本發(fā)明涉及一種從凝結(jié)芽孢桿菌補(bǔ)料分批發(fā)酵液中提取蛋白質(zhì)的方法，具體是將凝結(jié)芽孢桿菌進(jìn)行分批補(bǔ)料培養(yǎng)后得到的發(fā)酵液，經(jīng)過(guò)低溫離心、硫酸銨分級(jí)沉淀、低溫離心、取沉淀，用緩沖溶液溶解，再進(jìn)行透析、冷凍干燥，提取出凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景
凝結(jié)芽胞桿菌(Bacillus coagulans)，是革蘭染色陽(yáng)性菌，菌體呈桿形，單個(gè)或成短鏈，有運(yùn)動(dòng)性。其主要特征與普通乳酸菌十分相似，因抑菌效果突出而迅速發(fā)展成為國(guó)際市場(chǎng)上新一代益生菌保健產(chǎn)品。凝結(jié)芽胞桿菌是極溫和的益生菌，并未有不良反應(yīng)報(bào)道，是經(jīng)美國(guó)FDA批準(zhǔn)的一種“普遍認(rèn)為安全”的乳酸菌(1992年美國(guó)FDA公布了5種芽胞桿菌為可以用作飼料的安全菌株，凝結(jié)芽胞桿菌名列第一位)。用于微生態(tài)制劑的枯草芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌雖名為減毒或無(wú)毒菌株，但安全性仍不如凝結(jié)芽胞桿菌。凝結(jié)芽胞桿菌不但本身可以被制作成微生物菌劑和微生物肥料，其產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)也是種類豐富，如細(xì)菌素、酶類、激素等。因此，凝結(jié)芽胞桿菌是目前最具市場(chǎng)潛力的一種芽胞桿菌，國(guó)內(nèi)外多把凝結(jié)芽胞桿菌作為重要的微農(nóng)用微生態(tài)制劑出發(fā)菌，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。
代謝產(chǎn)物是靠菌種來(lái)完成的。菌種越多，并且處于最佳生產(chǎn)狀態(tài)，產(chǎn)量就會(huì)越大。菌體發(fā)酵液中成分復(fù)雜，在如此復(fù)雜的體系中，抑菌物質(zhì)的分離純化要根據(jù)研究工作的類型而定。常規(guī)的蛋白質(zhì)分離技術(shù)對(duì)于抗菌蛋白的提取是可行的，但是作為性質(zhì)特異的物質(zhì)如脂類等，結(jié)構(gòu)性質(zhì)差異大，分子量一般較小，某些常規(guī)的蛋白層析、電泳技術(shù)并不適合需要進(jìn)一步改進(jìn)，因此給抗菌蛋白的分離純化工作帶來(lái)極大阻礙。
與陶黎明等人用有機(jī)溶劑沉淀分離提取蛋白質(zhì)的方法相比較，本發(fā)明中利用硫酸銨分級(jí)沉淀的方法分離出蛋白質(zhì)，顯著降低有機(jī)溶劑對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞，避免抑菌蛋白質(zhì)失活，不需要低溫下提取，簡(jiǎn)化操作流程。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)當(dāng)前凝結(jié)芽孢桿菌制劑普遍存在貨架期期短的難題，提供了一種從凝結(jié)芽孢桿菌補(bǔ)料分批發(fā)酵液中提取蛋白質(zhì)的方法，此方法不僅工藝簡(jiǎn)單、提取率高，而且提高了不同分子量蛋白質(zhì)的得率，為新型微生態(tài)制劑的生產(chǎn)提供模板。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種從凝結(jié)芽孢桿菌補(bǔ)料分批發(fā)酵液中提取蛋白質(zhì)的方法，其具體步驟如下：
(1)補(bǔ)料分批發(fā)酵：將凝結(jié)芽孢桿菌菌株接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基后培養(yǎng)，選取一個(gè)單菌落，挑取菌體，接入裝有種子液培養(yǎng)基的錐形瓶中，錐形瓶裝液量為錐形瓶體積的18～22％，溫度控制在35～42℃，搖床轉(zhuǎn)速140～200r/min，培養(yǎng)32～48h后，得到種子液。再移取發(fā)酵培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)比為4～8％的種子液接入發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，其中發(fā)酵罐裝液量為發(fā)酵罐體積的25～45％，控制溫度在36～42℃，通入無(wú)菌空氣，通氣量保持在3～6L/(L·min)，攪拌速率140～200r/min，pH值為6.5～7.5，采用流加葡萄糖的方法進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，使發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖濃度保持在80～100g/L，培養(yǎng)32～48h后即為發(fā)酵液；
