(zhǎng)因子-I缺陷(IGFD)患者IGF-I治療，能顯著改善這類患者的身高。鑒于科胰島素樣生長(zhǎng)因子-I (IGF-I)在臨床和科學(xué)研究上的應(yīng)甩，以及天然產(chǎn)品在分離純化技術(shù)上的難度，應(yīng)用重組DNA技術(shù)即基因工程的方法制備胰島素樣生長(zhǎng)因子-I (IGF-I)有著重要的意義。目前胰島素樣生長(zhǎng)因子-I(IGF-I)的生產(chǎn)方法為酵母細(xì)胞生產(chǎn)，或者大腸桿菌表達(dá)后用羥胺裂解。酵母細(xì)胞生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，產(chǎn)量也不高，且在發(fā)酵過(guò)程中有降解產(chǎn)物出現(xiàn)；而羥胺化學(xué)裂解法有一定危險(xiǎn)性，特異性也不高，容易產(chǎn)生副產(chǎn)物，且不易放大。本發(fā)明提供的生產(chǎn)工藝安全，簡(jiǎn)單，特異性高，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種安全簡(jiǎn)單，成本低，有利于大規(guī)模生產(chǎn)的利用基因重組技術(shù)制備重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I (IGF-I)的方法。本發(fā)明提供的重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的制備方法包括下列步驟I)將5’端引入煙草蝕紋病毒蛋白酶識(shí)別序列編碼基因的胰島素樣生長(zhǎng)因子-I編碼基因克隆入原核表達(dá)載體，構(gòu)建成重組原核表達(dá)載體；2)將步驟I構(gòu)建的重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入合適的原核宿主細(xì)胞；3)培養(yǎng)步驟2的原核宿主細(xì)胞，使其表達(dá)可溶性含胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的融合蛋白；4)分離出含胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的融合蛋白，用煙草蝕紋病毒蛋白酶酶解后，再分離獲得重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I。步驟I所述煙草蝕紋病毒蛋白酶識(shí)別序列的氨基酸序列為ENLYFQG. (SEQ ID NO: I)其編碼基因的核苷酸序列為gaa aac ctg tat ttt cag GGC (SEQ ID NO:2)步驟I所述胰島素樣生長(zhǎng)因子-I編碼基因經(jīng)優(yōu)化，其核苷酸序列為5’ GGC CCA GAA ACC CTG TGT GGT GCT GAA CTG GTA GAT GCT CTG CAG TTC GTGTGCGGT GAC CGT GGC TTC TAC TTT AAC AAG CCG ACT GGT TAC GGT TCT TCT TCC CGC CGTGCCCCG CAG ACC GGC ATC GTT GAT GAA TGC TGC TTC CGT AGC TGC GAC CTG CGC CGT CTGGAGATG TAT TGT GCG CCG CTG AAA CCG GCG AAA TCT GCA TAA 3’ (SEQ ID NO:3)步驟I所述5’端引入煙草蝕紋病毒蛋白酶識(shí)別序列編碼基因的重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I編碼基因的核苷酸序列為
gaa aac ctg tat ttt cag GGC CCA GM ACC CTG TGT GGT GCT GM CTG GTA GATGCTCTG CAG TTC GTG TGC GGT GAC CGT GGC TTC TAC TTT AAC AAG CCG ACT GGT TAC GGTTCTTCT TCC CGC CGT GCC CCG CAG ACC GGC ATC GTT GAT GAA TGC TGC TTC CGT AGC TGCGACCTG CGC CGT CTG GAG ATG TAT TGT GCG CCG CTG AAA CCG GCG AAA TCT GCA TAA 3’(SEQ ID N0:4)很顯然，步驟I克隆時(shí)應(yīng)保證讀框正確。較佳的，步驟I所述原核表達(dá)載體為含有強(qiáng)啟動(dòng)子T7啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體。最佳的，所述原核表達(dá)載體選用pET32a(+)。該表達(dá)載體含有強(qiáng)啟動(dòng)子T7啟動(dòng)子，可利用IPTG誘導(dǎo)T7聚合酶，顯著提高目的基因的表達(dá)水平，且該質(zhì)粒含有His-tag和
