本發(fā)明涉及生物催化技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及賴氨酸消旋酶快速消旋L-賴氨酸生成DL-賴氨酸，在L-賴氨酸單加氧酶和5-氨基酰胺水解酶催化作用下聯(lián)合生產(chǎn)D-賴氨酸和5-氨基戊酸。
背景技術(shù)：
D-賴氨酸為非蛋白質(zhì)氨基酸，它具有有效的抗真菌性和抗菌性，是新藥開發(fā)的重要藥物中間體，在醫(yī)藥上具有重要的作用。D-Lys是合成促黃體生成素釋放激素類似物的前體，也可以用于合成促性腺激素釋放激素高活性類似物，口服和靜脈給藥均可降低腫瘤治療中放射性肽的腎攝取。D-Lys比L-賴氨酸L-Lys更適合在癌癥治療中使用。D-賴氨酸的多聚體，能刺激人軟骨細(xì)胞和腦星形膠質(zhì)細(xì)胞的增值，也是一種良好的藥物載體。
5-氨基戊酸是一種重要的C5平臺化合物，在醫(yī)藥方面有著廣泛的應(yīng)用，例如可以作為合成5-羥基戊酸、戊二酸、1,5-戊二醇及其衍生物、戊二酸酐的重要前體，同時(shí)，它也可以用于合成尼龍-5,5（尸胺和戊二胺的共聚物）和尼龍-5（5-氨基戊酸均聚物）所以，5-氨基戊酸在紡織工業(yè)以及醫(yī)藥合成領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
目前，國內(nèi)外制備D-賴氨酸的方法主要是化學(xué)法，化學(xué)法是通過賴氨酸與手性酸生成非對映體鹽，利用非對映體鹽的溶解度差異而分離。通過化學(xué)方法來消旋制備DL-Lys的操作流程較為復(fù)雜，且成本較高，通常需要強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或者高溫的環(huán)境，然而，化學(xué)拆分DL-Lys的效率并不高，且產(chǎn)品的光學(xué)純度較低。生物酶法轉(zhuǎn)化因具有反應(yīng)條件溫和及催化效率高的優(yōu)點(diǎn)，已成為拆分或合成手性化合物的重要途徑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種綠色環(huán)保拆分DL-Lys的方法并且能夠聯(lián)產(chǎn)D-賴氨酸和5-氨基戊酸，與化學(xué)生產(chǎn)法相比，其反應(yīng)簡單，成本低廉，更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
一種生物法聯(lián)產(chǎn)D-賴氨酸和1,5-戊二胺的方法，其生產(chǎn)方法包括以下步驟：
步驟一、表達(dá)賴氨酸消旋酶的基因工程菌和表達(dá)L-賴氨酸單加氧酶和5-氨基酰胺水解酶的基因工程菌的構(gòu)建：
根據(jù)已報(bào)導(dǎo)的Proteus mirabilis BCRC10725來源賴氨酸消旋酶lyr的氨基酸序列（NCBI登錄號：WP_004243720.1）進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，全基因合成該序列，兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)NcoI和XhoI，亞克隆到載體pET28a上，獲得重組質(zhì)粒pET28a-lyr。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a-lyr用氯化鈣法轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌表達(dá)宿主BL21（DE3），得到賴氨酸消旋酶表達(dá)菌種BL21（DE3）/pET28a-lyr。
L-賴氨酸單加氧酶和5-氨基酰胺水解酶的基因工程菌的構(gòu)建方法如下（同申請?zhí)?01610500252X的專利中關(guān)于該菌株的構(gòu)建方法）：將davA（Gene ID: 1044092）片段與表達(dá)載體pET-22b相連，將davB （Gene ID: 1044093）片段與表達(dá)載體pRSF-dute相連，分別得到重組質(zhì)粒pET-22b-DavA和pRSF-davB，將重組質(zhì)粒pET-22b-DavA和pRSF-davB導(dǎo)入E.coliBL21的感受態(tài)細(xì)胞中，得到過表達(dá)了davBA的重組菌BL-22A-RB；另外將davA及davB片段與表達(dá)載體pET-22b相連，得到重組質(zhì)粒pET22b-DavBA，將重組質(zhì)粒pET22b-DavBA導(dǎo)入E.coliBL21的感受態(tài)細(xì)胞中，得到過表達(dá)了davBA的重組菌E.coliBL-22AB；將davA片段與表達(dá)載體pRSF-dute相連，得到重組質(zhì)粒pRSF-DavA，將重組質(zhì)粒pRSF-DavA導(dǎo)入重組菌E.coliBL-22AB的感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌株E.coliBL-22AB-RA；最后，將davB片段與表達(dá)載體pACYC-dute相連，得到重組質(zhì)粒pACYC-davB,將重組質(zhì)粒pACYC-davB導(dǎo)入重組菌BL-22A-RB的感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組菌株E.coli BL-22A-RB-YB。
