本發(fā)明涉及一種凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的方法，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

凝結(jié)芽孢桿菌又被稱芽孢乳酸菌，屬于革蘭氏陽性菌，兼性厭氧型，能夠產(chǎn)生乳酸，可產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，抑制某些腐敗和病原微生物生長。由于其對人體無毒無害，且不改變食品本身的特性，可以應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域?？梢栽趧游锬c道中對腸道致病菌有較佳的抑制力，可以應(yīng)用于醫(yī)療保健領(lǐng)域。

有關(guān)研究表明，凝結(jié)孢桿菌可產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，但由于該類產(chǎn)物依賴于發(fā)酵條件的控制，且發(fā)酵產(chǎn)物成分復(fù)雜，其含量較低，提高凝結(jié)芽孢桿菌抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量對于制備抑菌活性物質(zhì)，促進其廣泛應(yīng)用有極大的必要性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的培養(yǎng)基，含有淀粉8-12g/L，酵母浸膏18-22g/L，CaCl₂14-16g/L，pH為7.0。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述培養(yǎng)基含有可溶性淀粉10g/L,酵母浸膏20g/L，CaCl₂15g/L。

本發(fā)明的第二個目的在于提供一種凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的方法，是將凝結(jié)芽孢桿菌接種至所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20～28h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述接種是以接種量2～5mL菌液/100mL培養(yǎng)基進行接種。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述培養(yǎng)是在37℃，200～220rpm。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述接種是接種凝結(jié)芽孢桿菌種子液；所述種子液是以單菌落接種至LB培養(yǎng)基，37℃，200～220r/min培養(yǎng)8～20h獲得。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述凝結(jié)芽孢桿菌為CGMCC 1.949。

本發(fā)明的第三個目的是提供所述方法生產(chǎn)的抑菌活性物質(zhì)。

本發(fā)明的第四個目的是提供所述抑菌活性物質(zhì)在制備食品添加劑、抑菌劑方面的應(yīng)用。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述食品添加劑包括食品防腐劑，保鮮劑。

有益效果：通過培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化，使得凝結(jié)芽孢桿菌1.949菌株產(chǎn)生抑菌多肽含量由原來的1.507mg/mL提高為2.846mg/mL，以金黃色葡萄菌作為指示菌，測定抑菌圈直徑，其抑制效果與0.5mg/mL的氨芐青霉素以及0.05mg/mL的硫酸卡那霉素作用效果相當(dāng)。對其日后用于食品防腐劑及保健品領(lǐng)域打下良好基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為LB培養(yǎng)基中凝結(jié)芽孢桿菌抑菌圈大??；

圖2為碳源對凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響；

圖3為氮源對凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響；

圖4為無機鹽對菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響；

圖5為不同培養(yǎng)基下凝結(jié)芽孢桿菌抑菌效果圖(從左到右依次為實施例5-7)

圖6為不同蛋白酶對菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的活性影響(1，酸性蛋白酶處理，2，中性蛋白酶處理，3，胰蛋白酶處理)。

具體實施方式

培養(yǎng)基：

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，NaCl 10，蛋白胨10，pH7.0

LB固體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，NaCl 10，蛋白胨10，瓊脂1.5-2，pH 7.0

種子培養(yǎng)：挑取單菌落接種至LB培養(yǎng)基，37℃200～220r/min培養(yǎng)8～20h。

發(fā)酵條件：接種量2～5mL菌液/100mL發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件37℃，200～220r/min，發(fā)酵24h。

改良牛津杯法：倒5ml瓊脂固體培養(yǎng)基(體積比為1.5％-2％瓊脂溶于去離子水)于培養(yǎng)皿底部，放置牛津杯，當(dāng)LB固體培養(yǎng)基溫度降低到40℃后，向其添加指示菌(每100mL培養(yǎng)基添加指示菌2mL)，搖勻制備固體培養(yǎng)基，待其凝固后，用無菌鑷子取出牛津杯，每孔加入100μL離心后發(fā)酵上清液。放入4℃冰箱擴散1h，再放入37℃培養(yǎng)箱生長24h。

