專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
背景技術(shù)：
：利用土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入外源基因是植物基因工程中的有效手段。農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠瘓瘤或發(fā)狀根。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過(guò)侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過(guò)改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過(guò)細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。普通雙元載體已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化，但這類(lèi)載體通常只能轉(zhuǎn)移520kb的外源DNA片段；而雙元細(xì)菌人工染色體(BinaryBacterialArtificialChromosome，BIBAC)載體可以彌補(bǔ)普通雙元載體的不足。雙元細(xì)菌人工染色體(BIBAC)以細(xì)菌人工染色體(BAC)文庫(kù)載體為基礎(chǔ)，含有大腸桿菌F質(zhì)粒和發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，能夠在大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌中以單拷貝形式穩(wěn)定復(fù)制，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高分子量DNA的植物轉(zhuǎn)化。在T-DNA區(qū)靠近左右邊界序列處分別引入了植物選擇標(biāo)記基因新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HYG)基因，它們分別編碼對(duì)氨基糖苷類(lèi)抗生素和潮霉素的抗性。在NPTII和HYG兩個(gè)基因之間有多克隆位點(diǎn)，可供插入外源大片段DNA。為提高克隆效率，還引入蔗糖致死基因sacB。故BIBAC不僅能作為基因組文庫(kù)的載體，而且可以將完整的高分子量的核DNA導(dǎo)入植物基因組中，篩選到的候選BIBAC克隆可直接進(jìn)行功能分析，省去了亞克隆的步驟。因此，BIBAC載體系統(tǒng)是一套可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化大片段DNA進(jìn)入到植物染色體上的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。小鹽芥(Thellugiellahalophila)是一種鹽生植物，它生長(zhǎng)在華東地區(qū)海灘鹽土上，是一種不可忽視的非常有價(jià)值的自然資源，而且有許多特征和模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)相似。擬南芥完成其生活史的NaCl濃度最高不超過(guò)75mM，而小鹽芥能在超過(guò)300mM的NaCl濃度下完成生活史。小鹽芥和擬南芥有相似的形態(tài)和生活史，如個(gè)體小、生活周期短、自花傳粉和基因組簡(jiǎn)單；它們有相近的親緣關(guān)系(cDNA序列中90%的核苷酸相同)、相似的基因序列和排列。鹽芥的基因組尺寸接近于擬南芥的兩倍。因此，用小鹽芥作為材料，通過(guò)系統(tǒng)的遺傳分析將有可能發(fā)現(xiàn)耐鹽基因，可用于研究植物耐鹽的分子機(jī)理。雖然目前通過(guò)過(guò)量表達(dá)一些與鹽有關(guān)的基因可以增加植物的耐鹽能力，但單純轉(zhuǎn)化一個(gè)基因提高植物的耐鹽能力是有限的。植物的耐鹽性狀是數(shù)量性狀遺傳。在同一條信號(hào)途徑上面的基因可能成簇存在，通過(guò)同時(shí)轉(zhuǎn)化與耐鹽相關(guān)的基因簇，有可能明顯提高植物的耐鹽能力。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將含有外源DNA的重組雙元細(xì)菌人工染色體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，得到重組農(nóng)桿菌，將所得到的重組農(nóng)桿菌用如下溶液進(jìn)行懸浮后，轉(zhuǎn)化目的植物；所述溶液的溶劑為水，溶質(zhì)是非離子表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚或SillwetL-77和蔗糖，所述非離子表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚或SillwetL-77的濃度為0.05%-0.1%(體積百分比濃度)，所述蔗糖的質(zhì)量百分比濃度為5%，所述外源DNA具體可來(lái)自小鹽芥的基因組DNA，所述目的植物具體可為擬南芥。