本發(fā)明涉及生化技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種利用T4噬菌體DNA拓撲異構(gòu)酶I連接DNA片段的方法。
背景技術(shù)：
隨著科技的發(fā)展，各種新的技術(shù)逐漸出現(xiàn)在人們的生產(chǎn)和應(yīng)用中，克隆技術(shù)就是其中一種。克隆是指生物體通過體細胞進行的無性繁殖，以及由無性繁殖形成的基因型完全相同的后代個體組成的種群。通常是利用生物技術(shù)由無性生殖產(chǎn)生與原個體有完全相同基因的個體或種群。目前常規(guī)基因克隆方法是利用T4 DNA連接酶（T4 DNA ligase）的方法將待克隆的目的基因與載體連接，將重新成環(huán)的重組子轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌細胞中，然后篩選鑒定正確的克隆。但是該方法涉及的步驟多，并且各種繁瑣，耗費時間多。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種利用T4噬菌體DNA拓撲異構(gòu)酶I連接DNA片段的方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種利用T4噬菌體DNA拓撲異構(gòu)酶I連接DNA片段的方法，具體步驟如下：
步驟一，設(shè)計引物：對至少兩個待連接的DNA片段分別設(shè)計引物，每條待連接片段設(shè)計正向引物和反向引物，引物結(jié)構(gòu)為，相鄰連接處前一DNA片段的反向引物和后一DNA片段的正向引物的5`到3`端依次包含接頭DNA序列、T4噬菌體DNA拓撲異構(gòu)酶I識別位點的DNA序列以及與相應(yīng)模板配對的DNA序列，其中所述前一DNA片段的反向引物和后一DNA片段的正向引物中的接頭序列反向互補配對，不同連接所用的互補接頭片段序列各不相同；
步驟二，片段擴增：將相應(yīng)的待連接DNA片段為模板，以各自的引物進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物，然后對擴增產(chǎn)物進行純化；
步驟三，片段連接：將步驟二中得到的純化后的各擴增產(chǎn)物進行混合，加入T4噬菌體DNA拓撲異構(gòu)酶I，在37℃下反應(yīng)15min，得到完成連接的DNA片段。
作為本發(fā)明進一步的方案：T4噬菌體DNA拓撲異構(gòu)酶I識別位點為XGCYA,其中X為T或C，Y為T或G。
作為本發(fā)明進一步的方案：引物中包含的接頭DNA序列為至少4個核苷酸。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的DNA片段連接方法利用了T4噬菌體DNA拓撲異構(gòu)酶I同時實現(xiàn)酶切與連接的功能，傳統(tǒng)的方法需要先利用限制性內(nèi)切酶使DNA片段產(chǎn)生相匹配的末端，純化后利用T4連接酶連接片段，因此具有更快捷高效的特點，本發(fā)明的方法中待連接片段內(nèi)部的序列不會對連接產(chǎn)生影響，消除了傳統(tǒng)方法中酶切步驟的缺陷。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施方式對本專利的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。
實施例1
一種利用T4噬菌體DNA拓撲異構(gòu)酶I連接DNA片段的方法，具體步驟如下：
步驟一，設(shè)計引物：對2個長度為1.5kb的DNA片段進行連接，引物A、B與引物C、D各擴增一個長度為1.5kb片段，其中引物A、D僅含有與模板互補的序列，引物B、C從5`到3`端依次包含接頭DNA序列、T4噬菌體DNA拓撲異構(gòu)酶I識別位點DNA序列以及模板配對的DNA序列，引物2、3的接頭DNA序列反向互補。DNA片段的來源、大小和引物A、B、C以及D見表1
表1 DNA片段和引物
粗體字母表示接頭序列，下劃線表示T4噬菌體DNA拓撲異構(gòu)酶I識別位點序列。
步驟二，片段擴增：將相應(yīng)的待連接DNA片段為模板，以各自的引物進行PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物，然后用Gel Extration DNA purification Kit回收和純化PCR產(chǎn)物。PCR的組分和體積見表2。
表2 PCR的組分和體積
PCR反應(yīng)的步驟如表3
表3 PCR反應(yīng)的步驟
步驟三，片段連接：將步驟二中得到的純化后的各擴增產(chǎn)物進行混合，加入T4噬菌體DNA拓撲異構(gòu)酶I，在37℃下反應(yīng)15min，得到完成連接的DNA片段，反應(yīng)的組分和體積見表4。
表4 反應(yīng)的組分和體積
向連接產(chǎn)物中加入3 μl 6X Stop Buffer (0.6%SDS, 30mM EDTA pH 8.0)來終止反應(yīng)，將片段1、2與連接產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，結(jié)果中可見出現(xiàn)明顯的3kb 的DNA條帶，證明連接成功。
上面對本專利的較佳實施方式作了詳細說明，但是本專利并不限于上述實施方式，在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本專利宗旨的前提下做出各種變化。