抑菌圈測量：外圈抑菌圈直徑與內(nèi)圈牛津杯直徑(8cm)差值為最終抑菌圈直徑。

還原糖的測定：采用DNS法，首先繪制葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將發(fā)酵液上清液適當(dāng)稀釋后，取2ml準(zhǔn)確加入1.5mlDNS試劑沸水浴5min，放置室溫下待其冷卻，用超純水定容至25ml，測定其在520nm處吸光值。根據(jù)之前繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出發(fā)酵液的還原糖總量。

蛋白含量的測定：考馬斯亮藍法，首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將發(fā)酵液上清液適當(dāng)稀釋，取稀釋后的樣品1ml加4ml的考馬斯亮藍，室溫反應(yīng)兩分鐘，在595nm處測定吸光度。根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量。

總糖的測定：苯酚硫酸法，首先繪制葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸取適當(dāng)稀釋后的發(fā)酵液2mL，加入1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6％的苯酚溶液,再緩慢地添加5mL濃硫酸，搖勻，在室溫下充分反應(yīng)20min，測490nm處測吸光值。根據(jù)提前繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算發(fā)酵液中總糖含量。

多肽含量測定：采用雙縮脲法，取上清液1ml并準(zhǔn)確添加4ml的雙縮脲試劑，混合搖勻后于室溫下反應(yīng)30min，測定其在540nm處吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算發(fā)酵液中多肽含量。

實施例1

以LB培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，采用改良牛津杯法，以金黃色跑葡萄球菌作為指示菌，其產(chǎn)生抑菌圈如圖1所示，經(jīng)測定，抑菌圈直徑平均值為18.3mm。對發(fā)酵液中多肽含量進行測定，結(jié)果顯示，抑菌多肽含量為1.507mg/mL。

實施例2

以LB培養(yǎng)基作為初始培養(yǎng)基，分別以2g/100mL的添加量加入甘露醇，葡萄糖，蔗糖，可溶性淀粉，采用改良牛津杯法，以金黃色葡萄球菌作為指示菌，測定抑菌圈直徑，其中添加可溶性淀粉的培養(yǎng)基發(fā)酵后測得抑菌圈最大為13mm，結(jié)果如圖2。

實施例3

以LB培養(yǎng)基作為初始培養(yǎng)基，分別以1g/100mL的添加量加入蛋白胨，魚粉蛋白胨，酵母浸膏，尿素；采用改良牛津杯法，以金黃色葡萄球菌作為指示菌，測定抑菌圈直徑，其中添加酵母浸膏的培養(yǎng)基發(fā)酵后測得抑菌圈最大為12mm，結(jié)果如圖3。

實施例4

以LB培養(yǎng)基作為初始培養(yǎng)基，分別以1g/100mL加入CaCl₂，KCl，NaCl，采用改良牛津杯法，以金黃色跑葡萄球菌作為指示菌，測定抑菌圈直徑，其中添加CaCl₂的培養(yǎng)基發(fā)酵后測得抑菌圈最大為10mm，結(jié)果如圖4。

實施例5

以可溶性淀粉10g/L，酵母浸膏15g/L，CaCl₂ 15g/L配制發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)初始pH為7，在37℃，220r/min，發(fā)酵24h，采用改良牛津杯法，以金黃色葡萄球菌作為指示菌，測定抑菌圈直徑22mm(如圖5所示)。

實施例6

實施方式同實施例5，其區(qū)別在于，改變酵母浸膏添加量為20g/L，測定抑菌圈直徑24mm。(如圖5所示)

實施例7

實施方式同實施例5，其區(qū)別在于，改變可溶性淀粉添加量為5g/L，測定抑菌圈直徑20mm。(如圖5所示)

