本發(fā)明涉及一株具有較高固氮酶活性的耐鹽短桿菌及其在生態(tài)修復(fù)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氮素是植物生長必需的化學(xué)元素，氮肥是農(nóng)業(yè)生態(tài)修復(fù)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最重要的生產(chǎn)資料之一。生產(chǎn)化學(xué)氮肥消耗大量能源，占生產(chǎn)總成本的70％～80％。煤炭、石油、天然氣等化石能源不可再生，依靠化學(xué)氮肥的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)難以持續(xù)發(fā)展?；瘜W(xué)氮肥在提高作物產(chǎn)量、保障我國糧食安全方面發(fā)揮了巨大作用，但是不合理施氮已經(jīng)形成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，造成一系列的嚴(yán)重危害，如太湖藍(lán)藻污染，城市地下水硝酸鹽污染等已經(jīng)對(duì)環(huán)境和飲用水安全造成了威脅。
大氣中含有78％的氮素，但其存在形式是分子態(tài)氮?dú)?，?dòng)植物不能直接利用，自然界只有某些原核微生物具有直接利用大氣中氮?dú)獾哪芰?，將其還原成氨，這就是生物固氮作用。選用高效固氮微生物菌種工廠化生產(chǎn)制成菌劑，或進(jìn)一步與其它富含植物營養(yǎng)的物料復(fù)合加工成生物制品，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，可以提供作物氮素營養(yǎng)，改善作物根際生態(tài)環(huán)境，提高土壤生物肥力性狀，這就是通常所說的固氮微生物菌劑或固氮微生物肥料。生物氮肥具有多種優(yōu)勢(shì)：①生物氮肥由可再生的生化制劑和活體微生物組成，可以再生，不存在資源枯竭問題，是可持續(xù)發(fā)展農(nóng)資產(chǎn)品。②生物氮肥是環(huán)境友好型肥料，其生產(chǎn)和使用過程均不產(chǎn)生三廢等污染性物質(zhì)，而且能改善土壤理化性質(zhì)，提高土壤肥力，是生態(tài)農(nóng)業(yè)農(nóng)資產(chǎn)品。③生物氮肥生產(chǎn)耗能少、成本低，其成本僅為等效化學(xué)氮肥的20％～40％，可以為國家節(jié)省大量的煤炭和石油等能源戰(zhàn)略物資。④使用生物氮肥可以顯著改善農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，提升土壤肥力，使農(nóng)民受益，促進(jìn)社會(huì)和諧發(fā)展。
修路、開礦、干旱、洪澇等對(duì)自然環(huán)境植被和土壤生態(tài)影響巨大，修復(fù)土壤生態(tài)環(huán)境需要新的技術(shù)手段。近年來，微生物技術(shù)在生態(tài)環(huán)境修復(fù)中的作用越來越大。菌種是微生物肥料生產(chǎn)應(yīng)用的基礎(chǔ)。目前，限制我國微生物肥料行業(yè)發(fā)展的瓶頸就是高效菌種的選育問題。生態(tài)修復(fù)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)迫切需要能夠高效固氮、提高土壤生物活性的微生物肥料生產(chǎn)用菌種。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一株具有較高固氮酶活性的細(xì)菌及其在生態(tài)修復(fù)中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的細(xì)菌是耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21，該菌株在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏編號(hào)為CGMCC No.12402，以下簡(jiǎn)稱為耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21。
含有耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21或/和耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21的代謝物的菌劑也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