本發(fā)明所述的植物轉(zhuǎn)化方法，還包括如下耐鹽篩選步驟當(dāng)轉(zhuǎn)基因植物培養(yǎng)至抽薹期用50mMNaCl澆灌3天，然后用lOOmMNaCl澆灌3天，最后用200mMNaCl澆灌3天，停止灌溉NaCl溶液。GUS組織染色和PCR檢測(cè)證明，本發(fā)明的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法可將高達(dá)75kb的外源DNA片段導(dǎo)入目的植物中，這使與耐逆相關(guān)(特別是耐鹽相關(guān))的基因簇轉(zhuǎn)入目的植物的可能性大大提高，為耐鹽植物的培育奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。圖1為轉(zhuǎn)基因植物中的sacB和nptll基因PCR檢測(cè)；M為分子量標(biāo)記；1.sacB基因；2.nptll基因。圖2為轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色結(jié)果；圖3為MS平板上轉(zhuǎn)化植株的的耐鹽性篩選圖；A:培養(yǎng)基中不含NaCl;B:培養(yǎng)基中含200mMNaCl。圖4為土中進(jìn)行的耐鹽性篩選結(jié)果。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)擬南芥轉(zhuǎn)化1)構(gòu)建小鹽芥(Thellungiellahalophila)雙元細(xì)菌人工染色體文庫(kù)提取生長(zhǎng)20天的小鹽芥地上部分總DNA，用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI對(duì)總DNA進(jìn)行不完全酶切，經(jīng)過(guò)脈沖凝膠電泳分析，將分子量在50-100kb之間的DNA片段從凝膠中回收，回收的DNA片段與同樣經(jīng)過(guò)BamHI酶切并脫磷的植物雙源表達(dá)載體BIBAC2(HamiltonCM，F(xiàn)raryA，LewisC，Tanksley，SD(1996)StabletransferofintacthighmolecularweightDNAintoplantchromosomes.ProcNatlAcadSciUSA.93:9975-9)進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物利用電轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH10B中用于文庫(kù)的擴(kuò)增。l微升連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化效率為1X10SBAC克隆，整個(gè)文庫(kù)由23，040個(gè)克隆組成。穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果表明，小鹽芥基因組DNA能夠在BIBAC載體中穩(wěn)定存在。2)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)擬南芥轉(zhuǎn)化從小鹽芥BIBAC文庫(kù)中挑選210個(gè)單克隆，這些克隆中的外源DNA插入片段的大小為50-100kb，分別提取上述克隆的質(zhì)粒DNA，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的方法分別將各個(gè)質(zhì)粒DNA單獨(dú)導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，得到210種含有一個(gè)外源質(zhì)粒的重組農(nóng)桿菌。分別挑取重組農(nóng)4桿菌單克隆菌落轉(zhuǎn)入34mlLB培養(yǎng)液中(含50g/ml卡那霉素和50yg/ml利福平)，28t:搖菌過(guò)夜。培養(yǎng)得到的菌液轉(zhuǎn)接于500mlLB(含50g/ml卡那霉素和50yg/ml利福平)，28t:搖菌過(guò)夜。當(dāng)菌液0D值為1.0，分別收集菌液入離心管，4000rpm、20min，收集菌體。分別用新鮮配制的如下溶液重懸菌體溶劑為水，溶質(zhì)是壬基酚聚氧乙烯醚和蔗糖，其中，壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)(Fluka74385)的濃度為0.05%和蔗糖的質(zhì)量百分濃度為5%。