本發(fā)明涉及生物工程，尤其是涉及一種提高格爾登素發(fā)酵水平的方法。

背景技術(shù)：

放線菌是一類高GC含量的革蘭氏陽性菌，目前已知抗生素中有60％以上是由放線菌合成。鏈霉菌是一類高等放線菌，具有強(qiáng)大的抗生素合成能力和復(fù)雜的形態(tài)分化，故一直受到人們的關(guān)注。聚酮類化合物是一類由放線菌產(chǎn)生的重要的次級代謝產(chǎn)物，其在抗腫瘤、抗寄生蟲、抗生素領(lǐng)域都有極其重要的應(yīng)用。前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，聚酮類化合物的生物合成主要依賴I型、II型和III型聚酮生物合成基因簇，其主要使用的前體物是乙酰輔酶A、丙二酰輔酶A、甲基丙二酰輔酶A、乙基丙二酰輔酶A等等。而這些前體物質(zhì)主要是由初級代謝即EMP途徑、TCA途徑中的中間產(chǎn)物經(jīng)過幾步反應(yīng)而形成。

格爾登素(geldanamycin)屬于I型聚酮類抗生素，主要由吸水鏈霉菌的一些亞種如S.hygroscopicusNRRL 3602、S.hygroscopicusJCM4427產(chǎn)生。格爾登素可以與細(xì)胞中的熱擊蛋白HSP90結(jié)合，阻礙其執(zhí)行分子伴侶功能，抑制腫瘤細(xì)胞的分裂，因此有著強(qiáng)的抗腫瘤活性。除此之外，它還有一定的抗革蘭氏陽性菌、真菌、瘧疾、原生動(dòng)物和寄生蟲的活性。格爾登素雖然有強(qiáng)烈的抗腫瘤活性，但由于它對一般細(xì)胞也有毒性且在水中溶解性差，所以不能進(jìn)行臨床應(yīng)用。目前它的類似物17-[2-(dimethylamino)ethyl]amino-17-demethoxygeldanamycin(17-DMAG)和17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin(17-AAG)都在臨床檢定階段。格爾登素也廣泛應(yīng)用在科研中對于熱擊蛋白HSP90的研究中。

格爾登素的生物合成是經(jīng)起始單元AHBA合成、PKS組裝和后修飾步驟這三部分完成的。格爾登素的生物合成基因簇最早在Streptomyces hygroscopicus NRRL3602中被發(fā)現(xiàn)并在2003年被詳細(xì)地注釋。后來又在Streptomyces hygroscopicus17997中被克隆出來。

在I型聚酮類抗生素的生物合成中，PKS的組裝是形成聚酮鏈骨架關(guān)鍵的一步，提高聚酮合酶的合成效率可以有效提高抗生素的產(chǎn)量。本微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在2015年完成了格爾登素產(chǎn)生菌吸水鏈霉素XM201(Streptomyces hygroscopicus XM201)的全基因組測序。通過基因組注釋和轉(zhuǎn)錄組的分析，我們篩選到了一個(gè)高效的啟動(dòng)子P₅₀₆₁(6,228,916bp～6,229,658bp)，它編碼的基因的RPKM值是格爾登素聚酮合酶gdmAI的RPKM值的60倍。本發(fā)明嘗試將此高效的啟動(dòng)子P5061置換格爾登素原始的啟動(dòng)子P_gdmA,提高聚酮合酶的轉(zhuǎn)錄水平，據(jù)此提高它的合成效率，為格爾登素工業(yè)化規(guī)模的擴(kuò)大和生產(chǎn)成本的降低提供有效的參考。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的，就是為了提供一種提高格爾登素發(fā)酵水平的方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：一種提高格爾登素發(fā)酵水平的方法，是通過將吸水鏈霉菌XM201基因組中編碼格爾登素I型聚酮合酶的上游啟動(dòng)子P_gdmA序列通過原位置換換成XM201基因組內(nèi)源的高效啟動(dòng)子P₅₀₆₁，使得格爾登素聚酮鏈的合成效率提高，并使格爾登素在發(fā)酵中的產(chǎn)量得以提高。