S-Tag序列，便于表達(dá)蛋白的鑒定和純化當(dāng)原核表達(dá)載體。選用PET32a(+)時(shí)，可將所述5’端引入煙草蝕紋病毒蛋白酶識(shí)別序列編碼基因的重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I編碼基因克隆入pET32a(+)的Kpn I與Hind III酶切之間，以與硫氧還蛋白融合表達(dá)。當(dāng)選用的原核表達(dá)載體為pET32a(+)時(shí),步驟3表達(dá)的融合蛋白為硫氧還蛋白與胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的融合蛋白。較佳的，步驟2所述原核宿主細(xì)胞為大腸桿菌。較佳的，為大腸桿菌BL21(DE3)。表達(dá)菌株BL21 (DE3)能高效表達(dá)控制于T7啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)的外源基因，它不表達(dá)ompT和Ion (I)蛋白酶，因此表達(dá)產(chǎn)物比較穩(wěn)定，不會(huì)被菌株內(nèi)源性的蛋白酶所降解。步驟4后，還可采用常規(guī)方法經(jīng)透析、濃縮、病毒滅活及灌裝或凍干等步序后制成濃縮液或粉劑 步驟4具體可包括下列步驟a :離心分離發(fā)酵液中的菌體，重懸后破菌并離心取上清液；b :上清液采用親和層析法初步分離含胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的融合蛋白；c :用煙草蝕紋病毒蛋白酶酶切經(jīng)步驟a分離的融合蛋白獲得酶解夜。d:采用親和柱串連反相柱的層析法純化酶解液，分離得到重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I。e :離子交換法進(jìn)一步純化重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I及去除有機(jī)試劑。步驟a中，離心分離發(fā)酵液中的菌體后，可采用pH7. O 8. O的l(T20mM磷酸鹽緩沖液重懸菌體。具體的，步驟b為先用平衡液平衡親和層析柱；在上清液中加入咪唑及NaCI，使溶液中咪唑終濃度為l(T20mM，NaCl終濃度為400-600mM，然后上親和層析柱；用平衡液清洗親和柱后，再用洗脫液洗脫目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。步驟b中所述平衡液為含10 20禮咪唑及400_600mM NaCl的ρΗ7· O 8. O的l(T20mM磷酸鹽緩沖液，所述洗脫液為含200 250禮咪唑，400-600mM NaCl的pH7. O 8. O的l(T20mM磷酸鹽緩沖液。步驟b中，所述平衡液、上清液及洗脫液中的NaCl濃度相同，磷酸鹽緩沖液的pH值及濃度保持一致。步驟b的親和層析法可采用Chelating Sepharose F. F.層析柱。具體的，步驟c為將步驟b收集的活性蛋白峰流出液稀釋5 10倍，煙草蝕紋病毒蛋白酶于4 8°C酶切16 20小時(shí)。所述煙草蝕紋病毒蛋白酶與融合蛋白的重量比為1/2000 1/500。融合蛋白的重量可通過(guò)采用考馬氏亮藍(lán)染色法(Bradford法)測(cè)定流出液的濃度換算。步驟d采用反相柱串聯(lián)層析柱，目的是將目的蛋白即重組IGF-I穿透Ni2+Chelating Sepharose F. F.親和柱,而使硫氧還蛋白與親和柱結(jié)合,而目的蛋白與反相柱C18結(jié)合，再進(jìn)行洗脫。具體的，步驟d可選自以下任一a)采用親和柱在上反相柱在下的串聯(lián)層析柱，先用平衡液平衡串聯(lián)層析柱，將酶解液上柱；用平衡緩沖液清洗串聯(lián)層析柱后將串聯(lián)的親和柱與反相柱分開，反相柱用洗脫液洗脫得到重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I; b)先用平衡液平衡親和柱，將酶解液上柱后收集流出液；用平衡液平衡反相柱，將流出液上反相柱，用平衡緩沖液清洗反相柱后，用洗脫液洗脫得到重組胰島素樣生長(zhǎng)因子步驟d中所述平衡液為pH7. 5 8. O的10 20mM磷酸鹽緩沖液，所述洗脫液為體積百分比為20 80%乙醇水溶液，或者采用體積百分比為20 80%異丙醇水溶液線性梯度洗脫。步驟d所述親和柱可采用Ni2+Chelating Sepharose F. F.層析柱、DEAE層析柱或 Q 柱，優(yōu)選 Ni2+Chelating Sepharose F. F.層析柱。步驟d所述反相柱可采用C18反相柱、Source 15RPC反相柱或30RPC反相柱，優(yōu)選C18反相柱。步驟e的目的是進(jìn)一步純化目的多肽及除去有機(jī)試劑乙醇或異丙醇。具體的，步驟e為采用平衡液平衡離子交換柱后，將步驟d獲得的洗脫液上柱，用平衡液清洗后，用洗脫液洗脫得到目的蛋白。步驟e中所述平衡液為pH7. O 8. O的l(T20mM磷酸鹽緩沖液，所述洗脫液為含300 500mM NaCl的ρΗ7· O 8. O的10 20禮磷酸鹽緩沖液。