選取抽苔期的野生型Columbia生態(tài)型擬南芥健壯植株，分別帶盆一起倒扣于盛浸染液的容器上方，使整個(gè)花序浸泡于上述菌體懸浮液中，而葉片盡量不與菌體懸浮液接觸。30秒后將盆取下，橫放于暗箱中約24h，并用塑料膜覆蓋1天，保持濕潤(rùn)。然后將處理過(guò)的擬南芥植株放于2225t:的光照條件下使其正常生長(zhǎng)。收獲種子，干燥條件下保存待用。3)農(nóng)桿菌介導(dǎo)擬南芥轉(zhuǎn)化從小鹽芥BIBAC文庫(kù)中挑選210個(gè)單克隆，這些克隆中的外源DNA插入片段的大小為50-100kb，分別提取上述克隆的質(zhì)粒DNA，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的方法分別將各個(gè)質(zhì)粒DNA單獨(dú)導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，得到210種含有一個(gè)外源質(zhì)粒的重組農(nóng)桿菌。分別挑取重組農(nóng)桿菌單克隆菌落轉(zhuǎn)入34mlLB培養(yǎng)液中(含50g/ml卡那霉素和50yg/ml利福平)，28t:搖菌過(guò)夜。培養(yǎng)得到的菌液轉(zhuǎn)接于500mlLB(含50g/ml卡那霉素和50yg/ml利福平)，28t:搖菌過(guò)夜。當(dāng)菌液OD值為1.0，分別收集菌液入離心管，4000rpm、20min，收集菌體。分別用新鮮配制的如下溶液重懸菌體溶劑為水，溶質(zhì)是壬基酚聚氧乙烯醚和蔗糖，其中，壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)(Fluka74385)的濃度為0.1%和蔗糖的質(zhì)量百分濃度為5%。選取抽苔期的野生型Columbia生態(tài)型擬南芥健壯植株，分別帶盆一起倒扣于盛浸染液的容器上方，使整個(gè)花序浸泡于上述菌體懸浮液中，而葉片盡量不與菌體懸浮液接觸。30秒后將盆取下，橫放于暗箱中約24h，并用塑料膜覆蓋l天，保持濕潤(rùn)。然后將處理過(guò)的擬南芥植株放于2225t:的光照條件下使其正常生長(zhǎng)。收獲種子，干燥條件下保存待用。4)農(nóng)桿菌介導(dǎo)擬南芥轉(zhuǎn)化從小鹽芥BIBAC文庫(kù)中挑選210個(gè)單克隆，這些克隆中的外源DNA插入片段的大小為50-100kb，分別提取上述克隆的質(zhì)粒DNA，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的方法分別將各個(gè)質(zhì)粒DNA單獨(dú)導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，得到210種含有一個(gè)外源質(zhì)粒的重組農(nóng)桿菌。分別挑取重組農(nóng)桿菌單克隆菌落轉(zhuǎn)入34mlLB培養(yǎng)液中(含50g/ml卡那霉素和50yg/ml利福平)，28t:搖菌過(guò)夜。培養(yǎng)得到的菌液轉(zhuǎn)接于500mlLB(含50g/ml卡那霉素和50yg/ml利福平)，28t:搖菌過(guò)夜。當(dāng)菌液OD值為1.0，分別收集菌液入離心管，4000rpm、20min，收集菌體。分別用新鮮配制的如下溶液重懸菌體溶劑為水，溶質(zhì)是壬基酚聚氧乙烯醚和蔗糖，其中，SillwetL-77(LEHLESEEDS,USA，Cat#VIS_02)的濃度為0.1%和蔗糖的質(zhì)量百分濃度為5%。選取抽苔期的野生型Columbia生態(tài)型擬南芥健壯植株，分別帶盆一起倒扣于盛浸染液的容器上方，使整個(gè)花序浸泡于上述菌體懸浮液中，而葉片盡量不與菌體懸浮液接觸。30秒后將盆取下，橫放于暗箱中約24h，并用塑料膜覆蓋1天，保持濕潤(rùn)。然后將處理過(guò)的擬南芥植株放于2225t:的光照條件下使其正常生長(zhǎng)。收獲種子，干燥條件下保存待用。5)農(nóng)桿菌介導(dǎo)擬南芥轉(zhuǎn)化從小鹽芥BIBAC文庫(kù)中挑選210個(gè)單克隆，這些克隆中的外源DNA插入片段的大小為50-100kb，分別提取上述克隆的質(zhì)粒DNA，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的方法分別將各個(gè)質(zhì)粒DNA單獨(dú)導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中，得到210種含有一個(gè)外源質(zhì)粒的重組農(nóng)桿菌。分別挑取重組農(nóng)54mlLB培養(yǎng)液中(含50g/ml卡那霉素和50yg/ml利福平)，28t:搖菌過(guò)夜。