該菌劑除包含耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21或/和耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21的代謝物外，還可包括輔料，如草炭、動(dòng)物的糞便、各類作物的秸稈、松殼、稻草、花生皮等。所述菌劑還可包括載體。所述載體可為固體載體或液體載體。所述固體載體為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料可為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料可為玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一種；所述高分子化合物可為聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液體載體可為有機(jī)溶劑、植物油、礦物油或水；所述有機(jī)溶劑可為癸烷和/或十二烷。所述菌劑中，耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21或/和耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21的代謝物可以以被培養(yǎng)的活細(xì)胞、活細(xì)胞的發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)物的濾液或細(xì)胞與濾液的混合物的形式存在。所述菌劑的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑或水分散粒劑。
所述菌劑可為下述1)-5)中的任一菌劑：
1)用于固氮的菌劑；
2)產(chǎn)生固氮酶的菌劑；
3)促進(jìn)植物生長的菌劑；
4)改良培肥土壤的菌劑；
5)修復(fù)土壤生態(tài)的菌劑。
上述菌劑的活性成分可為耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21或/和耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21的代謝物，上述菌劑的活性成分還可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌劑的活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)固氮酶活性確定。
耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21的下述P1)-P8)中的任一應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：
P1)在固氮中的應(yīng)用；
P2)在生產(chǎn)固氮酶中的應(yīng)用；
P3)在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用；
P4)在改良培肥土壤中的應(yīng)用；
P5)在修復(fù)土壤中的應(yīng)用；
P6)在蔬菜工廠化育苗中的應(yīng)用；
P7)在制備生物有機(jī)肥中的應(yīng)用；
P8)在制備上述菌劑中的應(yīng)用。
上述菌劑的上述P1)-P7)中的任一應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種含有所述的耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402或所述菌劑的生物有機(jī)肥。
本發(fā)明的又一目的是提供一種培養(yǎng)耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402的方法，包括將耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402在用于培養(yǎng)短桿菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。
本發(fā)明的又一目的是提供一種制備所述菌劑的方法，該方法包括如下步驟：將所述的耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402作為活性成分，得到所述菌劑。
本發(fā)明從農(nóng)田作物根際土壤中分離固氮菌，進(jìn)一步篩選較高固氮酶活性的菌株，最終篩選到高效固氮菌耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402。本發(fā)明的耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402的固氮酶活性極顯著高于微生物肥料常用生產(chǎn)菌種圓褐固氮菌ACCC11103，是微生物肥料常用生產(chǎn)菌種圓褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性的3.7倍，在改良土壤、提高土壤肥力、生荒地生態(tài)修復(fù)、蔬菜工廠化育苗接種劑、固氮微生物菌劑和生物有機(jī)肥生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
保藏說明
菌種名稱：耐鹽短桿菌
拉丁名：(Brevibacterium halotolerans)
菌株編號(hào)：GDSD21
保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心
保藏機(jī)構(gòu)簡(jiǎn)稱：CGMCC
