專利名稱：一種用于防治棉鈴疫病的短小芽孢桿菌及其微生物菌劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于農業(yè)微生物領域，具體涉及一種用于防治棉鈴疫病的短小芽孢桿菌和含有該短小芽孢桿菌的微生物菌劑，以及它們在防治棉鈴疫病上的應用。
背景技術：
棉鈴疫病是一種嚴重的棉花病害，由芒麻疫霉(Phytophthora boehmeriaesawada)引起，它不僅直接為害棉鈴，而且為其它病原菌提供了侵染條件。防治棉鈴疫病的方法主要是推株并壟、早摘爛鈴等栽培措施和化學藥劑防治。目前，我國種植棉花的經濟效益較低，而且人工費較高，農民不愿投入太多精力來推株并攏；早摘爛鈴只能保住部分產量，不足以防控棉鈴疫?。换瘜W藥劑雖然防治效果較好，但存在容易產生抗藥性，化學藥劑價格較貴，增加生產成本，以及環(huán)境污染等問題。因此，亟需尋找一種省時省力、高效并且成 本低廉的防治方法。利用有益微生物對植物病害進行生物防治，因具有針對性強、防效高且環(huán)保等優(yōu)點越來越受到重視。特別是在蔬菜氣傳病害和作物土傳病害上應用較多。有關棉鈴疫病的生物防治方面研究很少。馬平等(馬平等.生物防治通報.1993.9(3))發(fā)現(xiàn)木霉菌和腐霉菌對棉鈴疫病具有一定防治效果，并篩選到生防細菌MB-3和MB-7，其發(fā)酵液10倍稀釋液對棉鈴疫病田間防治效果分別為34. 9%和45. 4% (馬平等 中國生物防治 1998. 14(2))。芽孢桿菌(Bacillus)具有分布廣、易分離培養(yǎng)、能產生抗逆性較強的芽孢、貯藏期長和使用方便等優(yōu)點，是一種理想的生防微生物，相比其他類型的生防因子，更有利于菌劑的生產，劑型加工，在環(huán)境中存活、定殖與繁殖。因此，篩選對病原菌具有抑制作用的芽孢桿菌是防治有關植物病害的最有效方法之一。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種用于防治棉鈴疫病的短小芽孢桿菌菌株，該菌株具有高效、廣譜殺菌活性等優(yōu)點。本發(fā)明第二目的在于提供一種微生物菌劑。本發(fā)明第三目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。本發(fā)明第四目的在于提供上述短小芽孢桿菌菌株在防治棉鈴疫病上的用途。本發(fā)明第五目的在于提供上述微生物菌劑在防治棉鈴疫病上的用途。本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)一種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)菌株HMB22277，已于2011年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5615。利用上述短小芽孢桿菌HMB22277生產的微生物菌劑，其活性成分為短小芽孢桿菌HMB22277菌體和它的胞外代謝產物。上述微生物菌劑可以為液體制劑。上述微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟菌種活化，種子液制備和發(fā)酵培養(yǎng)。
上述微生物菌劑的制備方法，具體包括如下步驟(I)菌種活化將低溫保存的HMB22277菌株在LB平板培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)24 36小時，得活化的菌株；(2)種子液制備用無菌的接種環(huán)刮取一環(huán)步驟(I)活化的菌株接種到IOOmLLB液體培養(yǎng)基中，在26 34°C、，搖床轉速為170 210rpm的條件下培養(yǎng)22 25小時，得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)按照體積比為0. 5% 3. 0%的比例將步驟⑵的種子液接入到蔗糖豆餅粉培養(yǎng)基(PH值為5. 8 6. 2)中，在溫度為28 34°C，搖床轉速為170 210rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)36 54h ;所述的蔗糖豆餅粉培養(yǎng)基，其組成成分及其重量百分比為蔗糖
2.0 3. 0%，豆餅粉 I. 6 2. 4%, NaCl 0. I 0. 2%, CaCO3O. I 0. 3%, KH2PO4 0. 01