步驟二、表達(dá)賴氨酸消旋酶的基因工程菌和表達(dá)L-賴氨酸單加氧酶和5-氨基酰胺水解酶的基因工程菌的培養(yǎng)：
挑取表達(dá)賴氨酸消旋酶的基因工程菌和表達(dá)L-賴氨酸單加氧酶和5-氨基酰胺水解酶的基因工程菌的單菌落，分別接種于LB培（酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl為5g/L）養(yǎng)基，置于37℃過夜培養(yǎng)；將所培養(yǎng)的賴氨酸消旋酶基因工程菌轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基，接種量為LB培養(yǎng)基體積的1%，然后在37℃培養(yǎng)2-3小時(shí)，加入IPTG至終濃度1mmol/L，表達(dá)賴氨酸消旋酶的基因工程菌30℃繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)；表達(dá)L-賴氨酸單加氧酶和5-氨基酰胺水解酶的基因工程菌20℃繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，揺瓶發(fā)酵結(jié)束后，分別離心收集表達(dá)賴氨酸消旋酶的基因工程菌和表達(dá)賴氨酸脫羧酶的基因工程菌，備用。
步驟三、以L-賴氨酸為原料，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)D-賴氨酸和5-氨基戊酸：
向磷酸鉀緩沖溶液中加入賴氨酸消旋酶全細(xì)胞和L-賴氨酸鹽酸鹽，37 ℃、200 r /min振蕩反應(yīng)1h；然后12000rpm，離心5min，去除賴氨酸消旋酶細(xì)胞；向體系中補(bǔ)加表達(dá)L-賴氨酸單加氧酶和5-氨基酰胺水解酶的基因工程菌，并調(diào)節(jié)PH至7.0，繼續(xù)37℃震蕩反應(yīng)15-40h，至高效液相色譜法檢測L-賴氨酸完全被消耗，停止反應(yīng)。
所述磷酸鉀緩沖溶液的濃度為0.2 mol/L，pH為7.0。
加入的賴氨酸消旋酶全細(xì)胞OD600=10，表達(dá)L-賴氨酸單加氧酶和5-氨基酰胺水解酶的基因工程菌OD600=40。
有益效果是：
1、本發(fā)明針對D-賴氨酸和5-氨基戊酸的市場需求，克服了D-賴氨酸在生產(chǎn)中利用化學(xué)消旋的弊端，采用純生物法消旋，在生物法拆分DL-賴氨酸過程中，將L-賴氨酸轉(zhuǎn)化為附加價(jià)值更高的5-氨基戊酸，從而實(shí)現(xiàn)純生物法聯(lián)產(chǎn)D-賴氨酸和的5-氨基戊酸目的。
2、本發(fā)明前后兩步催化反應(yīng)都采用全細(xì)胞催化，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)體系中只剩下D-賴氨酸和5-氨基戊酸，L-賴氨酸被全部轉(zhuǎn)化為5-氨基戊酸，使得D-賴氨酸的光學(xué)純度能夠達(dá)到98%以上。本方法的催化活性高，原料便宜，總的生產(chǎn)成本低，且轉(zhuǎn)化率高，適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的聯(lián)產(chǎn)D-賴氨酸和5-氨基戊酸的反應(yīng)原理示意圖。
具體實(shí)施方式
為更好的理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例做進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1：D-賴氨酸的高效液相色譜檢測方法
D-賴氨酸的檢測條件為：Agilent 1200 高效液相色譜；色譜柱為Chirex Chiral Columns；流動相：1mM CuSO4。5H2O溶于水：異丙醇=95:5；流速：0.8ml/min；溫度：25℃；波長：254nm。
實(shí)施例2：賴氨酸消旋酶、L-賴氨酸單加氧酶和5-氨基酰胺水解酶的誘導(dǎo)表達(dá)
表達(dá)賴氨酸消旋酶的基因工程菌的構(gòu)建：根據(jù)已報(bào)導(dǎo)的Proteus mirabilis BCRC10725來源賴氨酸消旋酶lyr的氨基酸序列（NCBI登錄號：WP_004243720.1）進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，全基因合成該序列，兩端設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)NcoI和XhoI，亞克隆到載體pET28a上，獲得重組質(zhì)粒pET28a-lyr。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET28a-lyr用氯化鈣法轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌表達(dá)宿主BL21（DE3），得到賴氨酸消旋酶表達(dá)菌種BL21（DE3）/pET28a-lyr。