地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)
保藏日期：2016年4月25日
保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)：CGMCC No.12402
具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
下述實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基如下：
固氮菌富集培養(yǎng)液ACCC55：蔗糖10g、K2HPO4·3H2O 0.5g、NaCl 0.2g、CaCO3 1g、MgSO4·7H2O 0.2g、用蒸餾水定容至1000ml、pH 7.0～7.2。
無氮液體培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為蔗糖10g/L，NaCl 0.12g/L，K2HPO4·3H2O 0.5g/L，CaCO3 1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L；溶劑為蒸餾水；pH 7.2。
無氮固體培養(yǎng)基：在無氮液體培養(yǎng)基中加入瓊脂，至瓊脂的含量為15-20g/L。
牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5g、蛋白胨10g、NaCl 5g、瓊脂15-20g，用蒸餾水定容至1000ml，pH7.2。
改良固氮培養(yǎng)基：蔗糖10g、K2HPO4·3H2O 0.5g、NaCl 0.2g、CaCO3 1g、MgSO4·7H2O 0.2g、酵母膏0.5g、蒸餾水1000ml、瓊脂15-20g，pH 7.0～7.2。
改良固氮液體培養(yǎng)基：與改良固氮培養(yǎng)基的區(qū)別僅在于不含瓊脂。
下述實(shí)施例中所用的圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCC11103(參見“孫建光等.高效固氮芽孢桿菌篩選及其生物學(xué)特性.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,42(6):2043-2051”)。公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所獲得該菌株，以重復(fù)本申請(qǐng)的實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例1、耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402的分離與鑒定
一、作物根際固氮菌GDSD21的富集與分離
取10g土樣(采自中國黑龍江省綏化水稻田)放入90mL無菌水中搖床振蕩20min制成混濁液，吸取5mL放入30mL固氮菌富集培養(yǎng)液ACCC55中，100rpm，28℃進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)，72h后換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。重復(fù)培養(yǎng)3次后進(jìn)行固氮菌分離。吸取1mL上述固氮菌富集培養(yǎng)物放到9mL無菌水中制成10-1稀釋度，繼續(xù)稀釋制成10-2、10-3、10-4、10-5稀釋度的菌懸液，每個(gè)稀釋度取0.1mL涂布在無氮固體培養(yǎng)基平板上，29℃靜置培養(yǎng)。2～3d待菌落形成后，在改良固氮培養(yǎng)基平板上用平板劃線法進(jìn)行菌種純化，分離得到作物根際固氮菌GDSD21。
二、作物根際固氮菌GDSD21的鑒定
從以下幾個(gè)方面鑒定步驟一分離純化并篩選得到的作物根際固氮菌GDSD21：
1、形態(tài)學(xué)鑒定
將處于對(duì)數(shù)生長期且菌落大小穩(wěn)定，上述步驟一分離并純化得到的作物根際固氮菌GDSD21進(jìn)行單菌落狀態(tài)觀察，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、濕潤度、菌落表面狀態(tài)(是否平坦、突起、褶皺、凹陷等)、菌落邊緣狀態(tài)(是否整齊、不規(guī)則、放射狀等)。
對(duì)于處于對(duì)數(shù)生長期的所述作物根際固氮菌GDSD21，經(jīng)涂片染色后采用光學(xué)顯微鏡觀察菌體的形態(tài)。
結(jié)果表明，上述步驟一分離并純化得到的作物根際固氮菌GDSD21菌落圓形凸起，乳白色，表面光滑濕潤，邊緣整齊；菌體短桿狀；革蘭氏陽性。
2、生理生化特征分析
參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè).北京:科學(xué)出版社，2011.)和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》(沈萍,范秀容,李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)測(cè)定上述作物根際固氮菌GDSD21的生理生化特征。