0.03%和 MgSO4 7H20 0. 01 0. 03%，其余為水；(4)檢測發(fā)酵液中菌體和芽孢的數(shù)量，待發(fā)酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌體總數(shù)的90%時，停止發(fā)酵培養(yǎng)；所得即為HMB22277菌株的液體制劑。上述制備方法步驟(2)和(3)中所述的溫度優(yōu)選為30 32°C ;所述的搖床轉速優(yōu)選為210rpm ;所述的培養(yǎng)時間優(yōu)選為48h。所述的LB平板培養(yǎng)基、LB斜面培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基均按照常規(guī)方法制備。所述的蔗糖豆餅培養(yǎng)基的制備方法，按照重量百分比將蔗糖、豆餅粉、NaCl、CaCO3> KH2PO4和MgSO4 7H20混合，再加水，攪拌均勻即可。上述微生物菌劑，其短小芽孢桿菌HMB22277的活菌數(shù)大于8. 37X 108cfu/mL。上述短小芽孢桿菌HMB22277在防治棉鈴疫病上的應用。上述微生物菌劑在防治棉鈴疫病上的應用。本發(fā)明微生物菌劑的使用方法將上述所得微生物菌劑用水稀釋至活菌數(shù)為107cfu/mL，于棉鈴疫病發(fā)病前進行棉鈴表面、中下部葉片噴霧，即可達到控制棉鈴疫病的目的。HMB22277菌株的篩選分離過程HMB22277菌株是河北省農林科學院植物保護研究所從河北省定興縣黃瓜田土壤中分離得到的。2010年河北省農林科學院植物保護研究所從河北省保定市定興縣黃瓜田中五點取樣采土壌，混勻后稱取5g放到250mL的滅菌三角瓶中，加入IOOmL無菌水,放到搖床上，170r/min振蕩30min，靜置2h，取上清液ImL加無菌水9mL，即成IOmL 10_2倍土壤微生物懸液，繼而將土壤懸液稀釋成10_3、10_4、10_5、10_6倍稀釋液，各濃度取200 u L微生物懸液涂于LB和KB培養(yǎng)基平板上，每個濃度3次重復，在28°C恒溫培養(yǎng)ld_3d，進行細菌的分離和純化。并以棉鈴疫病為靶標，利用平板對峙法和離體成鈴針刺接種法進行生防菌的篩選。結果從中篩選出ー個對靶標病害具有明顯防治效果的菌株，定名為HMB22277。HMB22277菌株的分類鑒定(I)形態(tài)特征鑒定在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌體為桿狀，培養(yǎng)IOh后產生芽孢，芽孢中生，橢圓形，孢囊不膨大，抗酸染色陰性，無伴孢晶體，能運動，鞭毛周生。在營養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)初期菌落淡乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈饅頭狀，表面濕潤；培養(yǎng)后期菌落淡黃色，邊緣不整齊，表面干燥有褶皺；在營養(yǎng)瓊脂斜面上劃線培養(yǎng)，呈直線形；在液體培養(yǎng)基中、靜止培養(yǎng)，表面形成白色菌膜。與《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠等編著.科學出版社.2001年)中描述的芽孢桿菌屬形態(tài)特征基本一致，初步判斷菌株HMB22277屬于芽孢桿菌(Bacillus)。(2)利用16S rDNA序列鑒定分類以HMB22277的基因組DNA為模板，以F27和R1492為引物對16S rDNA進行PCR擴增，所述的引物序列為F27 5，AGAGTTTGATCATGGCTCAG3，； (SEQ ID No 2)R1492 :5’ GGCTACCTTGTTACGACTT3’ ； (SEQ ID No 3)
16S rDNA 的擴增反應體系為 50 y L:10XPCR Buffer (Mg2+) 5 u L ； dNTPMixture(2. 5mM) 5 u L ；Taq(5U/u L) I u L, F27(10 u mol/L) I u L, R1492(10 u mol/L)luL ；HMB22277的基因組DNA 50ng ；ddH20補足至50 yしPCR的反應條件為95 °C 5min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C I. 5min，30個循環(huán)；72°C lOmin。將所得PCR擴增產物進行凝膠電泳，送交上海生エ生物工程有限公司測序，得到HMB22277的16S rDNA序列(見SEQ ID No I)。將所得HMB22277的16S rDNA序列在Genbank中進行同源性比較，結果菌株HMB22277與短小芽孢桿菌的16S rDNA同源性達到99% ;構建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2)，HMB22277與短小芽孢桿菌聚合到一起，說明HMB22277屬于短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。(3)利用生理生化特征鑒定分類利用Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)可以測試菌株對95種碳源的利用情況從而進ー步確定其種屬特征，提高菌株鑒定的可靠性。先將待測菌株的純培養(yǎng)菌落接入無菌水中，振蕩器震蕩制成細胞懸液，然后用多道移液槍接種于96孔GNIII鑒定板上培養(yǎng)，再用BiologMicrostation軟件讀取數(shù)據(jù)，確定碳源利用情況。通過與BIOLOG系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫MicroLogsoftware (Release Version 4. 