本發(fā)明屬于流腦A群疫苗制備領(lǐng)域，具體地，涉及一種利于多糖-ADH衍生物質(zhì)量控制的工藝。
背景技術(shù)：
：腦膜炎奈瑟菌（N.meningitidis）簡稱為腦膜炎球菌（meningococcus），是流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦）的病原菌。一百多年來，流腦一直在世界各地流行或散在發(fā)生，是人類的主要急性呼吸道傳染病之一。很多國家經(jīng)過長期的流行病學(xué)監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)此病具有周期性流行的特點。意大利發(fā)現(xiàn)1915-1934年在其國內(nèi)發(fā)生了三次流行。我國也出現(xiàn)過五次全國性大流行，在1938、1949、1959、1967及1977年，約每8-10年出現(xiàn)一次流行高峰。據(jù)WHO報告，近十余年來發(fā)病率平均為2.5/10萬。當(dāng)今世界各大洲發(fā)病率在1/10萬-10/10萬，國內(nèi)1967年的大流行，全國發(fā)病率及病死率均較高。發(fā)病數(shù)占傳染數(shù)的第四位，而死亡數(shù)占全部傳染病死亡數(shù)的60%，嚴(yán)重危害人民健康及影響計劃生育。其主要的特點為：易感人群主要是為兒童，以爆發(fā)型病死率最高，可達(dá)40%-60%。流腦的預(yù)防，主要采取以疫苗接種為主的預(yù)防措施。1980年，我國正式生產(chǎn)A群NM多糖疫苗，推廣應(yīng)用取得了很好的效果。但多糖疫苗對2歲以下的嬰幼兒預(yù)防效果較差，結(jié)合疫苗的研制成功解決了疫苗在嬰幼兒中無效的問題。結(jié)合疫苗比以往的疫苗具有更強(qiáng)的免疫原性和更好的免疫效果。制備流腦A群結(jié)合疫苗首先要獲得由流腦A群莢膜多糖生成的多糖-ADH衍生物，而目前傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式生產(chǎn)流腦A群莢膜多糖需要先將流腦A群菌種經(jīng)過培養(yǎng)、發(fā)酵后得到上清液，再將上清液進(jìn)行純化處理得到，而采用該傳統(tǒng)方式生產(chǎn)的流腦A群發(fā)酵液中含有較多的核酸及蛋白等雜質(zhì)成分，一方面影響了多糖-ADH衍生物的質(zhì)量，另一方面增加了后續(xù)純化的難度。而且上述純化處理中通常需要用到較多的苯酚，而苯酚作為一種有毒物質(zhì)，大量使用會造成環(huán)境的污染且影響多糖的質(zhì)量。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種能夠解決上述技術(shù)問題的利于多糖-ADH衍生物質(zhì)量控制的工藝。本發(fā)明解決上述問題所采用的技術(shù)方案是：利于多糖-ADH衍生物質(zhì)量控制的工藝，包括流腦A群菌種的培養(yǎng)、發(fā)酵、純化，以及流腦A群莢膜多糖的活化和衍生；其中，流腦A群菌種的培養(yǎng)、發(fā)酵、純化具體為：1）開啟菌種及傳代：開啟流腦A群菌種傳代至氯化血紅素流腦半綜合培養(yǎng)基上，放入二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中，36.5℃，8%CO2培養(yǎng)，二代采用半綜合固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，三代采用流腦半綜合液體培養(yǎng)基在恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)；2）接種到種子罐培養(yǎng)：將上述步驟1）培養(yǎng)得到的流腦A群種子接種到種子罐，恒溫攪拌通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)至第五代；3）發(fā)酵罐發(fā)酵：將上述步驟2）培養(yǎng)得到的流腦A群五代種子接種入發(fā)酵罐后，恒溫36.5℃，深層通氣240rpm攪拌培養(yǎng)，中途補(bǔ)加葡萄糖溶液為流腦A群細(xì)菌生產(chǎn)莢膜多糖提供原料，培養(yǎng)流腦A群細(xì)菌至對數(shù)生長期后期或靜止期前期，此時菌濃度達(dá)到100-200億/mL，甲醛殺菌后去除菌體，收集發(fā)酵液上清液；4）一次純化：加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度1.0g/L，充分?jǐn)嚢韬箪o置過夜，離心收集多糖，沉淀的多糖用氯化鈣溶液攪拌3小時使多糖和十六烷基三甲基溴化銨解離，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