本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種縮短細(xì)菌纖維素發(fā)酵周期的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

細(xì)菌纖維素(Bacterial cellulose，BC)是指在不同條件下，由醋酸菌屬(Acetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)和八疊球菌屬(Sarcina)等中的某種微生物合成的纖維素的統(tǒng)稱。與天然纖維素相比，細(xì)菌纖維素具有良好的吸水、透氣性能、很強(qiáng)的親水性、非凡的持水性(吸收600～700倍于其干基重的水分)、高純度、高結(jié)晶度、高抗張強(qiáng)度及高持水能力等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是目前世界上性能最好的纖維素。因此具有許多潛在的應(yīng)用前景。目前在音響、食品、日化、醫(yī)藥、造紙等工業(yè)中已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化應(yīng)用，被認(rèn)為是目前世界上性能最好的纖維素。自該產(chǎn)品面市以來，在國際市場(chǎng)上一直暢銷不衰?，F(xiàn)有細(xì)菌纖維素生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)能力遠(yuǎn)無法滿足市場(chǎng)對(duì)細(xì)菌纖維素的大量需求。因此改進(jìn)細(xì)菌纖維素的發(fā)酵工藝得到理想的產(chǎn)量已成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。

目前，細(xì)菌纖維素的發(fā)酵均采用靜置培養(yǎng)，周期一般為5～10天，有些周期甚至更長(zhǎng)，主要原因是木醋桿菌在種子培養(yǎng)的過程中就開始產(chǎn)纖維素，菌液中的菌體容易被纖維素膜吸附，溶液中的菌體濃度一般都在10⁶～10⁸CFU/ml，整個(gè)種子培養(yǎng)階段沒有明顯的菌種擴(kuò)培現(xiàn)象，有些會(huì)呈現(xiàn)越培養(yǎng)菌液越澄清的現(xiàn)象，雖然纖維素膜包裹了大量菌體，但后期接種靜置發(fā)酵用的是種子液，即使接種前通過劇烈震蕩或攪拌仍然不能大幅度增加菌液中的濃度，也就是說種子液內(nèi)的菌體濃度無法達(dá)到較高水平，這種菌體繁殖與發(fā)酵產(chǎn)纖維素兩個(gè)階段無法分開的現(xiàn)象導(dǎo)致大規(guī)模生產(chǎn)很難實(shí)現(xiàn)。有研究嘗試在種子培養(yǎng)階段提高轉(zhuǎn)速，加大對(duì)菌體的剪切力，盡量阻滯纖維素的產(chǎn)生，但結(jié)果并不理想。

截至目前，只有為數(shù)不多的有關(guān)提高種子培養(yǎng)基中的菌濃的研究報(bào)道。中國專利CN200910193119公開了一種利用菠蘿皮汁進(jìn)行“二步法”發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的方法，采用將木醋桿菌菌體增殖與發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素兩個(gè)階段分開，于22～28℃，在發(fā)酵過程中不斷通入無菌空氣，并用100～200rpm攪拌下培養(yǎng)24h～72h，此時(shí)木醋桿菌活菌數(shù)為10⁸～10⁹cfu/ml，經(jīng)過菌體增殖培養(yǎng)，盡量使細(xì)胞處于同步生長(zhǎng)時(shí)期，然后在菠蘿皮清汁的發(fā)酵培養(yǎng)基中，淺盤靜止培養(yǎng)72h～168h，得到細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為17.5g/L以上。該方法使細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)周期大大縮短，將菠蘿皮進(jìn)行了綜合利用，保護(hù)了環(huán)境，生產(chǎn)出的細(xì)菌纖維素質(zhì)構(gòu)致密、均勻。但是該方法受到原料來源的限制，一般菠蘿只在南方部分地區(qū)生長(zhǎng)，每年只有幾個(gè)月的盛產(chǎn)時(shí)間。所以該方法對(duì)于大部分地區(qū)是不適于規(guī)?；a(chǎn)的。