作物根際固氮菌GDSD21的生理生化特征測(cè)定結(jié)果如下：
生長溫度：4℃不生長，28℃生長，48℃生長，60℃不生長；
耐鹽性試驗(yàn)：2％NaCl生長，5％NaCl生長，7％NaCl生長，10％NaCl不生長；
利用檸檬酸鹽：陽性；
水解淀粉：陽性；
PH 5.7生長：陽性；
敏感抗生素類型：利福霉素、林肯霉素、萬古霉素；
利用氨基酸類型：L-丙氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酸、L-絲氨酸、L-天冬氨酸；
糖醇發(fā)酵產(chǎn)酸：葡萄糖陽性，甘露醇陽性，乳糖陰性，蔗糖陽性。
3、16s rDNA序列同源性分析
常規(guī)方法培養(yǎng)上述步驟一分離純化得到的作物根際固氮菌GDSD21，提取菌株的總DNA作為基因擴(kuò)增模板，以細(xì)菌16s rDNA通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系采用上海生物工程有限公司PCR擴(kuò)增試劑盒。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性30s、55℃退火1min、72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)。DNA測(cè)序由上海生物工程有限公司完成，序列拼接及相似性分析使用clustalx-MEGA6軟件完成，基因比對(duì)通過美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和EzTaxon在線完成。
PCR基因擴(kuò)增得到作物根際固氮菌GDSD21的16S rDNA基因片段序列如序列表中序列1，與NCBI和EzTaxon數(shù)據(jù)庫中已公開的16S rDNA序列進(jìn)行在線同源性比對(duì)，結(jié)果顯示作物根際固氮菌GDSD21與耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)DSM8802T(AM747812)的同源性最高，達(dá)到99.93％。
4、生長特性分析
進(jìn)行了作物根際固氮菌GDSD21的最適溫度和最適pH生長實(shí)驗(yàn)。采用無氮液體培養(yǎng)基和無氮固體培養(yǎng)基，分別在4℃、28℃、48℃、60℃培養(yǎng)、觀察、記錄菌株的溫度適應(yīng)性，每個(gè)處理3次重復(fù)。調(diào)整pH分別為4、5、6、7、8、9、10，每個(gè)處理3次重復(fù)，培養(yǎng)、觀察、記錄菌株生長的最適pH。
結(jié)果表明，所述作物根際固氮菌GDSD21的最適生長溫度為28℃，最適生長pH為pH7～8。
鑒于上述形態(tài)、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析結(jié)果，將步驟一分離純化得到的作物根際固氮菌GDSD21鑒定為細(xì)菌域原核生物界厚壁菌門芽孢桿菌科(Bacillaceae)短桿菌屬(Brevibacterium)的耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)。該耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21已于2016年4月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào))，保藏編號(hào)為CGMCC No.12402。
實(shí)施例2、耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402固氮酶活性測(cè)定
以微生物肥料常用生產(chǎn)菌種圓褐固氮菌ACCC11103作為對(duì)照組，實(shí)施例1的耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402作為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行固氮酶活性測(cè)定，具體方法如下：在15×150mm螺口玻璃管中加入5mL改良固氮培養(yǎng)基制成斜面，接種菌株，28℃培養(yǎng)。以不接種空白斜面為陰性對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)72h后，換橡膠塞，注入乙炔氣體使終濃度為10％，用醫(yī)用膠布密封，繼續(xù)培養(yǎng)72h，取100μL反應(yīng)氣體，用氣相色譜儀測(cè)定乙烯生成量，根據(jù)以下公式計(jì)算菌株的固氮酶活性。固氮酶活性(nmol/mg·h)＝C2H4nmol/[菌體蛋白量(mg)×反應(yīng)時(shí)間(h)]，其中C2H4nmol＝1000×C2H4體積(μl)×273×P/[22.4×(273+t℃)×760]，其中P為氣壓(mm汞柱)，t為反應(yīng)溫度。