步驟e中的離子交換柱可采用CM Sepharose F. F離子交換柱或SP Sepharose F F.離子交換柱。采用本發(fā)明優(yōu)化后的基因以及獨(dú)特的純化方法純化后，融合蛋白的表達(dá)量相比沒有優(yōu)化的天然基因，表達(dá)水平提高了 2-3倍；目的蛋白的純度可達(dá)98%以上，得率達(dá)到50mg/L發(fā)酵液，比傳統(tǒng)的10-20mg/L有了大幅度的提高。本發(fā)明制備IGF-I的方法與現(xiàn)有化學(xué)裂解法或酵母系統(tǒng)生產(chǎn)相比，成本低，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。


圖I為pET_32a(+)載體物理圖譜；圖2 為 pET32a (+) Polylinker 區(qū)順序；圖3為融合蛋白在轉(zhuǎn)化體E. coli內(nèi)表達(dá)的SDS-PAGE電泳分析；左起第I泳道標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker左起第2泳道誘導(dǎo)前
左起第3泳道密碼子優(yōu)化過(guò)的序列表達(dá)左起第4泳道密碼子未優(yōu)化的序列表達(dá)圖4為融合蛋白在轉(zhuǎn)化體E. coli內(nèi)表達(dá)的SDS-PAGE電泳分析；M :標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量；I :誘導(dǎo)前；
2 :誘導(dǎo)4小時(shí)；圖5為30升發(fā)酵罐發(fā)酵融合蛋白在轉(zhuǎn)化體內(nèi)表達(dá)的SDS-PAGE電泳分析；M :標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量；I :誘導(dǎo)前；2:誘導(dǎo)4小時(shí);圖6為融合蛋白經(jīng)煙草蝕紋病毒蛋白酶(TEV)酶切后的SDS-PAGE電泳分析；M :標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量；I :融合蛋白；2 :煙草蝕紋病毒蛋白酶酶切16小時(shí)；圖7為純化后的重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I (IGF-I)蛋白的SDS-PAGE電泳分析；M :標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量；I :純化后樣品IOug (氧化)；2 :純化后樣品IOug (還原)；圖8為純化后的重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I (IGF-I)蛋白的HPLC的檢測(cè)結(jié)果。注標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量(從上至下)97Κ, 66Κ, 45Κ, 30Κ, 20Κ, 14. 4Κ
具體實(shí)施例方式本發(fā)明利用基因重組技術(shù)制備重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I，先人工合成全序列胰島素樣生長(zhǎng)因子-I (IGF-I)基因，在其5’端引入煙草蝕紋病毒蛋白酶識(shí)別序列的編碼基因，并進(jìn)一步在其兩端引入酶切位點(diǎn)，雙酶切后，克隆入經(jīng)雙酶切的表達(dá)載體構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒。重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主大腸桿菌構(gòu)成原核表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)而在表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)融合蛋白，融合蛋白用煙草蝕紋病毒蛋白酶酶切后純化獲得終產(chǎn)物。本發(fā)明在胰島素樣生長(zhǎng)因子-I (IGF-I)基因序列中引入Kpn I.Hind III酶切位點(diǎn)和腸激酶或煙草蝕紋病毒蛋白酶識(shí)別序列。與重組體質(zhì)粒pET32a(+)載體上的Kpn I、HindIII酶切位點(diǎn)一致。重組體所用質(zhì)粒為pET32a(+)，表達(dá)菌株為BL21(DE3)購(gòu)自Novagen公司，宿主菌株為DH5a購(gòu)自Promega公司。pET32a(+)全長(zhǎng)5900bp,用于在大腸桿菌中克隆外源基因并與硫氧還蛋白(Thioredoxin,簡(jiǎn)稱Trx)以融合蛋白形式表達(dá)。本發(fā)明所述煙草蝕紋病毒蛋白酶(TEV Protease)是來(lái)源于煙草蝕紋病毒(TEV)的Nla蛋白酶或者其改進(jìn)酶。TEV蛋白酶具有很強(qiáng)的位點(diǎn)特異性，能夠識(shí)別EXXYXQ(G/S)的七氨基酸序列，本發(fā)明選用的識(shí)別序列為ENLYFQG，其切割位點(diǎn)在谷氨酰胺和甘氨酸或絲氨酸之間。在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式