20. 04)比對，可知待測菌株的分類。將HMB22277菌株送交中國農業(yè)大學，利用Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)進行鑒定分類，結果菌株HMB22277屬于短小芽孢桿菌(B. pumilus) o綜合以上形態(tài)特征、16S rDNA序列同源性對比分析，以及生理生化特征鑒定的結果，可知HMB22277屬于短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，并且和現(xiàn)有的芽孢桿菌菌株不同，是ー個新菌株。本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果(I)本發(fā)明短小芽孢桿菌HMB22277對棉鈴疫病針對性強，為棉鈴疫病防治提供了一個有效途徑；(2)本發(fā)明對棉鈴疫病的防效高，平均防效在77%以上；(3)本發(fā)明微生物菌劑對人、畜安全，沒有環(huán)境污染；(4)利用本發(fā)明防治棉鈴疫病不易產生抗藥性；(5)本發(fā)明制備方法簡單、成本低、使用方便。


圖I.為短小芽孢桿菌HMB22277對棉鈴疫病菌的拮抗作用圖，其中A為短小芽孢桿菌HMB22277，B為棉鈴疫病菌。圖2.為HMB22277菌株根據(jù)16S rDNA序列獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。
具體實施例方式下面以具體實施例來進ー步清楚地解釋本發(fā)明，但是不以任何方式構成對本發(fā)明的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法；下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為重量百分含量。實施例1HMB22277微生物菌劑的制備 按照如下方法進行(I)菌種活化將保存于-40 0C的短小芽孢桿菌(Baci I Ius pumi Ius)菌株HMB22277(已于2011年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5615)在LB平板培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比例為胰蛋白胨Ig,酵母提取物0. 5g，氯化鈉lg，瓊脂粉15g，水IOOOmL)上在30°C進行活化，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比例為胰蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，氯化鈉lg，瓊脂粉15g，水IOOOmL)上在30°C下培養(yǎng)24小時，得活化的菌株；(2)種子液的制備按常規(guī)方法制作LB液體培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比例為胰蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，氯化鈉lg，水IOOOmL),在250mL三角瓶中裝入LB培養(yǎng)液IOOmL,高壓濕熱滅菌，待溫度降到室溫后，每瓶中接入步驟(I)中一接種環(huán)上述活化好的菌株，在搖床上進行振蕩培養(yǎng)，在轉速190rpm，溫度為30°C下培養(yǎng)24h小時，得種子液；(3)蔗糖豆餅培養(yǎng)基的制備按照重量比例將蔗糖30g，豆餅粉20g，NaCl lg，CaCO33g，KH2PO4 0. 2g和MgSO4 7H20 0. 3g加入水IOOOmL中，攪拌混合均勻，即得蔗糖豆餅培養(yǎng)基；分裝于500mL三角瓶中，每瓶200mL ;在121°C對蔗糖豆餅培養(yǎng)基進行滅菌30分鐘，再降溫到30°C備用；(4)發(fā)酵培養(yǎng)向步驟(3)所得每瓶蔗糖豆餅培養(yǎng)基200mL中接種步驟⑵所得種子液2mL ;在30°C、搖床轉速190rpm條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)36h，以后每隔30分鐘從三角瓶中取樣進行鏡檢，對視野中的芽孢和總菌體數(shù)進行計數(shù)，并計算芽孢率(芽孢率)=成熟芽孢數(shù)パ成熟芽孢數(shù)+菌體數(shù))X 100);芽孢率達到90%時，停止發(fā)酵培養(yǎng)；共發(fā)酵培養(yǎng)約45 50h，所得即為短小芽孢桿菌HMB22277的液體制劑。實施例2短小芽孢桿菌HMB22277對棉鈴疫病菌的拮抗作用試驗(一 )、試驗時間和地點2010年8月上旬在河北省農林科學院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室內進行。( ニ)試驗方法(I)供試棉鈴疫病菌來源棉鈴疫病菌5-1采自河北省滄州市獻縣河街鎮(zhèn)河街村棉株病鈴，經河北省農林科學院植物保護研究所分離純化，河北農業(yè)大學植物保護學院植物病理系鑒定為芒麻疫霉(Phytophthora boehmeriae),致病力測定表現(xiàn)為強致病力。