其中，菌體蛋白含量測(cè)定方法如下所述：用5mL生理鹽水將試管斜面上的菌苔洗入離心管中，收集菌體，向菌體中加入3mL 0.5M的NaOH溶液沸水煮沸5min，加入3mL 0.5M的HCl溶液混合，離心后取上清1.0mL，加入5mL考馬斯亮藍(lán)溶液，在漩渦混合器上混合，顯色3min，測(cè)定595nm處的吸光值A(chǔ)595，根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌體蛋白含量。
結(jié)果顯示，耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402的固氮酶活性為98.578±2.317nmol C2H4/h·mg蛋白，微生物肥料常用生產(chǎn)菌種圓褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性26.510±1.442nmol C2H4/h·mg蛋白，統(tǒng)計(jì)分析耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402的固氮酶活性極顯著高于微生物肥料常用生產(chǎn)菌種圓褐固氮菌ACCC11103的固氮酶活性。這一結(jié)果表明，本發(fā)明的耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402具有很高的固氮潛能，在改良土壤、提高土壤肥力、生荒地生態(tài)修復(fù)、蔬菜工廠化育苗接種劑、固氮微生物菌劑和生物有機(jī)肥生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
實(shí)施例3、耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402在生態(tài)修復(fù)中的應(yīng)用
一、土壤生態(tài)修復(fù)菌劑制備
利用實(shí)施例1所得到的耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402制備土壤生態(tài)修復(fù)菌劑，具體方法如下所述：采用上述改良固氮液體培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)室條件下?lián)u床培養(yǎng)耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402。1L三角瓶裝量250mL，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)18h～24h至OD600達(dá)到1.5～1.8，耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402含量達(dá)到15～20億cfu/mL。罐裝，密封，得到土壤生態(tài)修復(fù)菌劑。室溫保存，用于土壤培肥田間試驗(yàn)。
二、生態(tài)修復(fù)現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)
生態(tài)修復(fù)現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)在高速公路G7河北省興和縣施工現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行。由于修建高速公路，農(nóng)田耕層土壤被剝離，高速公路護(hù)坡(坡度約50度)新土層全部為貧瘠的生荒土(有機(jī)質(zhì)(％)0.435±0.2，全氮(％)0.027±0.006，堿解氮(mg/kg)0，全磷(％)0.089±0.006，有效磷(mg/kg)21.3±1.6)。生態(tài)環(huán)境惡化，急需建植恢復(fù)生態(tài)。
生態(tài)修復(fù)采用坡面掛網(wǎng)噴播建植。2014年5月15日進(jìn)行了坡面建植和菌劑施用。播種植物為木本、草本植物混播，包括榆樹、檸條、紫穗槐、刺槐、胡枝子、苜蓿、冰草、披堿草、沙打旺、波斯菊等。試驗(yàn)處理設(shè)：1)不施菌劑(CK0)、2)施用土壤生態(tài)修復(fù)菌劑(T1)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次重復(fù)每個(gè)試驗(yàn)處理面積2000m2。實(shí)驗(yàn)方法如下：
T1：將步驟一的土壤生態(tài)修復(fù)菌劑用無菌水1000倍稀釋后噴施于坡面，用量為每600m2坡面1L。
CK0：與T1的區(qū)別僅在于用等量的無菌水替換步驟一的生態(tài)修復(fù)菌劑。
三、生態(tài)修復(fù)效果檢測(cè)方法
1、土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量測(cè)定
取新鮮土樣10.00g加入到帶玻璃珠的90mL無菌水中，搖床振蕩20min，然后無菌操作制成101～106系列稀釋梯度，取100μL土壤懸液分別接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(細(xì)菌)、馬丁培養(yǎng)基(真菌)和高氏一號(hào)培養(yǎng)基(放線菌)固體平板上，細(xì)菌采用較高的稀釋度，均勻涂布，3次重復(fù)，28℃培養(yǎng)2～5天，觀察計(jì)數(shù)。