為25%（v/v），2-8℃靜置過夜，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為75-80%（v/v），充分振搖使多糖沉淀，靜置18小時以上，離心收集沉淀，然后用無水乙醇和丙酮各洗三次，得到粗糖；5）二次純化：將粗糖溶解于10%飽和中性醋酸鈉溶液中，然后按粗糖與苯酚之比為4:3（v/v）的比例加入苯酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，抽提1-3次至上清液澄清，收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸，超濾后的多糖溶液中加入4mol/LNaCl溶液，至NaCl終濃度為0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇終濃度為75%（v/v），充分混勻后2-8℃靜置過夜，沉淀多糖，離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次。利于多糖-ADH衍生物質(zhì)量控制的工藝，包括以下步驟：1）開啟菌種及傳代：開啟流腦A群菌種傳代至氯化血紅素流腦半綜合培養(yǎng)基上，放入二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中，36.5℃，8%CO2培養(yǎng)，二代采用半綜合固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，三代采用流腦半綜合液體培養(yǎng)基在恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)；2）接種到種子罐培養(yǎng)：將上述步驟1）培養(yǎng)得到的流腦A群種子接種到種子罐，恒溫攪拌通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)至第五代；3）發(fā)酵罐發(fā)酵：將上述步驟2）培養(yǎng)得到的流腦A群五代種子接種入發(fā)酵罐后，恒溫36.5℃，深層通氣240rpm攪拌培養(yǎng)，中途補(bǔ)加葡萄糖溶液為流腦A群細(xì)菌生產(chǎn)莢膜多糖提供原料，培養(yǎng)流腦A群細(xì)菌至對數(shù)生長期后期或靜止期前期，此時菌濃度達(dá)到100-200億/mL，甲醛殺菌后去除菌體，收集發(fā)酵液上清液；4）一次純化：加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度1.0g/L，充分?jǐn)嚢韬箪o置過夜，離心收集多糖，沉淀的多糖用氯化鈣溶液攪拌3小時使多糖和十六烷基三甲基溴化銨解離，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為25%（v/v），2-8℃靜置過夜，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為75-80%（v/v），充分振搖使多糖沉淀，靜置18小時以上，離心收集沉淀，然后用無水乙醇和丙酮各洗三次，得到粗糖；5）二次純化：將粗糖溶解于10%飽和中性醋酸鈉溶液中，然后按粗糖與苯酚之比為4:3（v/v）的比例加入苯酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，抽提1-3次至上清液澄清，收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸，超濾后的多糖溶液中加入4mol/LNaCl溶液，至NaCl終濃度為0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇終濃度為75%（v/v），充分混勻后2-8℃靜置過夜，沉淀多糖，離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次；6）流腦A群莢膜多糖的活化和衍生：將1-氰基-2甲胺基吡啶四氟硼酸酯（CDAP）用乙腈溶解成100mg/mL的溶液，稱取上述步驟5）二次純化后得到的多糖400mg，溶解于注射用水中，配制成濃度為5mg/mL的溶液，調(diào)節(jié)pH至9.0，按多糖：CDAP=1：0.5的比例加入CDAP，室溫攪拌2-5分鐘，將己二酰肼（ADH）用0.2MNaHCO3溶解成100mg/mL的溶液，按多糖：ADH=1：3.5的比例加入，室溫攪拌1小時，反應(yīng)結(jié)束后，用0.05mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除溴化氰。即，制得多糖-ADH衍生物。