(2)平板對峙實驗首先將棉鈴疫病菌5-1在PDA平板上活化，培養(yǎng)5天后在菌落邊緣區(qū)域，用打孔器(0=6mm)打孔制成菌片，將棉鈴疫病菌菌片轉接在另ー個PDA平板中央，再將活化后的短小芽孢桿菌HMB22277點接在距指示菌菌片2. 0厘米處，設空白對照(不點接HMB22277菌株的棉鈴疫病菌生長情況)。25°C恒溫培養(yǎng)，待空白對照即將長滿整個培養(yǎng)皿吋，測量棉鈴疫病菌的對照生長量(菌落半徑)和處理生長量(接種HMB22277后的抑制生長半徑)，拮抗作用用抑菌率(計算公式抑菌率(％)=(對照生長量-處理生長量)/對照生長量X 100)表示。(三)結果(表I)短小芽孢桿菌HMB22277對棉鈴疫病菌的抑制率達85.71 %;透明的抑菌帶寬11. O毫米(見圖I);說明短小芽孢桿菌HMB22277對棉鈴疫病具有明顯的抑制作用，具有防治棉鈴疫病的生防潛力。表1HMB22277對棉鈴疫病菌的拮抗作用試驗結果
權利要求
1.一種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)菌株HMB22277，已于2011年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5615。
2.利用權利要求I所述的短小芽孢桿菌HMB22277生產的微生物菌劑，其特征在于其活性成分為短小芽孢桿菌HMB22277菌體和它的胞外代謝產物。
3.按照權利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于為液體制劑。
4.按照權利要求2所述的微生物菌劑，其特征在于短小芽孢桿菌HMB22277的活菌數(shù)大于 8. 37X 108cfu/mL。
5.權利要求2所述的微生物菌劑的制備方法，具體包括如下步驟 (1)將低溫保存的HMB22277菌株在LB平板培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基上30°C培養(yǎng)24 36小時，得活化的菌株； (2)用無菌的接種環(huán)刮取一環(huán)步驟(I)活化的菌株接種到IOOmLLB液體培養(yǎng)基中，在26 34°C、，搖床轉速為170 210rpm的條件下培養(yǎng)22 25小時，得種子液； (3)按照體積比為0.5% 3. 0%的比例將步驟(2)的種子液接入到蔗糖豆餅粉培養(yǎng)基中，在溫度為28 34°C，搖床轉速為170 210rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)36 54h ;所述的蔗糖豆餅粉培養(yǎng)基，其組成成分及其重量百分比為蔗糖2. 0 3. 0%，豆餅粉I. 6 2. 4%，NaCl 0. I 0. 2 %，CaCO3 0. I 0. 3 %，KH2PO4 0. 01 0. 03 % 和 MgSO4 7H20 0. 01 0. 03%，其余為水； (4)檢測發(fā)酵液中菌體數(shù)量,待發(fā)酵液中成熟芽孢占到芽孢和菌體總數(shù)的90%時，停止發(fā)酵培養(yǎng)；所得即為HMB22277菌株的液體制劑。
6.按照權利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟(3)中所述的溫度為30 32。。。
7.按照權利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟(3)中所述的搖床轉速為210rpmo
8.按照權利要求5所述的制備方法，其特征在于其步驟(3)中所述的培養(yǎng)時間為48h。
9.權利要求I所述的短小芽孢桿菌HMB22277在防治棉鈴疫病上的應用。
10.權利要求2所述的微生物菌劑在防治棉鈴疫病上的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于防治棉鈴疫病的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)菌株HMB22277，已于2011年12月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No.5615。本發(fā)明還公開了利用該微生物生產的微生物菌劑及其制備方法，其活性成分為短小芽孢桿菌HMB22277菌體和它的胞外代謝產物。本發(fā)明短小芽孢桿菌HMB22277對棉鈴疫病針對性強，而且防效高，平均防效在77％以上；其次，本發(fā)明微生物菌劑對人、畜安全，沒有環(huán)境污染問題；也不易產生抗藥性；此外本發(fā)明微生物菌劑制備方法簡單、成本低、使用方便。
文檔編號A01P3/00GK102732444SQ201210028108
公開日2012年10月17日 申請日期2012年2月9日 優(yōu)先權日2012年2月9日
發(fā)明者李寶慶, 李社增, 郭慶港, 馬平, 鹿秀云 申請人:河北省農林科學院植物保護研究所