培養(yǎng)得到的菌液轉(zhuǎn)接于500mlLB(含50g/ml卡那霉素和50yg/ml利福平)，28t:搖菌過(guò)夜。當(dāng)菌液0D值為1.0，分別收集菌液入離心管，4000rpm、20min，收集菌體。分別用新鮮配制的如下溶液重懸菌體溶劑為水，溶質(zhì)是壬基酚聚氧乙烯醚和蔗糖，其中，SillwetL-77(LEHLESEEDS,USA，Cat#VIS_02)的濃度為0.05%和蔗糖的質(zhì)量百分濃度為5%。選取抽苔期的野生型Columbia生態(tài)型擬南芥健壯植株，分別帶盆一起倒扣于盛浸染液的容器上方，使整個(gè)花序浸泡于上述菌體懸浮液中，而葉片盡量不與菌體懸浮液接觸。30秒后將盆取下，橫放于暗箱中約24h，并用塑料膜覆蓋1天，保持濕潤(rùn)。然后將處理過(guò)的擬南芥植株放于2225t:的光照條件下使其正常生長(zhǎng)。收獲種子，干燥條件下保存待用。6)轉(zhuǎn)化植株的篩選收集步驟2)、3)、4)和5)中轉(zhuǎn)化后的擬南芥的1\代種子，晾曬約一周后，放入1.5ml離心管保存(加入硅膠顆粒保持干燥)。取約0.lml種子放入1.5ml離心管，加入lml70%乙醇漂洗2min。離心沉淀種子，吸干乙醇；加入10%漂白劑(bleach)漂洗20min，離心沉淀種子，吸干漂白劑；在超凈臺(tái)中用無(wú)菌水漂洗4次，每次加入lml無(wú)菌水；用0.2%瓊脂重懸浮種子，并將其均勻的鋪在1/2MS鹽培養(yǎng)基(含50iig/ml卡那霉素+150yg/ml羧節(jié)青霉素)平板上；4。C春化2天后，移入22t:植物培養(yǎng)箱(光暗周期為16/8小時(shí))；培養(yǎng)約二周后，可以篩選到具有抗性的擬南芥，具有抗性的擬南芥表現(xiàn)為真葉呈深綠色，根深長(zhǎng)至培養(yǎng)基中，將具有抗性的擬南芥移至正常MS培養(yǎng)基中。10天后將苗移入土中培養(yǎng)，收獲T2種子。7)轉(zhuǎn)化植株的鑒定1.轉(zhuǎn)化植株的GUS組織染色將步驟2)、3)、4)和5)的擬南芥T2代種子消毒滅菌播在MS平板上，待長(zhǎng)出4片真葉后，隨機(jī)取20個(gè)株系，進(jìn)行GUS組織染色。GUS染色方法參見(jiàn)JeffersonRA，KavanaghTA，Bevan麗(1987)GUSfusions:b-glucuronidaseasasensitiveandveratilegenefusionmakerinhigherplants.EMBOJ6:3901-7GUS組織染色結(jié)果如圖2所示，GUS基因表達(dá)很強(qiáng)。步驟2)、3)、4)和5)的擬南芥T2幼苗中的20個(gè)株系中分別有18、15、18、17個(gè)株系呈藍(lán)色GUS活性，圖中僅顯示其中一株的結(jié)果，其他均與其相同。2.轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)以擬南芥T2代植株的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR檢測(cè)。用于檢測(cè)NPTII基因的引物序列正向?yàn)?'-TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3';反向?yàn)?'-AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3'。用于檢測(cè)sacB基因的引物序列正向?yàn)?'-GGTCGGCGACAACTCAATCGACAG-3';反向?yàn)?'-GCGGCACTGCGAAGTGAGAGTAAG-3'。PCR體系(50ii1):1ii1lOiiM正向引物，lii110iiM反向引物，1ii1TaqDNA聚合酶，liildNTP，liilDNA模板(濃度為100ng/iil)，5ii110Xbuffer,40ii1ddH20。PCR反應(yīng)參數(shù)6首先94°C4min;然后94°C45s、55。C30s、72。C2min，30個(gè)循環(huán)；最后72°C10min。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠上，電泳后于紫外燈下照相。PCR檢測(cè)結(jié)果表明，在GUS組織染色呈藍(lán)色的株系中均檢測(cè)出NPTII基因擴(kuò)增產(chǎn)物和sacB基因擴(kuò)增產(chǎn)物。GUS組織染色和PCR檢測(cè)結(jié)果都表明，利用雙元細(xì)菌人工染色體和農(nóng)桿菌介導(dǎo)能將外源DNA片段導(dǎo)入擬南芥中。8)轉(zhuǎn)化擬南芥植株的耐鹽性篩選1.含鹽的MS平板上初篩將步驟2)、3)、4)和5)中轉(zhuǎn)化后的擬南芥的T2代種子及野生型種子消毒滅菌播在無(wú)NaCl的MS平板上。