2、土壤酶活性測(cè)定
測(cè)定了試驗(yàn)地土壤的蔗糖酶、過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶、纖維素酶和木聚糖酶。具體操作如下：
2.1土壤蔗糖酶活性測(cè)定(比色法)稱5.0g過1mm篩風(fēng)干土樣于50mL三角瓶中，加1mL甲苯，混勻，靜置15min，再加15mL 8％蔗糖溶液和5mL pH 5.5磷酸緩沖液，塞上棉塞，混勻，37℃溫育24h。然后混勻、過濾，吸取1mL濾液于50mL容量瓶中，加入3mL 3,5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴5min，冷水冷卻3min，定容到50mL，混勻，測(cè)定508nm處的吸光度值(x)，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線(y＝(x+0.0171)/16.08)計(jì)算葡萄糖含量。土壤蔗糖酶活性定義為：37℃、pH 5.5條件下5g風(fēng)干土壤24h水解蔗糖生成葡萄糖的毫克(mg)數(shù)。
2.2土壤過氧化氫酶活性測(cè)定(容量法)稱2.0g過1mm篩風(fēng)干土樣于150mL三角瓶中，加40mL蒸餾水、20mL 0.3％過氧化氫溶液，120r/min振蕩30min，立即準(zhǔn)確加入20mL 1.5mol/L硫酸溶液，充分混合過濾。取20mL濾液置于100mL三角瓶中，用0.1mol/L高錳酸鉀溶液滴定至微紅色，且30sec不褪色，記錄消耗體積。按照高錳酸鉀溶液的標(biāo)定值計(jì)算出高錳酸鉀溶液的消耗量。土壤過氧化氫酶活性定義為：2g風(fēng)干土壤30min分解過氧化氫的數(shù)量折和氧化分解等量過氧化氫所需0.1mol/L高錳酸鉀的毫升(mL)數(shù)。
2.3土壤脲酶活性測(cè)定(靛酚藍(lán)比色法)
試劑的配制：10％尿素溶液：稱取10g尿素，用水溶至100ml。
檸檬酸鹽緩沖液(PH6.7)：184g檸檬酸和147.5g氫氧化鉀(KOH)溶于蒸餾水。將兩溶液合并，用1mol/L NaOH將pH調(diào)至6.7，用水稀釋定容至1000ml。
苯酚鈉溶液(1.35mol/L)：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀釋至100ml(A液)，存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水(B液)。將A、B溶液保存在冰箱中。使用前將A液、B液各20ml混合，用蒸餾水稀釋至100ml。
次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑，至活性氯的濃度為0.9％，溶液穩(wěn)定。
氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.4717g硫酸銨溶于水并稀釋至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液；再將此液稀釋10倍(吸取10ml標(biāo)準(zhǔn)液定容至100ml)制成氮的工作液(0.01mg/ml)。
操作步驟：
稱10.0g過1mm篩風(fēng)干土樣于150mL三角瓶中，加2mL甲苯，混勻，靜置15min，加入10mL 10％尿素溶液和20mL pH6.7檸檬酸鹽緩沖液，混勻，37℃溫育3h，然后混勻、過濾，用38℃蒸餾水定容至100mL。取1mL濾液于50mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至20mL，加入4mL苯酚鈉溶液混勻，立即加入3mL次氯酸鈉溶液混勻，20min后定容至50mL，溶液呈現(xiàn)藍(lán)色，測(cè)定578nm處吸光度，按照預(yù)先測(cè)定的硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)曲線(y＝(x+0.0006)/241.14)計(jì)算出氨氮含量。土壤脲酶活性定義為：37℃、pH6.7條件下10g風(fēng)干土壤3h分解尿素釋放NH3－N的毫克(mg)數(shù)。
2.4土壤磷酸酶活性測(cè)定(磷酸苯二鈉比色法)
試劑的配制：
Gibbs試劑：將200mg 2，6-雙溴苯醌氯酰亞胺溶于乙醇，并稀釋至100mL。
硼酸鹽緩沖液(pH 9.6)：
0.05mol/L硼砂溶液19.05g硼砂溶至1L。
0.2mol/L NaOH溶液8g NaOH溶至1L。
取50ml 0.05mol/L硼砂溶液加23ml 0.2mol/L NaOH溶液稀釋至200ml。
操作步驟：