之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見 Sambrook 等 MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Second edition, ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition,2001 ;Ausubel 等，CURRENTPROTO⑶LSIN MOLECULAR BIOLOGY, John ffiley&Sons, New York,1987and periodicupdates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY, Academic Press, San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition,Academic Press, San Diego,1998 ；METHODS IN ENZYM0L0GY, Vol. 304, Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. ffolffe, eds.)，Academic Press, San Diego, 1999 JPMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, Chromatin Protocols (P. B. Becker, ed. ) Humana Press, Totowa, 1999 等。實(shí)施例II.序列的合成全序列由上海生工生物工程公司合成，并在序列中引入Kpn I.Hind III酶切位點(diǎn)和腸激酶或煙草蝕紋病毒蛋白酶識(shí)別序列。序列如下核苷酸序列為SEQ ID NO:5 GAT CTG GGT ACC GAA AAC CTG TAT TTT CAG GGCCCA GAA ACC CTG TGT GGT GCT GM CTGGTA GAT GCT CTG CAG TTC GTG TGC GGT GAC CGTGGC TTC TAC TTT AAC AAG CCG ACT GGTTAC GGT TCT TCT TCC CGC CGT GCC CCG CAG ACCGGC ATC GTT GAT GAA TGC TGC TTC CGTAGC TGC GAC CTG CGC CGT CTG GAG ATG TAT TGTGCG CCG CTG AAA CCG GCG AAA TCT GCATAA AAG CTT GCG G其中堿基第7-12位為Kpn I酶切識(shí)別位點(diǎn)；堿基第13-33位為煙草蝕紋病毒蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)編碼基因?qū)?yīng)的核苷酸序列；堿基第31-243位為IGF-I編碼基因；堿基第244-249位為HindIII酶切識(shí)別位點(diǎn)。2.融合表達(dá)載體pET32a(+)-IGF-I的構(gòu)建將人工合成的重組IGF-I基因序列以及天然的IGF-I基因序列經(jīng)Kpn I/HindIII雙酶切后克隆于經(jīng)Kpn Ι/HindIII雙酶切的pET32a(+)中，T4DNA連接酶(Promega公司)，2 16°C，I 30小時(shí)，然后CaClJi(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，科學(xué)出版社)轉(zhuǎn)化DH5a菌，Amp抗性篩選陽(yáng)性克隆，再經(jīng)Kpn I和HindIII雙酶切鑒定得到重組質(zhì)粒pET32a(+)-IGF-I，結(jié)果表明已獲得正確插入重組IGF-I基因融合表達(dá)載體。以T7terminator primer為引物，以pET32a(+)-IGF-I為模板,對(duì)該重組質(zhì)粒中的重組IGF-I基因進(jìn)行序列分析，重組質(zhì)粒用T7terminator引物測(cè)序得到序列結(jié)果為SEQ IDN0:6。結(jié)果表明以此DNA序列推導(dǎo)的重組IGF-I的氨基酸序列與文獻(xiàn)報(bào)道及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)完全一致。