所述上游啟動(dòng)子P_gdmA的序列如SEQ ID NO.1所示。

所述高效啟動(dòng)子P₅₀₆₁的序列如SEQ ID NO.2所示。

構(gòu)建步驟如下：

第一步：設(shè)計(jì)并構(gòu)建用于格爾登素上游啟動(dòng)子P_gdmA與高效啟動(dòng)子P₅₀₆₁進(jìn)行置換的載體I；

第二步：將第一步構(gòu)建得到的載體I通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入受體菌吸水鏈霉菌XM201中進(jìn)行同源重組；

第三步：通過對突變株的篩選和阿泊拉霉素抗性驗(yàn)證，并通過PCR產(chǎn)物片段大小的差異篩選得到啟動(dòng)子置換的突變株。

步驟一的具體構(gòu)建方法是，在質(zhì)粒pKC1139的SpeI/HindIII位點(diǎn)插入來自P_gdmA區(qū)域左側(cè)的2111bpPCR片段和來自PgdmA區(qū)域右側(cè)的2106bp PCR片段，中間用XbaI位點(diǎn)插入743bp PCR得到P₅₀₆₁的序列。

所述發(fā)酵是指將鏈霉菌孢子或者菌絲體接種在種子培養(yǎng)基中于30℃、220rpm的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)36小時(shí)后轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵6天。

所述種子培養(yǎng)基含有質(zhì)量體積比為1％的葡萄糖、1％的蛋白胨和0.5％的酵母提取物；所述發(fā)酵培養(yǎng)基含有質(zhì)量體積比為3％的淀粉、7％的葡萄糖、4％的黃豆餅粉、0.3％的硫酸銨、1％的碳酸鈣、0.001％的氯化鈷和0.1％的大豆油。

種子培養(yǎng)物按15％的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基。

采用本發(fā)明的方法，通過將格爾登素聚酮合酶的啟動(dòng)子置換成胞內(nèi)高效的啟動(dòng)子，提高了聚酮合酶合成聚酮鏈的效率，使格爾登素產(chǎn)量有了較大的提高。通過本發(fā)明可提高格爾登素的發(fā)酵產(chǎn)量，同時(shí)使發(fā)酵成本降低。

本發(fā)明所涉及的質(zhì)粒pKC1139已經(jīng)在SCI數(shù)據(jù)庫文獻(xiàn)《Bierman M,Logan R,O'Brien K,Seno ET,Rao RN,Schoner BE(1992)Plasmid cloning vectors for the conjugaltransfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp.Gene,116,43-49》中公開。

附圖說明

圖1示意了聚酮合酶啟動(dòng)子P_gdmA置換成高效啟動(dòng)子P₅₀₆₁的過程；

圖2、圖3為高效啟動(dòng)子置換菌株突變株BS-1與野生型菌株XM201的格爾登素聚酮合酶基因gdmAI、gdmAIII的轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果；

圖4為啟動(dòng)子置換后格爾登素發(fā)酵水平檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，并給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)條件或制造廠商的建議條件。

實(shí)施例

步驟一：質(zhì)粒pLQ614的構(gòu)建

以吸水鏈霉菌XM201的基因組DNA為模板，分別使用兩組引物gapL-F/R、gapR-F/R通過PCR擴(kuò)增得到來自P_gdmA(不包含RBS位點(diǎn))區(qū)域左側(cè)2111bp和右側(cè)2106bp的同源臂,通過基因測序確認(rèn)同源臂的正確性；在質(zhì)粒pKC1139的SpeI/HindIII位點(diǎn)插入來自P_gdmA(不包含RBS位點(diǎn))區(qū)域左側(cè)2111bpPCR片段(SpeI/XbaI)和P_gdmA(不包含RBS位點(diǎn))區(qū)域右側(cè)2106bpPCR片段(HindIII/XbaI)；通過上述方法得到用于啟動(dòng)子置換的質(zhì)粒pLQ614-1。在37℃水浴條件下，采用KpnI、HindIII和XbaI三種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理可以觀察到2.0kb左右的兩條重合的目標(biāo)條帶，表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。將pLQ614-1用XbaI進(jìn)行酶切后同PCR擴(kuò)增出的P5061片段進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pLQ614。