中國發(fā)明專利200710030072.0申請(qǐng)公開了“深層與淺層靜態(tài)偶聯(lián)發(fā)酵生產(chǎn)高纖椰果的方法”，該方法是將木醋桿菌接入20～100％的椰子水中進(jìn)行84～132h(3.5～5.5天)的深層靜態(tài)發(fā)酵，之后再裝入淺盤進(jìn)行 40～192h(1.7～8.0天)的產(chǎn)椰果的發(fā)酵，其優(yōu)點(diǎn)是將木醋桿菌增值培養(yǎng)(非生產(chǎn)時(shí)間)與發(fā)酵產(chǎn)纖維素(生產(chǎn)時(shí)間)的兩個(gè)階段分開，在一定程度上可以縮短生產(chǎn)周期，提高生產(chǎn)效率。但是該工藝需要用到椰子水，對(duì)于生產(chǎn)同樣會(huì)受到地域和時(shí)間的限制，不適于大規(guī)模穩(wěn)定的生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明提供了一種縮短細(xì)菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)周期的培養(yǎng)方法，該方法在種子培養(yǎng)基中添加纖維素酶，使得擴(kuò)培階段纖維素包裹的菌種被釋放出來，從而使種子液中的菌濃提高，而且明顯的將種子發(fā)酵與產(chǎn)膜發(fā)酵分成兩個(gè)階段，加快了細(xì)菌纖維素的合成速度，縮短了整個(gè)發(fā)酵周期。

為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案提供了一種縮短細(xì)菌纖維素發(fā)酵周期的培養(yǎng)方法，包括種子擴(kuò)培和靜置發(fā)酵產(chǎn)膜兩個(gè)階段，在種子擴(kuò)培階段的種子培養(yǎng)基中添加纖維素酶。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，纖維素酶的最終濃度為0.12～0.20U/ml。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，種子擴(kuò)培為先將斜面菌種接種于含纖維素酶培養(yǎng)基的搖瓶中培養(yǎng)，再將搖瓶培養(yǎng)后的菌液轉(zhuǎn)接至種子罐中培養(yǎng)。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，搖瓶培養(yǎng)的振速為120～300rpm，溫度為25～32℃，培養(yǎng)時(shí)間為2～5h。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，菌種選自木醋桿菌、醋化醋桿菌、產(chǎn)醋醋桿菌、巴氏醋桿菌、氣桿菌屬(Aerobacter)、根瘤桿菌屬、無色桿菌屬、土壤桿菌屬、假單胞桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、八疊球菌屬或動(dòng)膠菌屬。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，種子罐中培養(yǎng)是在攪拌速度為100～200r/min，通氣量為2-5vvm，罐壓為28-32Kpa的條件下培養(yǎng)20～24h。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所述靜置發(fā)酵產(chǎn)膜階段，種子液接種到發(fā)酵產(chǎn)膜培養(yǎng)基的體積為發(fā)酵產(chǎn)膜培養(yǎng)基體積的2％。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，靜置發(fā)酵產(chǎn)膜是指將擴(kuò)培后的種子液接種到靜置發(fā)酵產(chǎn)纖維素的培養(yǎng)基混勻，然后，灌注到淺盤中靜置培養(yǎng)，收膜即可。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，淺盤培養(yǎng)是在28～32℃靜置培養(yǎng)2～3天，其中淺盤裝液深度為5～10mm。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，纖維素酶可以一次性加入到搖瓶培養(yǎng)基中，也可以先在搖瓶培養(yǎng)基中添加一部分，轉(zhuǎn)接至種子罐時(shí)再補(bǔ)充纖維素酶至終濃度為0.12～0.20U/ml。所述的一部分應(yīng)保證搖瓶中纖維素酶的濃度為0.12U/ml以上。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，種子培養(yǎng)基各組分的質(zhì)量/體積分?jǐn)?shù)為：Na₂HPO₄·12H₂O 0.1～0.2％，MgSO4·7H₂O 0.01～0.03％，檸檬酸0.1～0.2％，葡萄糖0.5～2％，(NH₄)₂HPO₄ 0.2～0.4％，玉米漿干粉1～2％。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，發(fā)酵產(chǎn)膜培養(yǎng)基中各組分的質(zhì)量/體積分?jǐn)?shù)為：KH₂PO₄ 0.2％，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，檸檬酸0.2％，蔗糖4％，大豆蛋白胨1％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所用的器皿均為已滅菌的。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，所用的水均為純化水。