4t:春化2天后，移入22t:植物培養(yǎng)箱。當(dāng)植株長(zhǎng)到四片真葉時(shí)，分別把相同株數(shù)的轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株移到含有200mMNaCl的MS平板上。在22。C植物培養(yǎng)箱培養(yǎng)兩周，觀(guān)察轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的耐鹽表型。野生型植株的葉片幾乎全部發(fā)黃、枯萎，將步驟2)、3)、4)和5)中轉(zhuǎn)化后的擬南芥的L代株系中新生葉片均保持綠色的株系挑出，作為候選耐鹽的株系。結(jié)果，在分別得到5、4、6、8個(gè)候選耐鹽的株系。2.土壤中篩選平板中篩選得到的耐鹽株系，其篩選過(guò)程是在人工配制好的培養(yǎng)基上進(jìn)行的，而且所考察的過(guò)程沒(méi)有涉及植物的整個(gè)生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)周期，不能確定在植物抽苔和開(kāi)花、結(jié)果期間對(duì)鹽的耐受能力。故采用如下方法對(duì)所得到的耐鹽株系在土壤中進(jìn)行直接篩選選取候選耐鹽的各個(gè)株系及野生型植株各IO株，在擬南芥即將抽苔時(shí)，依次用50mMNaCl、100mMNaCl禾P200mMNaCl處理植株的根系，其中，50mMNaCl的處理時(shí)間為3天，100mMNaCl的處理時(shí)間為3天，200mMNaCl的處理時(shí)間為3天。15天后，觀(guān)察耐鹽植株與野生型植株的抗鹽表型，并拍照記錄。野生型植株均發(fā)黃、萎蔫，候選耐鹽的各個(gè)株系中各個(gè)株系均有2個(gè)株系葉片顏色健康，上述葉片顏色健康、生長(zhǎng)狀況良好的株系為耐鹽株系。權(quán)利要求一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將含有外源DNA的重組雙元細(xì)菌人工染色體文庫(kù)導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，得到重組農(nóng)桿菌，將所得到的重組農(nóng)桿菌用如下溶液進(jìn)行懸浮后，轉(zhuǎn)化目的植物，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述溶液的溶劑為水，溶質(zhì)是壬基酚聚氧乙烯醚或SillwetL-77和蔗糖；所述壬基酚聚氧乙烯醚或SillwetL-77的體積百分比濃度為0.05％-0.1％，所述蔗糖的質(zhì)量百分比濃度為5％。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述外源DNA來(lái)自小鹽芥的基因組DNA。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述目的植物為擬南芥。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法還包括如下耐鹽篩選步驟在轉(zhuǎn)基因擬南芥的抽薹期，依次用50mMNaCl、100mMNaCl禾P200mMNaCl處理植株的根系，其中，所述50mMNaCl的處理時(shí)間為3天，所述lOOmMNaCl的處理時(shí)間為3天，所述200mMNaCl的處理時(shí)間為3天。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將含有外源DNA的重組雙元細(xì)菌人工染色體導(dǎo)入農(nóng)桿菌中，得到重組農(nóng)桿菌，將所得到的重組農(nóng)桿菌用如下溶液進(jìn)行懸浮后，轉(zhuǎn)化目的植物溶劑為水，溶質(zhì)是非離子表面活性劑壬基酚聚氧乙烯醚或SillwetL-77和蔗糖；其中，壬基酚聚氧乙烯醚或SillwetL-77的體積百分比濃度為0.05％-0.1％，蔗糖的質(zhì)量百分比濃度為5％。利用本發(fā)明的方法能將高達(dá)75kb的外源DNA片段導(dǎo)入目的植物中，這使與耐逆相關(guān)(特別是耐鹽相關(guān))的基因簇轉(zhuǎn)入目的植物的可能性大大提高，為耐鹽植物的培育奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。文檔編號(hào)A01H1/00GK101736013SQ200810226759公開(kāi)日2010年6月16日申請(qǐng)日期2008年11月21日優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日發(fā)明者夏然,張譯月,謝旗申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所