步驟二：將用于和染色體發(fā)生重組的質(zhì)粒pLQ614導(dǎo)入野生型菌株XM201，并篩選得到啟動(dòng)子置換后的突變株BS-1，此突變株表征吸水鏈霉菌XM201的格爾登素聚酮合酶的啟動(dòng)子已替換成了高效啟動(dòng)子P₅₀₆₁。

圖1示意了聚酮合酶啟動(dòng)子P_gdmA置換成高效啟動(dòng)子P₅₀₆₁的過程。具體操作如下：將已構(gòu)建完成用于基因缺失的質(zhì)粒pLQ614轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主E.coliET12567(含有pUZ8002質(zhì)粒)中。取E.coliET12567于含有Apr、Kan和Chl三種抗生素的LB中于37℃過夜培養(yǎng)，用相同的培養(yǎng)基，將過夜培養(yǎng)物按10％的比例轉(zhuǎn)接一次并培養(yǎng)2.5小時(shí)，然后用新鮮的LB溶液漂洗菌體以除去培養(yǎng)物中的抗生素。于此同時(shí)制備野生型菌株XM201的新鮮孢子約10⁹個(gè)，用TES溶液漂洗2～3次之后再用1mLTES溶液懸浮孢子，于50℃熱激10min后再冷卻至室溫，等體積加入2×孢子預(yù)萌發(fā)培養(yǎng)液后于37℃培養(yǎng)0.5小時(shí)。將預(yù)萌發(fā)的孢子液與之前制備的宿主菌E.coliET12567混合(孢子和宿主菌的比例約為10:1)均勻后涂布于SFM平板，待平板吹干后轉(zhuǎn)移至30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)16小時(shí)后取出平板，分別取Apr和TMP兩種抗生素的儲(chǔ)存液40μL加入1mL無菌水中混勻后覆蓋在SFM平板上，將平板晾干后轉(zhuǎn)移至30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。一般5～7天后可見平板上有單菌落接合子長出，采用gap-yz-F/gap-yz-R為引物，通過菌絲體PCR和抗性驗(yàn)證的方法驗(yàn)證接合子正確后劃線接種至SFM平板，30℃培養(yǎng)至產(chǎn)孢，收集孢子后按稀釋10⁷～10⁸后接種至SFM平板培養(yǎng)2～3天可得到單菌。繼續(xù)采用gap-yz-F/gap-yz-R為引物，通過菌絲體PCR的方法對單菌落篩選得到啟動(dòng)子置換的突變株。

上述步驟二中所用到的引物序列如表1所示：

表1

用于敲除的左右同源臂制備PCR反應(yīng)體系和條件：DNA模板30ng，引物30pmol，50％DMSO 3μL，25mM Mg²⁺2μL，緩沖液3μL，KOD聚合酶1個(gè)單位，加純水補(bǔ)齊至30μL；PCR條件：95℃5分鐘；95℃30秒；60℃30秒；68℃2分鐘；循環(huán)30次；68℃10分鐘。

基因敲除的接合轉(zhuǎn)移子和突變株篩選時(shí)的PCR體系和條件：DNA模板10～100ng，引物30pmol，50％DMSO 3μL，緩沖液3μL，Taq聚合酶0.5個(gè)單位，加純水補(bǔ)齊至30μL；PCR條件：95℃5分鐘；95℃30秒；60℃30秒；72℃1分鐘；循環(huán)30次；72℃10分鐘。