除非明確地說明與此相反，否則，本發(fā)明引用的所有范圍包括端值。例如，“纖維素酶的最終濃度為0.12～0.20U/ml”，表示纖維素酶的最終濃度為0.12≤C≤0.20U/ml。

本發(fā)明所述的“纖維素酶的最終濃度為”，指的是纖維素酶在種子罐中的終濃度。

本發(fā)明所述的“種子液”為在種子罐中擴(kuò)培后的菌液。

本發(fā)明所述的“斜面菌種”為將生產(chǎn)菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，于25℃～32℃靜置培養(yǎng)2～3天，即得。斜面培養(yǎng)基的組分為(質(zhì)量比)：蔗糖2％～4％，硫酸銨0.2％～0.6％，硫酸鎂0.01％～0.05％，氯化鈣0.01％～0.04％，七水硫酸亞鐵0.0003％～0.0010％，乙酸鈉0.04％～0.10％，酵母膏0.03％～0.10％，瓊脂2％，其余為水。

本發(fā)明中的數(shù)字均為近似值，無論有否使用“大約”或“約”等字眼。數(shù)字的數(shù)值有可能會(huì)出現(xiàn)1％、2％、5％、7％、8％、10％等差異。每當(dāng)公開一個(gè)具有N值的數(shù)字時(shí)，任何具有N+/-1％，N+/-2％，N+/-3％，N+/-5％，N+/-7％，N+/-8％或N+/-10％值的數(shù)字會(huì)被明確地公開，其中“+/-”是指加或減。

本發(fā)明使用的術(shù)語“或”表示備選方案，如果合適的話，可以將它們組合，也就是說，術(shù)語“或”包括每個(gè)所列出的單獨(dú)備選方案以及它們的組合。例如，“所述菌種選自木醋桿菌、醋化醋桿菌、產(chǎn)醋醋桿菌、巴氏醋桿菌、氣桿菌屬(Aerobacter)、根瘤桿菌屬、無色桿菌屬、土壤桿菌屬、假單胞桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、八疊球菌屬或動(dòng)膠菌屬?！北硎旧a(chǎn)細(xì)菌纖維素的菌種選自生產(chǎn)菌株可以是木醋桿菌、醋化醋桿菌、產(chǎn)醋醋桿菌、巴氏醋桿菌、氣桿菌屬(Aerobacter)、根瘤桿菌屬、無色桿菌屬、土壤桿菌屬、假單胞桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、八疊球菌屬或動(dòng)膠菌屬之中的一種，也可以是其一種以上的組合。

在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，添加的纖維素酶溶液的方法為：用純化水溶解纖維素酶成母液，用0.22μm孔徑的無菌過濾膜將酶液進(jìn)行過濾，然后將過濾后的無菌酶液添加到已滅菌放涼的種子液中。本發(fā)明中所指的添加纖維素酶的終濃度跟菌種的產(chǎn)膜能力有關(guān)，一般產(chǎn)膜能力越強(qiáng)的菌種需要添加纖維素酶的終濃度越高。纖維素酶的添加量只要能保證在培養(yǎng)過程中搖瓶?jī)?nèi)一直沒有團(tuán)狀或塊狀纖維素產(chǎn)生即可，若添加纖維素酶的濃度過高，會(huì)影響后期靜置培養(yǎng)成膜的韌性。

在種子培養(yǎng)過程中，產(chǎn)纖維素酶的菌株在繁殖菌體的同時(shí)會(huì)不斷產(chǎn)生纖維素，在不添加纖維素酶的情況下，會(huì)看到不斷增大的纖維素膜塊，呈絲狀或條狀，大的會(huì)成團(tuán)狀，培養(yǎng)基溶液會(huì)逐漸變得澄清，主要原因就是纖維素膜會(huì)吸附培養(yǎng)基中的顆粒物質(zhì)，將菌體或其他固形物聚集在一起。在種子培養(yǎng)基中添加一定量的纖維素酶后，可以阻止團(tuán)狀、塊狀或條狀纖維素的產(chǎn)生，將菌種釋放出來，從而可有效的提高菌體的濃度，一方面促使后期靜置培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)纖維素膜的速度加快，靜態(tài)培養(yǎng)纖維素膜的周期也會(huì)大大縮短，可 節(jié)約時(shí)間成本；另一方面，將包裹的菌種釋放到溶液中再轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)可以更容易混勻，使靜態(tài)培養(yǎng)出來的纖維素膜更加平整光滑。

