專利名稱：一種直翅目昆蟲整體連續(xù)切片的預(yù)處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及顯微組織切片技術(shù)，特別是一種適用于直翅目昆蟲整體連續(xù)切片的 預(yù)處理方法。
背景技術(shù)：
對(duì)直翅目昆蟲，尤其是蝗蟲組織切片的研究，普通切片技術(shù)基本都是對(duì)特定的 部位取材，進(jìn)行切片，但是由于蝗蟲體壁的阻隔，普通切片技術(shù)的固定、脫水、透 明、侵蠟等環(huán)節(jié)都進(jìn)行不徹底，不好掌握時(shí)間，在切片的時(shí)候容易造成切片碎裂， 不能對(duì)蝗蟲進(jìn)行很好的整體連續(xù)切片。而對(duì)蝗蟲整體進(jìn)行連續(xù)切片具有很重要的意 義，可以確切了解蝗蟲各個(gè)器官在特定時(shí)間和條件下的整體狀態(tài)，不僅可以研究不 同時(shí)期蝗蟲各個(gè)器官整體發(fā)育情況，還可以研究蝗蟲組織器官跟病原微生物相互作 用在不同時(shí)期的整體變化情況。但是，我國目前還沒有對(duì)直翅目昆蟲，尤其是蝗蟲 進(jìn)行整體連續(xù)切片技術(shù)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種直翅目昆蟲整體連續(xù)切片的預(yù)處理方法。 本發(fā)明提供的直翅目昆蟲整體連續(xù)切片的預(yù)處理方法，依次包括如下步驟
1) 將直翅目昆蟲冷凍后于Bouin's固定液中固定，去足，朿I」？L，之后再放入 Bouin's固定液中，負(fù)壓抽氣后固定；
2) 在負(fù)壓抽氣的條件下，用酒精溶液對(duì)步驟l)處理完畢的直翅目昆蟲進(jìn)行梯 度脫水處理；所述梯度脫水處理的酒精溶液的起始濃度為70%，終濃度為100%;
3) 在負(fù)壓抽氣的條件下，采用二甲苯置換步驟2)處理完畢的直翅目昆蟲體內(nèi) 的酒精的方法對(duì)直翅目昆蟲進(jìn)行透明處理；
4) 采用石蠟置換將步驟3)處理完畢的直翅目昆蟲體內(nèi)的二甲苯的方法對(duì)直翅 目昆蟲進(jìn)行透蠟處理。
上述方法的步驟l)中，將直翅目昆蟲冷凍是為了防止直接放到固定液后掙扎， 損壞組織結(jié)構(gòu)。用解剖針在蝗蟲身體上刺幾個(gè)孔時(shí)，注意要使用銳利的解剖針，刺 孔時(shí)不能使蝗蟲體壁變形，也不能刺入過深，以免傷害內(nèi)部組織。去足步驟之前的 固定時(shí)間為1-3小時(shí)；刺孔步驟之后的固定時(shí)間為12-24小時(shí)。
負(fù)壓抽氣時(shí)要逐步緩慢進(jìn)行，以免傷害昆蟲的內(nèi)部組織?？上瘸闅庵?0.03MPa， 1小時(shí)后抽至-0.06MPa，再1小時(shí)抽氣至-0.09MPa，放氣也要逐步緩慢進(jìn)行。24小
時(shí)后，用70%酒精沖洗三次，每次10分鐘，使黃色退去，以洗去固定液。
步驟2)中，梯度脫水處理時(shí)，酒精溶液的濃度梯度可為70%、 80%、 90%、 95%、 100%、 100%，每個(gè)梯度的處理時(shí)間為0.5-1.5小時(shí)，優(yōu)選1小時(shí)。本發(fā)明中所用濃 度均為質(zhì)量百分比濃度。
步驟3)中，處理時(shí)間可根據(jù)昆蟲的大小和透明情況判斷，透明后即可終止透 明。如可將昆蟲依次經(jīng)過50%酒精+50%二甲苯、二甲苯、二甲苯。 一般每個(gè)級(jí)別1-2 個(gè)小時(shí)，不可透明時(shí)間過長，以免組織發(fā)脆，影響切片。
步驟4)中，起始石蠟溶液為50%石蠟水溶液與50%二甲苯水溶液的混合液。 具體步驟可為用50%石蠟水溶液與50。/。二甲苯水溶液的混合液進(jìn)行透蠟處理時(shí)， 溫度為40-42。C，時(shí)間為1-2小時(shí)；
用70%石蠟水溶液與50%二甲苯水溶液的混合液進(jìn)行透蠟處理時(shí)，溫度為48-50 °C，時(shí)間為1-2小時(shí)；
用純石蠟進(jìn)行透蠟處理的次數(shù)為2-4次，優(yōu)選3次；每次用純石蠟進(jìn)行透蠟處 理時(shí)，溫度為56-58i:，時(shí)間為6-8小時(shí)。
該步驟可在負(fù)壓抽氣的條件下進(jìn)行。上述步驟2) —步驟4)中，負(fù)壓抽氣的終 態(tài)壓力皆為-0.09MPa。