(2)低溫離心：將步驟(1)中的發(fā)酵液裝入離心管中，置于3～9℃低溫離心機(jī)中離心得到上清液和沉淀，取上清液；
(3)硫酸銨分級(jí)沉淀：將步驟(2)中的得到的上清液置于攪拌儀上，在20～24℃溫度下加入固體硫酸銨，使其飽和度達(dá)相應(yīng)溫度下的20～26％，磁力充分?jǐn)嚢?～4h后，低溫離心收集第一級(jí)沉淀物和第一級(jí)上清液；將得到的第一級(jí)上清液轉(zhuǎn)入燒杯中，并以硫酸銨飽和度15～21％為梯度，繼續(xù)加入固體硫酸銨充分?jǐn)嚢瑁措x心收集到蛋白組分的第二級(jí)沉淀物；重復(fù)上述步驟，收集第三組分的沉淀物；
(4)透析：將步驟(3)中得到的第一、二和三級(jí)沉淀物裝好并懸于含20～30％體積分?jǐn)?shù)Tris堿的蒸餾水中，使懸液中沉淀物的濃度達(dá)到5～15mg/mL；將懸液移至透析袋中，排出空氣并密封，透析袋中懸液的裝液量為透析袋體積的35～45％，在溫度為5～10℃條件下，用蒸餾水透析6～10h，期間換液2～4次；再轉(zhuǎn)至緩沖液中，相同溫度條件下繼續(xù)透析28～32h，得蛋白提取液；將提取液冷凍干燥即得到蛋白質(zhì)。
其中凝結(jié)芽胞桿菌菌種的拉丁學(xué)名是：Bacillus coagulans，保藏日期是2012年10月18日，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)是CGMCC No.6681。
優(yōu)選步驟(1)中種子液培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖35～70g/L，酵母膏3～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl4～8g/L，pH為6.5～7.5。
優(yōu)選步驟(1)中發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖35～70g/L，酵母膏3～8g/L，蛋白胨8～15g/L，NaCl 4～8g/L，CaCO310～15g/L,K2HPO4 0.8～1.5g/L，MgSO4·7H2O0.1～0.6g/L，ZnSO4·7H2O 0.005～0.015g/L，MnCl2·4H2O 0.001～0.005g/L，pH為6.5～7.5。
優(yōu)選步驟(2)中低溫離心轉(zhuǎn)速在8000～10000r/min，離心5～9min。
優(yōu)選步驟(3)低溫離心溫度在3～9℃，轉(zhuǎn)速為10000～12000r/min，離心15～19min。
優(yōu)選步驟(4)緩沖液成分：7～9mmol/L Tris-HCl、0.1～0.25mol/L NaCl、0.8～1.2mmol/L乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸。
抑菌活性的檢測(cè)：采取上述方法提取的第一、二、三級(jí)蛋白質(zhì)沉淀物透析冷凍干燥后的物質(zhì)，各稱取4～8μg溶于無(wú)菌蒸餾水中，制備出濃度4～8μg/mL的溶液。中心接有棉花黃萎病病菌菌碟的PDA平板培養(yǎng)48～52h后，于上下左右距離培養(yǎng)皿邊緣2～3cm處用打孔器(d＝6mm)各打一個(gè)孔，在其中三個(gè)孔注入10～8μL溶解后的第一、二、三級(jí)蛋白質(zhì)沉淀物，另一個(gè)空孔以無(wú)菌蒸餾水為對(duì)照。溫度在26～32℃培養(yǎng)48～52h，觀察發(fā)現(xiàn)第二、三級(jí)蛋白質(zhì)組分具有顯著的抑菌效果。
CGMCC No.6681菌株具有下述性質(zhì)：
1、形態(tài)與培養(yǎng)特征：
該菌為革蘭氏染色陽(yáng)性菌，菌體呈桿形，(0.8～1)μm×(3～4)μm，單個(gè)或成短鏈。產(chǎn)生卵圓形芽孢，大多偏菌體一端菌，有的孢子囊膨脹，有運(yùn)動(dòng)性。對(duì)外界環(huán)境抵抗力很強(qiáng)，90℃處理10min，100℃處理5min不會(huì)失活，pH值為4.0～9.0時(shí)也能生長(zhǎng)。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上邊緣不整齊，呈扁平圓形白色菌落，2～3mm大小。兼性厭氧菌，生長(zhǎng)溫度為20～55℃，最適生長(zhǎng)溫度為35～45℃。
2、生理生化特性
凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC No.6681菌株的主要生理生化特征見表1：