3. pET32a (+) -IGF-I/BL21 (DE3)表達(dá)系統(tǒng)的建立將重組質(zhì)粒pET32a(+)-IGF-I以CaCl2法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，科學(xué)出版社)轉(zhuǎn)化受體菌BL21 (DE3)，篩選陽(yáng)性克隆。選擇表達(dá)相對(duì)最高的一株作為重組IGF-I融合表達(dá)工程菌(pET32a (+) -IGF-I/BL21 (DE3))。同樣方法，利用文獻(xiàn)報(bào)道天然IGF-I密碼子構(gòu)建IGF-I密碼子未優(yōu)化的重組IGF-I融合表達(dá)工程菌。4.外源基因在轉(zhuǎn)化體中的表達(dá)及SDS-PAGE電泳分析將經(jīng)篩選的重組IGF-I工程菌劃線在含lOOul/ml氨芐青酶素的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)16小時(shí)。挑選生長(zhǎng)良好的單菌落，接種于LB培養(yǎng)液(含Amp 100ug/ml), 37°C培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜菌以I :50接種于20ml LB培養(yǎng)液中(含Amp 100ug/rnl )，37°C振蕩培養(yǎng)。當(dāng)0D600達(dá)O. 6-0. 8時(shí)，加IPTG至終濃度O. 5mM，誘導(dǎo)4小時(shí)。菌液經(jīng)5000rpm, 5min離心，去培養(yǎng)基上清，沉淀菌體加入上樣緩沖液，100°C水浴3min，離心后上SDS-PAGE電泳(積層膠 5%,分離膠15% )，染色，脫色，掃描分析。因Trx-IGF-I融合基因長(zhǎng)687bp，融合蛋白含230個(gè)氨基酸，理論分子量約為24. 9KD。SDS-PAGE結(jié)果表明在22KD和30KD之間有明顯表達(dá)條帶，與預(yù)期相符，融合蛋白占菌體總蛋白的30%左右。見圖3、4。相比密碼子未優(yōu)化的重組IGF-I融合表達(dá)工程菌，經(jīng)密碼子優(yōu)化的重組IGF-I融合表達(dá)工程菌的表達(dá)量提高了 2-3倍。發(fā)酵工藝種子活化自保存的經(jīng)密碼子優(yōu)化的重組IGF-I融合表達(dá)工程菌斜面上取一環(huán)菌種接入30ml LB培養(yǎng)液中(含100ug/ml氨芐青酶素)，37°C，200rpm搖瓶培養(yǎng)15小時(shí)。種子液制備取活化種子，按10%接種量接于2000ml M9+LB培養(yǎng)液中(含IOOug/ml氨芐青酶素)，37°C，250rpm搖瓶培養(yǎng)6小時(shí)。30升發(fā)酵罐發(fā)酵將種子液按6%接種量加入裝有M9+LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，37°C，控制PH值在7. O左右，由通氣及攪拌速度控制溶氧在30%以上。0D600為20 30時(shí)，加入IPTG至終濃度為O. 5rnM，誘導(dǎo)4. O小時(shí)收菌。SDS-PAGE測(cè)蛋白表達(dá)量。積層膠5%，分離膠15%，目的蛋白分子量約為24. 9KD,約占菌體總蛋白的30%左右。每升發(fā)酵液可獲目標(biāo)蛋白約50mg,見圖5。5.蛋白純化工藝菌體處理將發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體4°C，9000rpm離心25分鐘，棄上清液。用10倍菌體重量的磷酸鹽緩沖液(PH7. O的IOmM的磷酸鹽緩沖液)懸浮菌體，然后APV-1000勻漿機(jī)(Invensys公司)循環(huán)破菌3次。4°C,9000rpm離心30分鐘,取上清液,于4°C靜止3小時(shí)后，再4°C，9000rpm離心30分鐘，取上清液。四步法純化IGF-I重組蛋白本純化步驟所用設(shè)備為通用電氣公司(GE)AKTAPurifier 100或者AKTA Primer，所有填料均為該公司產(chǎn)品。第一步ChelatingSepharose F. F.親和層析法先用含 IOmM磷酸鹽(ρΗ7· 0)10mM咪唑600mM NaCl的緩沖液平衡親和柱，菌體處理后得到上清液中加入IM咪唑及NaCI固體使溶液中含有IOmM咪唑，600mMNaCl，然后上柱，流速為10mL/min(柱床體積200mL)，用4 5柱床體積的平衡液清洗親和柱，再用IOmM磷酸鹽緩沖液(pH7. 0)，200mM咪唑，600mM NaCl,洗脫目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。第二步酶解融合蛋白將第一步所收集活性蛋白峰流出液用考馬氏亮藍(lán)染色法(Bradford法)測(cè)定濃度后稀釋5倍,用1/1000 (w/w,煙草蝕紋病毒蛋白酶/融合蛋白)煙草蝕紋病毒蛋白酶于4 8°C酶切16 20小時(shí)。