本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加纖維素酶，可將種子擴(kuò)培與產(chǎn)膜發(fā)酵明顯的分成兩個(gè)階段，在不影響產(chǎn)膜干重的前提下使產(chǎn)膜周期縮短一半以上，接種量降低到不添加纖維素酶的工藝接種量的20％以下，大大的降低了生產(chǎn)成本。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例公開了一種縮短細(xì)菌纖維素發(fā)酵周期的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的產(chǎn)品及方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

實(shí)施例1

培養(yǎng)基的配制：

配制搖瓶種子培養(yǎng)基100ml，配制種子罐培養(yǎng)基10L

其中種子搖瓶和種子罐的培養(yǎng)基配方是一致的，均為：Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.01％，檸檬酸0.1％，葡萄糖0.5％，(NH₄)₂HPO₄ 0.2％g，玉米漿干粉2％。純水溶解后用飽和檸檬酸調(diào)pH至5.0。種子搖瓶采用1L的三角瓶裝液量100ml，種子罐采用15L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐裝液量10L。

配制靜置發(fā)酵產(chǎn)纖維素培養(yǎng)基配方如下：KH₂PO₄ 0.2％，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，檸檬酸0.2％，蔗糖4％，大豆蛋白胨1％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，調(diào)pH至4.2。

將一支木醋桿菌試管斜面(試管規(guī)格：25mm×200mm)菌苔用接種鏟全部接種到一瓶裝有已滅菌的種子培養(yǎng)基搖瓶中，添加經(jīng)過濾除菌的纖維素酶溶液至濃度為12U/ml，在30℃下以160rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)3h使菌種復(fù)蘇，再將種子搖瓶的菌液全部轉(zhuǎn)接至種子罐中，種子罐中的通氣量設(shè)為2vvm，罐壓30kpa，攪拌速度100r/min，培養(yǎng)24h后溶氧降至0，將種子液停止發(fā)酵，轉(zhuǎn)接至滅菌的靜置發(fā)酵產(chǎn)纖維素培養(yǎng)基，接種量為2％，同時(shí)對(duì)種子菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。在混合灌混勻后在無菌環(huán)境下罐注到淺盤中，淺盤厚度控制在1cm左右，培養(yǎng)2天觀察，所有淺盤的纖維素膜厚度均接近1cm，此時(shí)所有培養(yǎng)基被利用完，收膜處理，同時(shí)隨機(jī)留4-5個(gè)淺盤培養(yǎng)4天收膜。

收膜后處理方式：先用清水將膜表面的雜質(zhì)洗干凈，然后放到4％氫氧化鈉溶液浸泡8h，再用冰醋酸調(diào)節(jié)至中性，最后用純化水清洗，所得纖維素膜柔軟光滑。

平板計(jì)數(shù)方法：將菌液用無菌水進(jìn)行10倍梯度稀釋，然后涂布固體種子平板培養(yǎng)基，30℃靜置培養(yǎng)5天后計(jì)數(shù)，最后換算為單位體積菌液所含菌量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

實(shí)施例2

培養(yǎng)基的配制：

種子培養(yǎng)基的配方：Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，檸檬酸0.2％，葡萄糖2％，(NH₄)₂HPO₄0.4％，玉米漿干粉2％，溶純水中，八層紗布過濾，用飽和檸檬酸調(diào)pH至5.0。

種子搖瓶和種子罐的培養(yǎng)基配方是一樣的。種子搖瓶采用1L的三角瓶裝液量100ml，種子罐采用15L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐裝液量10L。