表達(dá)L-賴氨酸單加氧酶和5-氨基酰胺水解酶的基因工程菌構(gòu)建方法如下：（1）davB由金唯智合成，酶切位點(diǎn)為NdeI和XhoI，將davB片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI處理回收后，與經(jīng)相同限制性內(nèi)切酶處理的載體pACYCDuet-1相連，使用T4DNA連接酶25℃連接30min；
（2）將（1）中的連接液轉(zhuǎn)入大腸桿菌Trans1-T1（由全式金生物技術(shù)有限公司提供）的感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在帶有氯霉素抗性的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)；
（3）挑?。?）中平板上生長的單菌落，轉(zhuǎn)接到含有氯霉素抗性的LB培養(yǎng)基里，然后提取質(zhì)粒，再利用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI進(jìn)行酶切驗(yàn)證，最后得到了載體pACYCDuet-1-davB；
（4）將載體pACYCDuet-1-davB轉(zhuǎn)入到E.coliBL-22A-RB的感受態(tài)細(xì)胞里，涂布在帶有氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性和氯霉素抗性的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)；
（5）挑?。?）中平板上生長的單菌落，轉(zhuǎn)接到含有氨芐青霉素抗性、卡那霉素抗性和氯霉素抗性的LB培養(yǎng)基里培養(yǎng)8-10h后，用30%的甘油保存在-80℃冰箱里，得到了E.coliBL-22A-RB-YB菌株。
挑取表達(dá)賴氨酸消旋酶的基因工程菌和表達(dá)L-賴氨酸單加氧酶和5-氨基酰胺水解酶的基因工程菌的單菌落，分別接種于LB培養(yǎng)基（酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl為5g/L），置于37℃過夜培養(yǎng)；將所培養(yǎng)的賴氨酸消旋酶基因工程菌轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基，接種量為LB培養(yǎng)基體積的1%，然后在37℃培養(yǎng)2-3小時(shí)，加入IPTG至終濃度1mmol/L，表達(dá)賴氨酸消旋酶的基因工程菌30℃繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，表達(dá)L-賴氨酸單加氧酶和5-氨基酰胺水解酶的基因工程菌20℃繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，揺瓶發(fā)酵結(jié)束后，分別離心收集表達(dá)賴氨酸消旋酶的基因工程菌和表達(dá)賴氨酸脫羧酶的基因工程菌，備用。
實(shí)施例3：L-賴氨酸單加氧酶和5-氨基酰胺水解酶拆分DL-賴氨酸反應(yīng)
在10mL 0.2 mol/L 磷酸鉀緩沖溶液(PH 7.0)中，賴氨酸消旋酶全細(xì)胞OD600=10，1.2g L-賴氨酸鹽酸鹽，37 ℃、200 r /min振蕩反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束后得到L-賴氨酸和D-賴氨酸的混旋物，然后12000rpm，離心5min，去除賴氨酸消旋酶細(xì)胞。
去除賴氨酸消旋酶后，向反應(yīng)體系中補(bǔ)加表達(dá)L-賴氨酸單加氧酶和5-氨基酰胺水解酶的基因工程菌細(xì)胞OD600=20，調(diào)節(jié)PH至7.0，繼續(xù)37℃震蕩反應(yīng)15h，至高效液相色譜法檢測L-賴氨酸完全被消耗，停止反應(yīng)。
結(jié)論：最終得到的D-賴氨酸的收率為48%，對映體過量值ee＞98%，5-氨基戊酸的轉(zhuǎn)化率為97%。
實(shí)施例4：不同表面活性劑對L-賴氨酸單加氧酶和5-氨基酰胺水解酶拆分DL-賴氨酸的影響
選取濃度為0.1g/L-0.7g/L等7個(gè)濃度梯度的Triton X-100。
在 0.2 mol/L 磷酸鉀緩沖溶液(PH 7.0)中，賴氨酸消旋酶全細(xì)胞OD600=10，1.2g L-賴氨酸鹽酸鹽，37 ℃、200 r /min振蕩反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束后得到L-賴氨酸和D-賴氨酸的混旋物，然后12000rpm，離心5min，去除賴氨酸消旋酶細(xì)胞。
去除賴氨酸消旋酶后，向反應(yīng)體系中補(bǔ)加表達(dá)L-賴氨酸單加氧酶和5-氨基酰胺水解酶的基因工程菌細(xì)胞OD600=20，調(diào)節(jié)PH至7.0，繼續(xù)37℃震蕩反應(yīng)40h，至高效液相色譜法檢測L-賴氨酸完全被消耗，停止反應(yīng)。
結(jié)論：當(dāng)Triton X-100的濃度為0.5g/L時(shí)，反應(yīng)速率有顯著提高。