綜上，本發(fā)明的有益效果是：本申請通過對多糖-ADH衍生物的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，一方面控制流腦A群發(fā)酵液中的核酸及蛋白等雜質(zhì)成分含量較低，另一方面降低苯酚的用量，相較于目前采用的方法中一般對粗糖進(jìn)行二次提純時粗糖與苯酚之比為1:1（v/v），而本申請中將苯酚的用量減少至原來用量的75%，大大減少苯酚的用量，利于環(huán)保。具體實施方式下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1利于多糖-ADH衍生物質(zhì)量控制的工藝，包括以下步驟：1）開啟菌種及傳代：開啟流腦A群菌種傳代至氯化血紅素流腦半綜合培養(yǎng)基上，放入二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中，36.5℃，8%CO2培養(yǎng)，二代采用半綜合固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，三代采用流腦半綜合液體培養(yǎng)基在恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)；2）接種到種子罐培養(yǎng)：將上述步驟1）培養(yǎng)得到的流腦A群種子接種到種子罐，恒溫攪拌通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)至第五代；3）發(fā)酵罐發(fā)酵：將上述步驟2）培養(yǎng)得到的流腦A群五代種子接種入發(fā)酵罐后，恒溫36.5℃，深層通氣240rpm攪拌培養(yǎng)，中途補(bǔ)加葡萄糖溶液為流腦A群細(xì)菌生產(chǎn)莢膜多糖提供原料，培養(yǎng)流腦A群細(xì)菌至對數(shù)生長期后期或靜止期前期，此時菌濃度達(dá)到100-200億/mL，甲醛殺菌后去除菌體，收集發(fā)酵液上清液；4）一次純化：加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度1.0g/L，充分?jǐn)嚢韬箪o置過夜，離心收集多糖，沉淀的多糖用氯化鈣溶液攪拌3小時使多糖和十六烷基三甲基溴化銨解離，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為25%（v/v），2-8℃靜置過夜，離心收集上清，上清加入乙醇至終濃度為75-80%（v/v），充分振搖使多糖沉淀，靜置18小時以上，離心收集沉淀，然后用無水乙醇和丙酮各洗三次，得到粗糖；5）二次純化：將粗糖溶解于10%飽和中性醋酸鈉溶液中，然后按粗糖與苯酚之比為4:3（v/v）的比例加入苯酚溶液，振蕩混勻后離心收集上清液，抽提1-3次至上清液澄清，收集上清液，用超濾膜包超濾去除殘余的苯酚及核酸，超濾后的多糖溶液中加入4mol/LNaCl溶液，至NaCl終濃度為0.3mol/L，然后加入95%乙醇至乙醇終濃度為75%（v/v），充分混勻后2-8℃靜置過夜，沉淀多糖，離心收集沉淀，然后依次用無水乙醇、丙酮各洗滌兩次；取樣按照中國藥典記載的方法檢測蛋白含量、核酸含量、O-乙?；?、磷含量、內(nèi)毒素含量，并記錄于下表1中。6）流腦A群莢膜多糖的活化和衍生：將1-氰基-2甲胺基吡啶四氟硼酸酯（CDAP）用乙腈溶解成100mg/mL的溶液，稱取上述步驟5）二次純化后得到的多糖400mg，溶解于注射用水中，配制成濃度為5mg/mL的溶液，調(diào)節(jié)pH至9.0，按多糖：CDAP=1：0.5的比例加入CDAP，室溫攪拌2-5分鐘，將己二酰肼（ADH）用0.2MNaHCO3溶解成100mg/mL的溶液，按多糖：ADH=1：3.5的比例加入，室溫攪拌1小時，反應(yīng)結(jié)束后，用0.05mol/L氯化鈉溶液為超濾液，用超濾膜包超濾去除溴化氰。即，制得多糖-ADH衍生物。取樣檢測產(chǎn)品衍生率并記錄于下表1中。表1批次蛋白含量（mg/g）核酸含量（mg/g）衍生率（%）O-乙?；縨mol/g磷含量mg/g內(nèi)毒素EU/μg標(biāo)準(zhǔn)要求<10<10——≥2≥80<50實施例1<211.35%2.585<3.125從上表1中可以看出，本申請制得的多糖內(nèi)雜質(zhì)含量較低，質(zhì)量較好，且制備工藝中減少苯酚用量，減少至普通工藝中的苯酚用量的75%。最終產(chǎn)品的衍生率較高。如上所述，可較好的實現(xiàn)本發(fā)明。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)，在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，對以上實施例所作的任何簡單的修改、等同替換與改進(jìn)等，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3