其中種子搖瓶和種子罐的培養(yǎng)基配方是一樣的。種子搖瓶采用1L的三角瓶裝液量100ml，種子罐采用15L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐裝液量10L。

配制靜置發(fā)酵產(chǎn)纖維素培養(yǎng)基配方：KH₂PO₄ 0.2％，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，檸檬酸0.2％，蔗糖4％，大豆蛋白胨1％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，調(diào)pH至4.2。

將一支木醋桿菌試管斜面(試管規(guī)格：25mm×200mm)菌苔用接種鏟全部接種到一瓶裝有已滅菌的種子培養(yǎng)基搖瓶中，添加經(jīng)過濾除菌的纖維素酶溶液至濃度為20U/ml，在30℃下以160rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)3h使菌種復(fù)蘇，再將種子搖瓶的菌液全部轉(zhuǎn)接至種子罐中，種子罐中的通氣量設(shè)為5vvm，罐壓32kpa，攪拌速度120r/min，培養(yǎng)18h后溶氧降至30％，將種子液停止發(fā)酵，轉(zhuǎn)接至滅菌的靜置發(fā)酵產(chǎn)纖維素培養(yǎng)基，接種量為2％，同時(shí)對(duì)種子菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。在混合灌混勻后在無菌環(huán)境下罐注到淺盤中，淺盤內(nèi)培養(yǎng)液厚度控制在8±1mm，培養(yǎng)2天觀察，所有淺盤的纖維素膜厚度均在8±1mm，此時(shí)所有培養(yǎng)基被利用完，收膜處理，同時(shí)隨機(jī)留4-5個(gè)淺盤培養(yǎng)4天收膜。收膜后處理方式和平板計(jì)數(shù)方法：同實(shí)施例1。

檢測(cè)結(jié)果見表1。

實(shí)施例3

培養(yǎng)基的配制：

種子培養(yǎng)基的配方：Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，檸檬酸0.2％，葡萄糖2％，(NH₄)₂HPO₄0.4％，玉米漿干粉2％，溶純水中，八層紗布過濾，用飽和檸檬酸調(diào)pH至5.0。

其中種子搖瓶和種子罐的培養(yǎng)基配方是一樣的。種子搖瓶采用1L的三角瓶裝液量300ml，種子罐采用50L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐裝液量30L。

配制靜置發(fā)酵產(chǎn)纖維素培養(yǎng)基配方如下：KH₂PO₄ 0.2％，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，檸檬酸0.2％，蔗糖4％，大豆蛋白胨1％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，調(diào)pH至4.2。

將三支木醋桿菌試管斜面(試管規(guī)格：25mm×200mm)菌苔用接種鏟全部接種到上述一瓶已滅菌的種子搖瓶中，添加經(jīng)過濾除菌的纖維素酶溶液至濃度為18U/ml，在30℃下以160rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)3h使菌種復(fù)蘇，再將種子搖瓶的菌液全部轉(zhuǎn)接至種子罐中，種子罐中的通氣量設(shè)為3vvm，罐壓30kpa，攪拌速度100r/min，培養(yǎng)24h后溶氧降至0，將種子液停止發(fā)酵，轉(zhuǎn)接至滅菌的靜置發(fā)酵產(chǎn)纖維素培養(yǎng)基，接種量為2％，同時(shí)對(duì)種子菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。在混合灌混勻后在無菌環(huán)境下罐注到淺盤中，淺盤厚度控制在8mm左右，培養(yǎng)2天收膜。所有淺盤的纖維素膜厚度均在8mm左右，此時(shí)所有培養(yǎng)基被利用完。收膜處理，同時(shí)隨機(jī)留4-5個(gè)淺盤培養(yǎng)4天收膜。收膜后處理方式和平板計(jì)數(shù)方法：同實(shí)施例1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

實(shí)施例4

培養(yǎng)基的配制：

種子培養(yǎng)基的配方：Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，檸檬酸0.2％，葡萄糖2％，(NH₄)₂HPO₄0.4％，玉米漿干粉2％，溶純水中，八層紗布過濾，用飽和檸檬酸調(diào)pH至5.0。