表1菌株的生理生化特征
注：+：陽(yáng)性或生長(zhǎng)；－：陰性或不生長(zhǎng)
有益效果：
本發(fā)明提供了一種凝結(jié)芽胞桿菌菌懸液的制備方法。該方法制得菌懸液在植物的體表定殖能力增強(qiáng)，集促生、抑菌和殺蟲于一體，其多種功效決定了其推廣具有非常大的前景，符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的要求。
保藏信息
上述凝結(jié)芽孢桿菌其分類命名為Bacillus coagulans，參據(jù)的微生物(株)為：NJYHHWG 877005，該菌株是本課題組自主篩選并保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京朝陽(yáng)區(qū)大屯路甲3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)。其簡(jiǎn)稱為CGMCC，保藏日期是2012年10月18日，登記入冊(cè)的編號(hào)是CGMCC No.6681。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施案例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。以下例子所述凝結(jié)芽胞桿菌菌株，菌種的拉丁學(xué)名是：Bacillus coagulans，參據(jù)的菌株：NJYHHWG 877005，保藏日期是2012年10月18日，保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)是CGMCC No.6681。
實(shí)施例1
(1)將凝結(jié)芽孢桿菌菌株接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基后培養(yǎng)，選取一個(gè)單菌落，挑取菌體，接入裝有種子液培養(yǎng)基的錐形瓶中，其中，種子液培養(yǎng)基為葡萄糖35g/L，酵母膏3g/L，蛋白胨8g/L，NaCl4g/L，pH為6.5。錐形瓶裝液量為錐形瓶體積的18％，溫度控制在36℃，搖床轉(zhuǎn)速140r/min，培養(yǎng)32h后，得到種子液。再移取發(fā)酵培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)比為4％的種子液接入發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，其中發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖35g/L，酵母膏3g/L，蛋白胨8g/L，NaCl 4g/L，CaCO3 10g/L,K2HPO4 0.8g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，ZnSO4·7H2O0.005g/L，MnCl2·4H2O 0.001g/L，pH為6.5。發(fā)酵罐裝液量為發(fā)酵罐體積的25％，控制溫度在36℃，通入無(wú)菌空氣，通氣量保持在3L/(L·min)，攪拌速率140r/min，pH值為6.5，采用流加葡萄糖的方法進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，使發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖濃度保持在80/L，培養(yǎng)32h后即為發(fā)酵液。
(2)低溫離心：將步驟(1)中的發(fā)酵液裝入離心管中，置于3℃低溫離心機(jī)中低溫離心，轉(zhuǎn)速為8000r/min，離心5min，取上清液；
(3)硫酸銨分級(jí)沉淀：首先將步驟(2)中的得到的上清液置于攪拌儀上，在20℃溫度下加入固體硫酸銨，使其飽和度達(dá)相應(yīng)溫度下的20％，磁力充分?jǐn)嚢?h后，在3℃下低溫離心，轉(zhuǎn)速為10000r/min，離心15min，收集第一級(jí)沉淀物和第一級(jí)上清液；將得到的第一級(jí)上清液轉(zhuǎn)入燒杯中，加入固體硫酸銨充分?jǐn)嚢瑁沽蛩徜@飽和度為35％，同樣條件下離心收集到蛋白組分的第二級(jí)沉淀物。取第二級(jí)上清液加固體硫酸銨，是硫酸銨飽和度達(dá)50％，同樣條件下離心收集即可收集第三組分的沉淀物。
(4)透析：將步驟(3)中得到的第一、二、三級(jí)沉淀物裝好并懸于含20％體積分?jǐn)?shù)Tris堿的蒸餾水中，使懸液中沉淀物的濃度達(dá)到5mg/mL；將懸液移至透析袋中，排出空氣并密封，透析袋中懸液的裝液量為透析袋體積的35％，在溫度為5℃條件下，用蒸餾水透析6h，期間換液2次。再轉(zhuǎn)至緩沖液中，其中緩沖液成分為：7mmol/L Tris-HCl、0.1mol/L NaCl、0.8mmol/L乙二醇-