本發(fā)明經(jīng)過一系列試驗(yàn)方法的篩選和條件的優(yōu)化及重復(fù)試驗(yàn)，建立了一套適用 于直翅目昆蟲整體組織的預(yù)處理方法，采用該方法能對(duì)直翅目昆蟲進(jìn)行很好的連續(xù) 整體切片，切片厚度為10pm。該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)
1) 本發(fā)明優(yōu)化了直翅目昆蟲固定的方法和條件，針對(duì)直翅目昆蟲體壁比較難滲 透的特點(diǎn)，固定前進(jìn)行預(yù)處理，先用固定液殺死直翅目昆蟲，然后去足、刺孔，再 使用逐步負(fù)壓抽氣的方法，使固定液能夠更好地滲透到直翅目昆蟲體內(nèi)。
2) 本發(fā)明在對(duì)直翅目昆蟲進(jìn)行固定、脫水、侵蠟的過程中，使用負(fù)壓抽氣的方 法，加快各個(gè)過程，并且使各個(gè)過程進(jìn)行更加徹底。
3) 本發(fā)明優(yōu)化了侵蠟的時(shí)間，使石蠟?zāi)軌蚋玫厍秩氲街背崮坷ハx體內(nèi)各個(gè)部 位，省略了比較繁瑣的專門軟化昆蟲體壁的步驟。
4) 本發(fā)明在應(yīng)用于東亞飛蝗三齡蝗蝻的整體切片中，獲得了完整的整體連續(xù)切 片，效果良好，重復(fù)性高。由于東亞飛蝗屬于直翅目蝗亞目中的飛蝗屬，而螽蟖亞 目和螻蛄亞目的昆蟲與蝗亞目昆蟲具有非常相似的結(jié)構(gòu)，因此本發(fā)明適用于直翅目 昆蟲的整體連續(xù)切片。


圖1是東亞飛蝗三齡蝗蝻的完整切片。
圖2是東亞飛蝗三齡蝗蝻的完整切片。 圖3是東亞飛蝗三齡蝗蝻的部分連續(xù)切片。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。 實(shí)施例1、對(duì)東亞飛蝗三齡蝗蝻進(jìn)行整體連續(xù)切片的預(yù)處理方法
1) 材料前處理東亞飛蝗三齡蝗蝻稍冷凍，入30倍Bouin，s固定液固定1小時(shí)， 去足，用解剖針在蝗蟲身體上刺若干個(gè)孔。
2) 材料固定蝗蟲放入50倍Bouin，s固定液中，進(jìn)行負(fù)壓抽氣，固定24小時(shí) 后，用70%酒精沖洗三次，每次10分鐘。
3) 脫水處理經(jīng)70%、 80%、卯％、 95%、 100%、 100%梯度酒精進(jìn)行脫水， 每個(gè)梯度一個(gè)小時(shí)，每個(gè)梯度進(jìn)行負(fù)壓抽氣，負(fù)壓抽氣的終態(tài)壓力為-0.09MPa。
4) 透明處理依次經(jīng)過50%酒精+50%二甲苯、二甲苯、二甲苯，每個(gè)級(jí)別1 2個(gè)小時(shí)，透明后即停止；每個(gè)級(jí)別負(fù)壓抽氣的終態(tài)壓力為-0.09MPa。
5) 透蠟處理經(jīng)過50%石蠟+50%二甲苯，溫度40 42X:，時(shí)間1 2小時(shí)， 然后經(jīng)70%石蠟+50%二甲苯，溫度48 50。C，時(shí)間1 2小時(shí)，最后經(jīng)過三次純石 蠟，溫度56 58"C，時(shí)間每次3 4小時(shí)，經(jīng)過純蠟時(shí)進(jìn)行負(fù)壓抽氣，負(fù)壓抽氣的終 態(tài)壓力為-0.09MPa，完成對(duì)東亞飛蝗三齡蝗蝻進(jìn)行整體連續(xù)切片的預(yù)處理。之后按 照常規(guī)方法進(jìn)行切片，所得結(jié)果如圖1-圖3所示。其中，圖1和圖2為東亞飛蝗三 齡蝗蝻的完整切片，圖3是東亞飛蝗三齡蝗蝻的部分連續(xù)切片(1 9切片順序?yàn)閺?頭部至尾部)。由圖可知，利用本發(fā)明提供的預(yù)處理方法，能夠得到東亞飛蝗三齡
權(quán)利要求
1、一種直翅目昆蟲整體連續(xù)切片的預(yù)處理方法，依次包括如下步驟1)將直翅目昆蟲冷凍后于Bouin’s固定液中固定，去足，刺孔，之后再放入Bouin’s固定液中，負(fù)壓抽氣后固定；2)在負(fù)壓抽氣的條件下，用酒精溶液對(duì)所述步驟1)處理完畢的直翅目昆蟲進(jìn)行梯度脫水處理；所述梯度脫水處理的酒精溶液的起始濃度為70％，終濃度為100％；3)在負(fù)壓抽氣的條件下，采用二甲苯置換所述步驟2)處理完畢的直翅目昆蟲體內(nèi)的酒精的方法，對(duì)所述直翅目昆蟲進(jìn)行透明處理；4)采用石蠟置換將所述步驟3)處理完畢的直翅目昆蟲體內(nèi)的二甲苯的方法，對(duì)所述直翅目昆蟲進(jìn)行透蠟處理。