步驟三，高效啟動(dòng)子置換菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

種子培養(yǎng)基含有：葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，自然pH；

發(fā)酵培養(yǎng)基含有：淀粉3％，葡萄糖7％，黃豆餅粉4％，硫酸銨0.3％,碳酸鈣1％，氯化鈷0.001％，大豆油0.1％。調(diào)節(jié)pH＝7.0～7.2，115℃滅菌30分鐘(質(zhì)量體積比)。

步驟四，高效啟動(dòng)子置換菌株突變株BS-1中g(shù)dmAI-AIII的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的測定

用于RNA提取的樣品一般都保存在Redzoll溶液中。RNA提取過程要求低溫，離心過程除特殊說明，均在4℃、12000rpm的條件下進(jìn)行。取已經(jīng)破碎處理的樣品500μL加入100μL氯仿渦旋振蕩混勻，離心15min后吸取上清液，加入100μL無水乙醇并混勻后將樣品吸入離心柱(賽百盛)中，靜置2min，離心1min，棄液體，用漂洗液(Washing buffer，賽百盛)漂洗兩次，棄液體，將離心柱置于收集管中繼續(xù)離心2min。換用新的收集管，往離心柱中加入60μL DEPC處理過的水，離心2min，將RNA樣品從離心柱上洗脫下來。用Nanodrop 2000型核酸蛋白分析儀測定RNA的濃度和OD260/280，提取后的RNA樣品-80℃保存。RNA樣品的消化反應(yīng)體系可參照表2.2配制，反應(yīng)體系置于37℃孵育4小時(shí)后每個(gè)反應(yīng)體系加入5μL 50mM EDTA后65℃加熱10min即可終止消化，消化好的RNA樣品-80℃保存。RNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄后就得到cDNA，可用于后續(xù)的基因轉(zhuǎn)錄分析。

取cDNA樣品用DEPC處理水稀釋至合適的濃度，配制qRT-PCR體系(2×SYBR Green緩沖液10μL，引物20pmol，cDNA5μL，加DEPC水至體積20μL)，離心去掉溶液中的氣泡之后使用ABI公司7500型快速RT-PCR儀測定樣品Ct值。采用hrdB作為看家基因測定adpA-H和valABC的轉(zhuǎn)錄水平。收集的數(shù)據(jù)使用2^-ΔΔCT法進(jìn)行處理。一般對照組樣品的基因轉(zhuǎn)錄水平設(shè)參比為1，實(shí)驗(yàn)組樣品基因轉(zhuǎn)錄與之比較即得到實(shí)驗(yàn)組基因轉(zhuǎn)錄改變的倍數(shù)。

測定基因轉(zhuǎn)錄水平是使用的引物如表2所示：

表2

圖2、圖3為高效啟動(dòng)子置換菌株突變株BS-1與野生型菌株XM201的格爾登素聚酮合酶基因gdmAI、gdmAIII的轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果。結(jié)果表明置換成為高效啟動(dòng)子后，gdmAI、gdmAIII的轉(zhuǎn)錄水平有了大幅度的提高，說明啟動(dòng)子的置換通過提高了聚酮合酶的轉(zhuǎn)錄水平，來提高了合成格爾登素的效率。

步驟五，利用HPLC檢測格爾登素的發(fā)酵產(chǎn)量

使用Agilent公司的Agilent 1200系列HPLC進(jìn)行色譜分析，采用DAD紫外檢測器測定304nm下的色譜吸收峰。色譜柱的參數(shù)為：Agilent Eclipse Plus C18,4.6×250mm,5μm；流動(dòng)相流速為0.5mL/min；流動(dòng)相：100％甲醇。柱溫：室溫。

圖4為啟動(dòng)子置換后格爾登素發(fā)酵水平檢測結(jié)果。結(jié)果表明這些基因缺失之后，格爾登素的發(fā)酵水平有明顯的提高，和出發(fā)菌株相比格爾登素的發(fā)酵產(chǎn)量提高約43％，終產(chǎn)量達(dá)到868mg/L。