實施例8

實施方式同實施例5，其區(qū)別在于，改變酵母浸膏添加量為15g/L，測定抑菌圈直徑19mm。

實施例9

實施方式同實施例5，其區(qū)別在于，改變CaCl₂添加量為5g/L，測定抑菌圈直徑13mm。

實施例10

實施方式同實施例5，其區(qū)別在于，改變可溶性淀粉添加量為15g/L，測定抑菌圈直徑14mm。

實施例11

實施方式同實施例5，其區(qū)別在于，調(diào)節(jié)初始pH為6，采用改良牛津杯法，以金黃色葡萄球菌作為指示菌，未見透明圈出現(xiàn)。

實施例12

實施方式同實施例11，其區(qū)別在于，改變初始培養(yǎng)基pH為8，采用改良牛津杯法，以金黃色葡萄球菌作為指示菌，未見透明圈出現(xiàn)。

實施例13

以淀粉10g/L，酵母浸膏20g/L，CaCl₂ 15g/L配制發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)初始pH為7，在37℃，220r/min，發(fā)酵20h，采用改良牛津杯法，以金黃色葡萄球菌作為指示菌，測定抑菌圈直徑為19mm。

實施例14

實施方式同實施例13，其區(qū)別在于，改變發(fā)酵時間為22h，測定抑菌圈直徑22mm。

實施例15

實施方式同實施例13，其區(qū)別在于，改變發(fā)酵時間為26h，測定抑菌圈直徑24mm。

實施例16

實施方式同實施例13，其區(qū)別在于，改變發(fā)酵時間為28h，隨著發(fā)酵時間增加，抑菌物質(zhì)有部分被分解失活。發(fā)酵28h后測定抑菌圈直徑為20mm。

實施例17

將實施例6獲得的凝結(jié)芽孢桿菌株菌發(fā)酵液在4℃，12000r/min離心5min，對上清液中還原糖，總糖，蛋白質(zhì)，多肽含量進行測定。

結(jié)果顯示，凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生的活性抑菌物質(zhì)中，含有總糖6.515mg/mL，還原糖0.908mg/mL，多肽2.846mg/mL，蛋白質(zhì)0.624mg/mL。

實施例18

檢測抑菌活性物質(zhì)對不同蛋白酶的敏感度，菌株上清液用酸性蛋白酶，中性蛋白酶，胰蛋白酶分別在相應(yīng)的最適條件下作用，然后進行作用前后的抑菌活性分析比對，先把三種蛋白酶用pH6.5，3mmol/L的磷酸鹽緩沖液配成質(zhì)量濃度為1mg/mL母液，分別加入發(fā)酵上清液中，調(diào)節(jié)pH值至三種酶的最適pH值，以不加酶的發(fā)酵上清液作為空白對照，37℃水浴保溫2h，冷卻后用1mol/L的HCl溶液或1mol/L的NaOH溶液調(diào)整各酶解液pH值至6.5，然后以金黃色葡萄球菌為指示菌進行改良牛津杯實驗測定抑菌圈直徑大小。如圖6所示，發(fā)現(xiàn)抑菌物質(zhì)經(jīng)酸性蛋白酶處理上清液中抑菌物質(zhì)仍保留活性，而中性蛋白酶，胰蛋白酶處理后活性消失。初步判斷抑菌物質(zhì)活性主要與里面的蛋白質(zhì)和多肽有關(guān)。

采用氨芐青霉素和硫酸卡那霉素進行對照實驗，選取濃度為50mg/mL的兩種抗生素作為母液，分別稀釋原來的10，10^-2，10^-3,10^-4,10^-5,10^-6倍，以金黃色葡萄球菌作為指示菌進行抑菌實驗，與實施例7獲得的發(fā)酵上清液抑菌圈大小比較，經(jīng)過抑菌圈測定發(fā)現(xiàn)含有2.846mg/mL抑菌多肽的發(fā)酵液(對應(yīng)24mm抑菌圈)的抑菌圈效果與同等抑菌圈大小的0.5mg/mL的氨芐青霉素以及0.05mg/mL的硫酸卡那霉素作用效果相當(dāng)。

實施例19

選取革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌；選取革蘭氏陰性菌大腸桿菌，銅綠假單胞菌；選取一種真菌類釀酒酵母使其菌濃都控制在9lg(CFU/mL)進行凝結(jié)芽孢桿菌抑菌物質(zhì)的抑菌譜實驗。發(fā)現(xiàn)該株凝結(jié)芽孢桿菌抑菌產(chǎn)物對革蘭氏陽性菌有較好的抑菌效果(見表1)，對釀酒酵母無明顯抑菌作用。

表1凝結(jié)芽孢桿菌1.949對不同微生物的抑菌效果