雙-(2-氨基乙醚)四乙酸，相同溫度條件下繼續(xù)透析28h，得蛋白提取液。
將提取液冷凍干燥即可得到蛋白質(zhì)。
抑菌活性的檢測(cè)：采取上述方法提取的第一、二、三級(jí)蛋白質(zhì)沉淀物透析冷凍干燥后的物質(zhì)，各稱取4μg溶于無(wú)菌蒸餾水中，制備出濃度4μg/mL的溶液。中心接有棉花黃萎病病菌菌碟的PDA平板培養(yǎng)48h后，于上下左右距離培養(yǎng)皿邊緣2cm處用打孔器(d＝6mm)各打一個(gè)孔，在其中三個(gè)孔注入10μL溶解后的第一、二、三級(jí)蛋白質(zhì)沉淀物，另一個(gè)空孔以無(wú)菌蒸餾水為對(duì)照。溫度在26℃培養(yǎng)48h，觀察發(fā)現(xiàn)第二、三級(jí)蛋白質(zhì)組分具有顯著的抑菌效果，抑菌直徑分別達(dá)15.69mm和14.21mm。
實(shí)施例2
(1)將凝結(jié)芽孢桿菌菌株接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基后培養(yǎng)，選取一個(gè)單菌落，挑取菌體，接入裝有種子液培養(yǎng)基的錐形瓶中，其中種子液培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖55g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨11g/L，NaCl6g/L，pH為7，錐形瓶裝液量為錐形瓶體積的20％，溫度控制在39℃，搖床轉(zhuǎn)速170r/min，培養(yǎng)40h后，得到種子液。再移取發(fā)酵培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)比為6％的種子液接入發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，其中發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖55g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨11g/L，NaCl 6g/L，CaCO3 13g/L,K2HPO4 1.2g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，ZnSO4·7H2O 0.011g/L，MnCl2·4H2O 0.003g/L，pH為7，發(fā)酵罐裝液量為發(fā)酵罐體積的35％，控制溫度在39℃，通入無(wú)菌空氣，通氣量保持在5L/(L·min)，攪拌速率170r/min，pH值為7，采用流加葡萄糖的方法進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，使發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖濃度保持在90g/L，培養(yǎng)40h后即為發(fā)酵液。
(2)將步驟(1)中的發(fā)酵液裝入離心管中，置于6℃低溫離心機(jī)中離心，轉(zhuǎn)速為9000r/min，
離心7min，取上清液；
(3)首先將步驟(2)中的得到的上清液置于攪拌儀上，在22℃溫度下加入固體硫酸銨，使其飽和度達(dá)相應(yīng)溫度下的23％，磁力充分?jǐn)嚢?.5h后，在6℃低溫離心溫度，轉(zhuǎn)速為11000r/min，離心17min。收集第一級(jí)沉淀物和第一級(jí)上清液；將得到的第一級(jí)上清液轉(zhuǎn)入燒杯中，繼續(xù)加入固體硫酸銨充分?jǐn)嚢?，使硫酸銨飽和度達(dá)到41％，相同條件下離心收集到蛋白組分的第二級(jí)沉淀物。將第二級(jí)上清液放于另一燒杯中加入固體硫酸銨，使其飽和度達(dá)59％，相同條件下即可收集第三組分的沉淀物。
(4)將步驟(3)中得到的第一、二、三級(jí)沉淀物裝好并懸于含25％體積分?jǐn)?shù)Tris堿的蒸餾水中，使懸液中沉淀物的濃度達(dá)到10mg/mL；將懸液移至透析袋中，排出空氣并密封，透析袋中懸液的裝液量為透析袋體積的40％，在溫度為8℃條件下，用蒸餾水透析8h，期間換液3次。再轉(zhuǎn)至緩沖液中，其中緩沖液成分：8mmol/L Tris-HCl、0.2mol/L NaCl、1.0mmol/L乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸，相同溫度條件下繼續(xù)透析30h，得蛋白提取液。
將提取液冷凍干燥即可得到蛋白質(zhì)。