其中種子搖瓶和種子罐的培養(yǎng)基配方是一樣的。種子搖瓶采用1L的三角瓶裝液量300ml，種子罐采用50L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐裝液量30L。

配制靜置發(fā)酵產(chǎn)纖維素培養(yǎng)基配方如下：KH₂PO₄ 0.2％，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，檸檬酸0.2％，蔗糖4％，大豆蛋白胨1％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，調(diào)pH至4.2。

將三支木醋桿菌試管斜面(試管規(guī)格：25mm×200mm)菌苔用接種鏟全部接種到上述一瓶已滅菌的種子搖瓶中，添加經(jīng)過濾除菌的纖維素酶溶液至濃度為20U/ml，在30℃下以160rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)3h使菌種復(fù)蘇，再將種子搖瓶的菌液全部轉(zhuǎn)接至種子罐中，種子罐中的通氣量設(shè)為3vvm，罐壓30kpa，攪拌速度150r/min，培養(yǎng)20h后溶氧降至30％，將種子液停止發(fā)酵，轉(zhuǎn)接至滅菌的靜置發(fā)酵產(chǎn)纖維素培養(yǎng)基，接種量為2％，同時(shí)對(duì)種子菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。在混合灌混勻后在無菌環(huán)境下罐注到淺盤中，淺盤厚度控制在1cm左右，培養(yǎng)2天收膜。所有淺盤的纖維素膜厚度均在1cm左右，此時(shí)所有培養(yǎng)基被利用完。收膜后處理方式和平板計(jì)數(shù)方法：同實(shí)施例1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

對(duì)比例1

培養(yǎng)基的配制：

種子培養(yǎng)基的配方：Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，檸檬酸0.2％，葡萄糖2％，(NH₄)₂HPO₄0.4％，玉米漿干粉2％，溶純水中，八層紗布過濾，用飽和檸檬酸調(diào)pH至5.0。

其中種子搖瓶和種子罐的培養(yǎng)基配方是一樣的。種子搖瓶采用1L的三角瓶裝液量300ml，種子罐采用50L機(jī)械攪拌發(fā)酵罐裝液量30L。

配制靜置發(fā)酵產(chǎn)纖維素培養(yǎng)基配方如下：KH₂PO₄ 0.2％，Na₂HPO₄·12H₂O 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，檸檬酸0.2％，蔗糖4％，大豆蛋白胨1％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，純水溶解，調(diào)pH至4.2。

將三支木醋桿菌試管斜面(試管規(guī)格：25mm×200mm)菌苔用接種鏟全部接種到一瓶裝有已滅菌的種子培養(yǎng)基搖瓶中，在30℃以160rpm的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)3h使菌種復(fù)蘇，再將種子搖瓶的菌液全部轉(zhuǎn)接至種子罐中，種子罐中的通氣量設(shè)為3vvm，罐壓30kpa，攪拌速度100r/min，培養(yǎng)24h后溶氧仍為100％左右，將種子液停止發(fā)酵，轉(zhuǎn)接至裝有滅菌的靜置發(fā)酵產(chǎn)纖維素培養(yǎng)基的混合罐，接種量為2％，同時(shí)對(duì)種子菌液進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。在混合灌動(dòng)態(tài)培養(yǎng)24h，動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件與種子罐一樣。之后在無菌環(huán)境下罐注到淺盤中，淺盤厚度控制在1cm左右，培養(yǎng)2天觀察，所有淺盤的纖維素膜厚度均在0.6cm左右，剩余大量培養(yǎng)基液體，部分淺盤進(jìn)行收膜處理；剩余淺盤繼續(xù)培養(yǎng)至4天收膜觀察，全部淺盤內(nèi)基本沒有培養(yǎng)基液體剩余，纖維素膜厚度在1cm左右。收膜后處理方式：同實(shí)施例1。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1培養(yǎng)過程中各項(xiàng)參數(shù)測(cè)試結(jié)果如下：

纖維素酶酶活采用濾紙酶活進(jìn)行表示，具體測(cè)定方法參考《GBT 23881-2009飼用纖維素酶活性的測(cè)定濾紙法》。