第三步Chelating Sepharose F. F.與C18反相柱串連層析法本實(shí)驗(yàn)步驟目的是將目的蛋白即重組IGF-I穿透Ni 2+Chelating Sepharose F. F.親和柱,而使硫氧還蛋白與親和柱結(jié)合，目的蛋白與C18反相柱結(jié)合,再進(jìn)行洗脫。方法為將Ni 2+ChelatingSepharoseF. F.與C18反相柱串連好后用IOmM磷酸鹽緩沖液(pH7. 5)平衡，將上一步得到的酶解液上柱,流速為10mL/min，用平衡緩沖液清洗后將兩個(gè)柱子分開，將C18反相柱.柱用20 80%乙醇或異丙醇線性梯度洗脫得到目的蛋白?；蛘逳i 2+Chelating Sepharose F. F.和C18反相柱不串聯(lián)而分別進(jìn)行純化,或采用DEAE或Q柱代替Ni2+Chelating Sepharose F.F.進(jìn)行純化。反相柱也可以為Source 15RPC或30RPC。第四步CM Sepharose F. F離子交換法本步驟的目的是進(jìn)一步純化目的多肽及除去有機(jī)試劑乙醇或異丙醇。IOmM磷酸鹽緩沖液(pH7. O)平衡柱后上柱，流速為10mL/min(柱床體積200mL)，清洗后以含300m mM NaCl的IOmM pH7. O的磷酸鹽緩沖液洗脫，得到目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳和HPLC檢測(cè)純度達(dá)98%以上。見圖7，圖8。步驟4中離子交換法采用的填料也可以為SP Sepharose F. F.。實(shí)施例2
采用實(shí)施例I構(gòu)建的經(jīng)密碼子優(yōu)化的重組IGF-I工程菌，采用實(shí)施例I的方法發(fā)酵獲得發(fā)酵液。菌體處理將發(fā)酵液4°C，9000rpm離心25分鐘，棄上清液。用10倍菌體重量的磷酸鹽緩沖液(PH8. O的15mM的磷酸鹽緩沖液)懸浮菌體，破菌3次。4°C，9000rpm離心30分鐘，取上清液，于4°C靜止3小時(shí)后，再4°C，9000rpm離心30分鐘，取上清液。四步法純化IGF-I重組蛋白第一步ChelatingSepharose F. F.親和層析法先用含 15mM憐酸鹽(ρΗ8· 0)20mM咪唑500mM NaCl的緩沖液平衡親和柱，菌體處理后得到上清液中加入IM咪唑及NaCI固體使溶液中含有20mM咪唑，500mM NaCl，然后上柱，流速為10mL/min(柱床體積200mL)，用4 5柱床體積的平衡液清洗親和柱，再用15mM磷酸鹽緩沖液(pH8. 0),250mM咪唑，500mMNaCl，洗脫目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。第二步酶解融合蛋白將第一步所收集活性蛋白峰流出液用考馬氏亮藍(lán)染色法(Bradford法)測(cè)定濃度后稀釋5倍,用1/2000 (w/w,煙草蝕紋病毒蛋白酶/融合蛋白)煙草蝕紋病毒蛋白酶于4 8°C酶切16 20小時(shí)。第三步Chelating Sepharose F. F.與C18反相柱串連層析法本實(shí)驗(yàn)步驟目的是將目的蛋白即重組IGF-I穿透Ni2+Chelating Sepharose F. F.親和柱，而使硫氧還蛋白與親和柱結(jié)合，目的蛋白與C18反相柱結(jié)合，再進(jìn)行洗脫。方法為將Ni 2+ChelatingSepharose F. F.與C18反相柱串連好后用15mM磷酸鹽緩沖液(pH8. O)平衡，將上一步得到的酶解液上柱，流速為10mL/min，用平衡緩沖液清洗后將兩個(gè)柱子分開，將C18反相柱.柱用20 80%乙醇或異丙醇線性梯度洗脫得到目的蛋白?；蛘逳i2+Chelating SepharoseF. F.和C18反相柱不串聯(lián)而分別進(jìn)行純化，或采用DEAE或Q柱代替Ni2+ChelatingSepharoseF. F.進(jìn)行純化。反相柱也可以為Source 15RPC或30RPC。第四步SP Sepharose F. F.離子交換法本步驟的目的是進(jìn)一步純化目的多肽及除去有機(jī)試劑乙醇或異丙醇。15mM磷酸鹽緩沖液(pH8.0)平衡柱后上柱，流速為IOmL/min (柱床體積200mL)，清洗后以含400m mM NaCl的15mM pH8. O的磷酸鹽緩沖液洗脫，得到目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳和HPLC檢測(cè)純度達(dá)98%以上。實(shí)施例3采用實(shí)施例I構(gòu)建的經(jīng)密碼子優(yōu)化的重組IGF-I工程菌，采用實(shí)施例I的方法發(fā)酵獲得發(fā)酵液。菌體處理將發(fā)酵液4°C，9000rpm離心25分鐘，棄上清液。用10倍菌體重量的磷酸鹽緩沖液(PH7. 5的20mM的磷酸鹽緩沖液)懸浮菌體，破菌3次。4°C，9000rpm離心30分鐘，取上清液，于4°C靜止3小時(shí)后，再4°C，9000rpm離心30分鐘，取上清液。
