本發(fā)明涉及生物制藥和綠色化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制備方法。

背景技術(shù)：

手性藥物3-氨基-1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氫-[1,2,4]三唑[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁烷-1-酮是Merck公司的治療糖尿病藥物西他列汀(Sitagliptin，商品名JANUVIA)。其手性氨基可以由手性砌塊(R)-3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯(2)提供，因此，化合物2可以作為西他列汀的重要手性前體。

利用轉(zhuǎn)氨酶生產(chǎn)手性胺具有成本低同時高效環(huán)保等特點，專利US 20120329108等報道了對底物3-羰基-1-(3-(三氟甲基)-5,6-二氫-[1,2,4]三唑[4,3-a]吡嗪-7(8H)-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁烷-1-酮的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，專利CN 201210555608.1報道了對3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸甲酯的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，但是到目前為止，還未有利用轉(zhuǎn)氨酶將3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯(1)轉(zhuǎn)化為3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的報道。

專利US 20120329108報道的酶轉(zhuǎn)化工藝用在原料藥合成的最后一步,因有殘留蛋白風(fēng)險,分離成本高。CN 201210555608報道的是用甲酯或乙酯作為底物,但是其穩(wěn)定性較差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種利用轉(zhuǎn)氨酶將3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯轉(zhuǎn)化為(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制備方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的生物制備方法，其以3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯為底物，在轉(zhuǎn)氨酶、氨基供體、輔因子及助溶劑存在下，發(fā)生反應(yīng)生成目標(biāo)產(chǎn)物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯，所述的反應(yīng)在pH為6.0～10.0的水相緩沖溶液中進(jìn)行。

優(yōu)選地，所述的轉(zhuǎn)氨酶為購自蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司的牌號為EW1101的轉(zhuǎn)氨酶。

優(yōu)選地，在起始反應(yīng)體系中，所述轉(zhuǎn)氨酶：所述氨基供體：所述輔因子：所述底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯的投料質(zhì)量比為0.05-0.15:1-1.5:0.005-0.015:1。

優(yōu)選地，所述的氨基供體為異丙胺。

優(yōu)選地，所述的助溶劑為吐溫60、DMSO或其組合。

優(yōu)選地，所述助溶劑的投料體積為反應(yīng)總體積的10％-25％。

優(yōu)選地，所述的輔因子為磷酸吡哆醛。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)在pH為9.5的水相緩沖溶液中進(jìn)行。

優(yōu)選地，所述的緩沖溶液為三乙醇胺-鹽酸緩沖溶液。

優(yōu)選地，具體實施過程如下：在反應(yīng)容器中依次加入所述的水相緩沖溶液、底物3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯、氨基供體、助溶劑、輔因子和轉(zhuǎn)氨酶，攪拌均勻，在25-45℃和氮氣吹掃的條件下，HPLC檢測反應(yīng)進(jìn)程，當(dāng)轉(zhuǎn)化率達(dá)90-99％時，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系pH至2-3，硅藻土過濾，并在濾液中加入乙酸乙酯進(jìn)行多次萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫去溶劑后得到(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯產(chǎn)品。

由于上述技術(shù)方案的運用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點：本發(fā)明采用了轉(zhuǎn)氨酶將3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯轉(zhuǎn)化為(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸叔丁酯，整個制備過程中，底物穩(wěn)定性好，酶轉(zhuǎn)化率高，操作簡單方便，后續(xù)產(chǎn)物無蛋白殘留，且產(chǎn)物的光學(xué)活性高。

具體實施方式

本發(fā)明的反應(yīng)式如下：

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體使用的不同要求做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實施條件為常規(guī)實驗中的條件。

實施例1

于20mL三口燒瓶中，依次加入0.1M pH 9.5三乙醇胺-鹽酸緩沖溶液3.2mL，底物500mg，異丙胺900μL，吐溫60 0.4mL，DMSO 0.4mL，磷酸吡哆醛(PLP)5mg，轉(zhuǎn)氨酶EW1101(蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司)50mg，于30℃，200rpm攪拌槳攪拌，0.01MPa氮氣吹掃的條件下，滴加4M異丙胺控制pH于9.5，反應(yīng)24h，HPLC檢測轉(zhuǎn)化率95％。加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至2-3，硅藻土過濾，加入等體積乙酸乙酯萃取兩次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到產(chǎn)物90mg，純度98％，光學(xué)純度>99％。

實施例2

于反應(yīng)器中，依次加入0.1M pH 9.5三乙醇胺-鹽酸緩沖溶液3.2L，底物500g，異丙胺900mL，吐溫60 0.4L，DMSO 0.4mL，磷酸吡哆醛(PLP)5g，轉(zhuǎn)氨酶EW1101(蘇州漢酶生物技術(shù)有限公司)50g，于30℃，機(jī)械攪拌，0.01MPa氮氣吹掃的條件下，滴加4M異丙胺控制pH于9.5，反應(yīng)24h，HPLC檢測轉(zhuǎn)化率95％。加入鹽酸調(diào)節(jié)pH至2-3，硅藻土過濾，加入等體積乙酸乙酯萃取兩次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到產(chǎn)物90g，純度98％，光學(xué)純度>99％。

上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。