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟l)的去足步驟之前，所 述Bouin's固定液的用量為蝗蟲體積的30-50倍；所述剌孔步驟之后，所述Bouin's固 定液的用量為蝗蟲體積的30-50倍；所述步驟3)中，起始溶液為質(zhì)量百分比濃度為50%的酒精水溶液與50%的二甲 苯水溶液的混合液；所述步驟4)中，起始溶液為質(zhì)量百分比濃度為50%的石蠟水溶液與50%的二甲 苯水溶液的混合液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟4)在負(fù)壓抽氣的條件下 進(jìn)行。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)—步驟4)中， 負(fù)壓抽氣的終態(tài)壓力均為-0.09MPa。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述步驟l)中，冷凍溫度 為-5-l(TC，冷凍時(shí)間為5-10分鐘；去足步驟之前的固定時(shí)間為1-3小時(shí)；刺孔步驟之 后的固定時(shí)間為12-24小時(shí)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述步驟4)中，用質(zhì)量百 分比濃度為50%的石蠟水溶液與質(zhì)量百分比濃度為50%的二甲苯水溶液的混合液進(jìn)行 透蠟處理時(shí)，溫度為40-42。C，時(shí)間為l-2小時(shí)；用質(zhì)量百分比濃度為70%的石蠟水溶液與質(zhì)量百分比濃度為50%的二甲苯水溶 液的混合液進(jìn)行透蠟處理時(shí)，溫度為48-5(TC，時(shí)間為l-2小時(shí)；用純石蠟進(jìn)行透蠟處理的次數(shù)為2-4次；所述每次用純石蠟進(jìn)行透蠟處理時(shí)，溫 度為56-58"C，時(shí)間為6-8小時(shí)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中，所述每個(gè)梯度的處理時(shí)間為0.5-1.5小時(shí)。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述步驟3)中，用質(zhì)量百 分比濃度為50%的酒精水溶液與質(zhì)量百分比濃度為50%的二甲苯水溶液的混合液進(jìn)行透明處理時(shí)，處理時(shí)間為l-2小時(shí)；所述用二甲苯進(jìn)行透明處理時(shí)，處理時(shí)間為1-2小時(shí)。
9、 根據(jù)權(quán)利要求l-3任一所述的方法，其特征在于所述直翅目昆蟲為蝗亞目昆蟲。
10、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述直翅目昆蟲為蝗亞目昆蟲。
全文摘要
本發(fā)明公開一種直翅目昆蟲整體連續(xù)切片的預(yù)處理方法。該方法依次包括如下步驟1)將直翅目昆蟲冷凍后于Bouin’s固定液中固定，去足，刺孔，之后再放入Bouin’s固定液中，負(fù)壓抽氣后固定；2)在負(fù)壓抽氣的條件下進(jìn)行梯度脫水處理；3)在負(fù)壓抽氣的條件下進(jìn)行透明處理；4)采用石蠟進(jìn)行透蠟處理。本發(fā)明提供的預(yù)處理方法，在固定、脫水、侵蠟過程中進(jìn)行負(fù)壓抽氣，可提高處理效率并使各個(gè)過程進(jìn)行更加徹底；該方法優(yōu)化了侵蠟的時(shí)間，使石蠟?zāi)軌蚋玫厍秩氲街背崮坷ハx體內(nèi)各個(gè)部位，省略了比較繁瑣的專門軟化昆蟲體壁的步驟。利用該方法能夠獲得完整的整體連續(xù)切片，效果良好，重復(fù)性高，適用于直翅目昆蟲的整體連續(xù)切片。
文檔編號(hào)A01N1/00GK101390510SQ20081022631
公開日2009年3月25日 申請(qǐng)日期2008年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月12日
發(fā)明者尹學(xué)偉, 龍 張 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)