四步法純化IGF-I重組蛋白第一步ChelatingSepharose F. F.親和層析法先用含20mM憐酸鹽(ρΗ7· 5)15mM咪唑400mM NaCl的緩沖液平衡親和柱，菌體處理后得到上清液中加入IM咪唑及NaCI固體使溶液中含有15mM咪唑，400mM NaCl，然后上柱，流速為10mL/min(柱床體積200mL)，用4 5柱床體積的平衡液清洗親和柱，再用20mM磷酸鹽緩沖液(pH7. 5),200mM咪唑，400mMNaCl，洗脫目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。第二步酶解融合蛋白將第一步所收集活性蛋白峰流出液用考馬氏亮藍(lán)染色法(Bradford法)測(cè)定濃度后稀釋10倍,用1/500 (w/w,煙草蝕紋病毒蛋白酶/融合蛋白)煙草蝕紋病毒蛋白酶于4 8°C酶切16 20小時(shí)。第三步Chelating Sepharose F. F.與C18反相柱串連層析法本實(shí)驗(yàn)步驟目的是將目的蛋白即重組IGF-I穿透Ni 2+Chelating Sepharose F. F.親和柱，而使硫氧還蛋白與親和柱結(jié)合，目的蛋白與C18反相柱結(jié)合，再進(jìn)行洗脫。方法為將Ni 2+ChelatingS印haroseF.F.與C18反相柱串連好后用20mM磷酸鹽緩沖液(pH7. 5)平衡，將上一步得到的酶解液上柱，流速為10mL/min，用平衡緩沖液清洗后將兩個(gè)柱子分開，將C18反相柱.柱用20 80%乙醇或異丙醇線性梯度洗脫得到目的蛋白?；蛘逳i2+Chelating Sepharose F. F.和C18反相柱不串聯(lián)而分別進(jìn)行純化,或采用DEAE或Q柱代替Ni2+Chelating SepharoseF.F.進(jìn)行純化。反相柱也可以為Source 15RPC或30RPC。第四步SP Sepharose F. F.離子交換法本步驟的目的是進(jìn)一步純化目的多肽及除去有機(jī)試劑乙醇或異丙醇。20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.5)平衡柱后上柱，流速為IOmL/min (柱床體積200mL)，清洗后以含500m mM NaCl的20mM pH7. 5的磷酸鹽緩沖液洗脫，得到目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳和HPLC檢測(cè)純度達(dá)98%以上。
權(quán)利要求
1.一種重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的制備方法包括下列步驟 1)將5’端引入煙草蝕紋病毒蛋白酶識(shí)別序列編碼基因的重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的編碼基因克隆入原核表達(dá)載體，構(gòu)建成重組原核表達(dá)載體； 2)將步驟I構(gòu)建的重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入合適的原核宿主細(xì)胞； 3)培養(yǎng)步驟2的原核宿主細(xì)胞，使其 表達(dá)可溶性含胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的融合蛋白； 4)分離出含胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的融 合蛋白，用煙草蝕紋病毒蛋白酶酶解后，再分離獲得重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I。
2.如權(quán)利要求I所述重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的制備方法，其特征在于步驟I)所述5’端引入煙草蝕紋病毒蛋白酶識(shí)別序列編碼基因的重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO:4。
3.如權(quán)利要求I所述重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的制備方法，其特征在于步驟I)所述原核表達(dá)載體為含有強(qiáng)啟動(dòng)子T7啟動(dòng)子的原核表達(dá)載體，步驟2)所述原核宿主細(xì)胞為大腸桿菌。
4.如權(quán)利要求I所述重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的制備方法，其特征在于步驟4)具體包括下列步驟 a :離心分離發(fā)酵液中的菌體，重懸后破菌并離心取上清液； b :上清液采用親和層析法初步分離含胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的融合蛋白； c :用煙草蝕紋病毒蛋白酶酶切經(jīng)步驟b分離的融合蛋白獲得酶解夜； d :采用親和柱串連反相柱的層析法純化酶解液，分離得到重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I ； e :離子交換法進(jìn)一步純化重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I及去除有機(jī)試劑。