抑菌活性的檢測(cè)：采取上述方法提取的第一、二、三級(jí)蛋白質(zhì)沉淀物透析冷凍干燥后的物質(zhì)，各稱取6μg溶于無(wú)菌蒸餾水中，制備出濃度6μg/mL的溶液。中心接有棉花黃萎病病菌菌碟的PDA平板培養(yǎng)50h后，于上下左右距離培養(yǎng)皿邊緣2.5cm處用打孔器(d＝6mm)各打一個(gè)孔，在其中三個(gè)孔注入9μL溶解后的第一、二、三級(jí)蛋白質(zhì)沉淀物，另一個(gè)空孔以無(wú)菌蒸餾水為對(duì)照。溫度在29℃培養(yǎng)50h，觀察發(fā)現(xiàn)第二、三級(jí)蛋白質(zhì)組分具有顯著的抑菌效果，抑菌直徑分別達(dá)17.09mm和15.82mm。
實(shí)施例3
(1)菌高密分批補(bǔ)料培養(yǎng)：將凝結(jié)芽孢桿菌菌株接種在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基后培養(yǎng)，選取一個(gè)單菌落，挑取菌體，接入裝有種子液培養(yǎng)基的錐形瓶中，其中種子液培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖70g/L，酵母膏8g/L，蛋白胨15g/L，NaCl 8g/L，pH為7.5。錐形瓶裝液量為錐形瓶體積的22％，溫度控制在42℃，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)48h后，得到種子液。再移取發(fā)酵培養(yǎng)基體積分?jǐn)?shù)比為8％的種子液接入發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，其中發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖70g/L，酵母膏8g/L，蛋白胨15g/L，NaCl 8g/L，CaCO3 15g/L,K2HPO4 1.5g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，ZnSO4·7H2O 0.015g/L，MnCl2·4H2O 0.005g/L，pH為7.5，發(fā)酵罐裝液量為發(fā)酵罐體積的45％，控制溫度在42℃，通入無(wú)菌空氣，通氣量保持在6L/(L·min)，攪拌速率200r/min，pH值為7.5，采用流加葡萄糖的方法進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵，使發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖濃度保持在100g/L，培養(yǎng)48h后即為發(fā)酵液。
(2)將步驟(1)中的發(fā)酵液裝入離心管中，置于9℃低溫離心機(jī)中，離心轉(zhuǎn)速為10000r/min，離心9min，取上清液；
(3)首先將步驟(2)中的得到的上清液置于攪拌儀上，在24℃溫度下加入固體硫酸銨，使其飽和度達(dá)相應(yīng)溫度下的26％，磁力充分?jǐn)嚢?h后，在9℃下低溫離心，轉(zhuǎn)速為12000r/min，離心19min。收集第一級(jí)沉淀物和第一級(jí)上清液；將得到的第一級(jí)上清液轉(zhuǎn)入燒杯中，繼續(xù)加入固體硫酸銨充分?jǐn)嚢?，使硫酸銨飽和度達(dá)47％，相同條件下離心收集到蛋白組分的第二級(jí)沉淀物。將第二級(jí)上清液置于另一燒杯中，添加硫酸銨固體充分?jǐn)嚢瑁蛊滹柡投冗_(dá)68％，相同條件下離心收集第三組分的沉淀物。
(4)將步驟(3)中得到的第一、二、三級(jí)沉淀物裝好并懸于含30％體積分?jǐn)?shù)Tris堿的蒸餾水中，使懸液中沉淀物的濃度達(dá)到15mg/mL；將懸液移至透析袋中，排出空氣并密封，透析袋中懸液的裝液量為透析袋體積的45％，在溫度為10℃條件下，用蒸餾水透析10h，期間換液4次。再轉(zhuǎn)至緩沖液中，其中緩沖液成分：9mmol/L Tris-HCl、0.25mol/L NaCl、1.2mmol/L乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸，相同溫度條件下繼續(xù)透析32h，得蛋白提取液。將提取液冷凍干燥即可得到蛋白質(zhì)。
抑菌活性的檢測(cè)：采取上述方法提取的第一、二、三級(jí)蛋白質(zhì)沉淀物透析冷凍干燥后的物質(zhì)，各稱取8μg溶于無(wú)菌蒸餾水中，制備出濃度8μg/mL的溶液。中心接有棉花黃萎病病菌菌碟的PDA平板培養(yǎng)52h后，于上下左右距離培養(yǎng)皿邊緣3cm處用打孔器(d＝6mm)各打一個(gè)孔，在其中三個(gè)孔注入8μL溶解后的第一、二、三級(jí)蛋白質(zhì)沉淀物，另一個(gè)空孔以無(wú)菌蒸餾水為對(duì)照。溫度在32℃培養(yǎng)52h，觀察發(fā)現(xiàn)第二、三級(jí)蛋白質(zhì)組分具有顯著的抑菌效果，抑菌直徑分別達(dá)18.13mm和16.22mm。