稱10.0g過1mm篩風(fēng)干土樣于150mL三角瓶中，加2mL甲苯，混勻，靜置15min，加入10mL 0.5％磷酸苯二鈉溶液和10mL pH9.6堿性硼酸鹽緩沖液，37℃溫育24h，然后混勻、過濾，用38℃蒸餾水定容至100mL，充分混合過濾。取1mL濾液于100mL容量瓶中，加5mL堿性硼酸鹽緩沖液，用蒸餾水稀釋至25mL，加入1mL Gibbs試劑，20min后定容至100mL，溶液呈現(xiàn)青色，測(cè)定578nm處吸光度，按照預(yù)先測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y＝(x-0.0014)/200.88)計(jì)算出酚含量。土壤磷酸酶活性定義為：37℃、pH9.6條件下10g風(fēng)干土壤24h分解釋放酚的毫克(mg)數(shù)。
2.5土壤纖維素酶活性測(cè)定(硝基水楊酸比色法)稱10.0g過1mm篩風(fēng)干土樣于50mL三角瓶中，加1.5mL甲苯，混勻，靜置10min，加入20mL 1％羧甲基纖維素鈉溶液和5mL pH 5.5磷酸鹽緩沖液，塞上棉塞，混勻，37℃溫育72h。用無磷濾紙過濾，取1mL濾液置于50mL容量中，加入3mL 3,5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴5min，冷水冷卻3min，定容至50mL，混勻，15min后，測(cè)定530nm處的吸光度值，按照預(yù)先測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y＝(x+0.0009)/5.3571)計(jì)算葡萄糖含量。土壤纖維素酶活性定義為：37℃、pH5.5條件下10g風(fēng)干土壤72h分解釋放葡萄糖的毫克(mg)數(shù)。
2.6土壤木聚糖酶活性測(cè)定(硝基水楊酸比色法)
稱5.0g過1mm篩風(fēng)干土樣于50mL三角瓶中，加1mL甲苯，混勻，靜置10min，加入20mL 0.5％木聚糖溶液和5mL pH 5.5的磷酸鹽緩沖液，塞上棉塞，混勻，37℃溫育120h。培養(yǎng)結(jié)束后，用無磷濾紙過濾，取1mL濾液，置于50mL容量中，加入3mL 3,5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴5min，冷水冷卻3min，定容至50mL，混勻，15min后，測(cè)定550nm處的吸光度值，按照預(yù)先測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y＝(x+0.0057)/4.1605)計(jì)算還原糖含量。土壤木聚糖酶活性定義為：37℃、pH5.5條件下5g風(fēng)干土壤120h分解釋放還原糖的毫克(mg)數(shù)。
四、生態(tài)修復(fù)現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果
1、土壤生態(tài)修復(fù)菌劑對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響
施用步驟一的土壤生態(tài)修復(fù)菌劑3個(gè)月后，2014年8月7日進(jìn)行了現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查采樣。分別采集了施用土壤生態(tài)修復(fù)菌劑處理(T1)土壤樣品和不施菌劑(CK0)土壤樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析測(cè)定(3次重復(fù))。結(jié)果顯示施用土壤生態(tài)修復(fù)菌劑對(duì)土壤中三類微生物的數(shù)量產(chǎn)生了影響。統(tǒng)計(jì)分析表明，土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)，施用步驟一的土壤生態(tài)修復(fù)菌劑的處理極顯著高于不施菌劑處理；土壤中可培養(yǎng)真菌總數(shù)，同樣是施用步驟一的土壤生態(tài)修復(fù)菌劑的處理顯著高于不施菌劑處理；土壤中可培養(yǎng)放線菌總數(shù)無差異(表1)。
表1生態(tài)修復(fù)試驗(yàn)可培養(yǎng)微生物檢測(cè)結(jié)果
注：表中數(shù)據(jù)后上標(biāo)字母表示處理間差異顯著性，大寫字母不同表示達(dá)到0.01差異水平，小寫字母不同表示達(dá)到0.05差異水平。
2、生態(tài)修復(fù)菌劑對(duì)土壤酶活性的影響
統(tǒng)計(jì)分析表明，施用步驟一的土壤生態(tài)修復(fù)菌劑后，試驗(yàn)地土壤的蔗糖酶、過氧化氫酶、脲酶、磷酸酶、纖維素酶和木聚糖酶活性均顯著或極顯著地高于不施菌劑的空白處理(表2)。
表2生態(tài)修復(fù)試驗(yàn)土壤酶活性測(cè)定結(jié)果
注：表中數(shù)據(jù)后上標(biāo)字母表示處理間差異顯著性，大寫字母不同表示達(dá)到0.01差異水平，小寫字母不同表示達(dá)到0.05差異水平。
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出采用耐鹽短桿菌(Brevibacterium halotolerans)GDSD21 CGMCC No.12402制成的土壤生態(tài)修復(fù)菌劑對(duì)于生荒地土壤培肥、生態(tài)修復(fù)具有顯著效果。
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