5.如權(quán)利要求4所述重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的制備方法，其特征在于步驟b具體為先用平衡液平衡親和層析柱；在上清液中加入咪唑及NaCI，使溶液中咪唑終濃度為10-20mM, NaCl終濃度為400-600mM，然后上親和層析柱；用平衡液清洗親和柱后，再用洗脫液洗脫目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液；所述平衡液為含10-20mM咪唑及400-600mMNaCl的pH7. O 8. O的10_20mM磷酸鹽緩沖液；所述洗脫液為含200_250mM咪唑，400_600mMNaCl的ρΗ7· O 8. O的10_20mM磷酸鹽緩沖液。
6.如權(quán)利要求4所述重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的制備方法，其特征在于，步驟d可選自以下任一 a)采用親和柱在上反相柱在下的串聯(lián)層析柱，先用平衡液平衡串聯(lián)層析柱，將酶解液上柱；用平衡緩沖液清洗串聯(lián)層析柱后將串聯(lián)的親和柱與反相柱分開，反相柱用洗脫液洗脫得到重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I ; b)先用平衡液平衡親和柱，將酶解液上柱后收集流出液；用平衡液平衡反相柱，將流出液上反相柱，用平衡緩沖液清洗反相柱后，用洗脫液洗脫得到重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I。
7.如權(quán)利要求6所述重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的制備方法，其特征在于，步驟d中所述平衡液為PH7. 5 8. O的10 20mM磷酸鹽緩沖液，所述洗脫采用體積百分比為20 80%乙醇水溶液或者20 80%異丙醇水溶液線性梯度洗脫。
8.如權(quán)利要求4所述重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的制備方法，其特征在于，步驟e具體為采用平衡液平衡離子交換柱后，將步驟d獲得的洗脫液上柱，用平衡液清洗后，用洗脫液洗脫得到目的蛋白。
9.如權(quán)利要求8所述重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的制備方法，其特征在于，步驟e中所述平衡液為PH7. O 8. O的10 20mM磷酸鹽緩沖液，所述洗脫液為含300 500mM NaCl的ρΗ7· O 8. O的10 20mM磷酸鹽緩沖液。
10.如權(quán)利要求4所述重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的制備方法，其特征在于，步驟b的親和層析法采用Chelating Sepharose F. F.層析柱；步驟d所述親和柱采用Ni2+ChelatingSepharose F. F.層 析柱、DEAE層析柱或Q柱；步驟d所述反相柱采用C18反相柱、Source 15RPC反相柱或30RPC反相柱；步驟e中的離子交換柱采用CM Sepharose F. F離子交換柱或SP Sepharose F. F.離子交換柱。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的制備方法，先將5’端引入煙草蝕紋病毒蛋白酶識(shí)別序列編碼基因的胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的編碼基因克隆入原核表達(dá)載體，構(gòu)建成重組原核表達(dá)載體；而后將重組原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入合適的原核宿主細(xì)胞；而后培養(yǎng)原核宿主細(xì)胞，表達(dá)可溶性含胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的融合蛋白；最后分離出含胰島素樣生長(zhǎng)因子-I的融合蛋白，用煙草蝕紋病毒蛋白酶酶解后，再分離獲得重組胰島素樣生長(zhǎng)因子-I。本發(fā)明制備IGF-I的方法與現(xiàn)有化學(xué)裂解法或酵母系統(tǒng)生產(chǎn)相比，表達(dá)量高，成本低，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102732549SQ20121020626
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月20日
發(fā)明者任洪柳, 劉振青, 周項(xiàng), 王惠生, 肖齊世 申請(qǐng)人:上海普欣生物技術(shù)有限公司