專利名稱：突變細菌株的l－賴氨酸生產(chǎn)的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及微生物學和微生物遺傳學領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及在氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)中有用的新菌株、方法和工藝。相關(guān)技術(shù)
在意識到棒桿菌(Corynebacterium)可用于氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)(S.Kinoshita等，國際酶化學討論會的會報(Proceedings of InternationalSymposium on Enzyme Chemistry)2464-468(1957))之后，工業(yè)生產(chǎn)L-賴氨酸成為經(jīng)濟上重要的工業(yè)生產(chǎn)方法。商業(yè)生產(chǎn)這種必需氨基酸主要是利用革蘭氏陽性菌谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)和乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacteriumlactofermentum)來實現(xiàn)的(Kleemann，A.等，“氨基酸(Amino Acids)”，《Ullmann氏工業(yè)化學百科全書》(ULLMANN’S ENCYCLOPEDIA OFINDUSTRIAL CHEMISTRY)，第2卷，第57-97頁，WeinhamVCH-Verlagsgesellschaft(1985))。目前，這些生物每年產(chǎn)生約250,000噸L-賴氨酸。
通過分離產(chǎn)生更大量L-賴氨酸的突變菌株可以增加商業(yè)生產(chǎn)L-賴氨酸的效率。在生產(chǎn)氨基酸的微生物工藝中使用地微生物可劃分為4類野生型菌株、營養(yǎng)突變株、調(diào)節(jié)突變株(regulatory mutant)和營養(yǎng)缺陷型調(diào)節(jié)突變株(K.Nakayama等，《食物和食用蛋白質(zhì)的營養(yǎng)改良》(Nutritional Improvement of Food and Feed Proterins)，M.Friedman編，(1978)，第649-661頁)。棒桿菌和相關(guān)生物的突變株使得可以廉價地從便宜的碳源如糖蜜(mollasses)、乙酸和乙醇通過直接發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸。此外，通過發(fā)酵產(chǎn)生的氨基酸的立體專一性(L型異構(gòu)體)使得該方法優(yōu)于合成方法。
考慮到通過發(fā)酵方法生產(chǎn)L-賴氨酸在經(jīng)濟上的重要性，明顯地為了增加產(chǎn)生的L-賴氨酸的總量和降低生產(chǎn)成本，目前已對賴氨酸合成的生物化學途徑進行了深入研究(最近Sahm等，Ann.N.Y.Acad.Sci.78225-39(1996)對此作了綜述)。L-天冬氨酸是進入賴氨酸途徑的開端(見


圖1)，其本身通過草酰乙酸的轉(zhuǎn)氨基作用產(chǎn)生。谷氨酸棒桿菌的特殊性質(zhì)在于它能通過兩個不同的途徑，即通過涉及琥珀?；虚g物的反應(yīng)或通過二氨基庚二酸脫氫酶介導的單一反應(yīng)，將賴氨酸的中間物哌啶2，6-二羧酸轉(zhuǎn)化為二氨基庚二酸?？偟膩碚f，可在兩點上調(diào)節(jié)進入該途徑的碳流首先，通過L-蘇氨酸和L-賴氨酸水平對天冬氨酸激酶的反饋抑制；其次，通過對二氫吡啶二羧酸合成酶水平的控制。由此，可以通過下調(diào)和增加這兩個酶的活性在棒桿菌中增加L-賴氨酸的產(chǎn)生。
除了導致L-賴氨酸合成的生化途徑外，近來的證據(jù)指出L-賴氨酸向細胞外培養(yǎng)基中的運輸是開發(fā)超量產(chǎn)生賴氨酸的谷氨酸棒桿菌菌株的另一考慮因素。Kramer和同事的研究指出，由于膜滲漏造成的賴氨酸向細胞外的被動運輸不是賴氨酸外流的唯一解釋；他們的數(shù)據(jù)提示了具有如下性質(zhì)的特殊載體(1)該轉(zhuǎn)運蛋白對賴氨酸具有相當高的Km值(20mM)；(2)該轉(zhuǎn)運蛋白是OH-同向轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(攝取系統(tǒng)是H+反向轉(zhuǎn)運系統(tǒng))；和(3)該轉(zhuǎn)運蛋白帶正電荷，而且膜電位刺激分泌(S.Broer和R.Kramer，Eur.J.Biochem.202137-143(1991))。
本領(lǐng)域已知幾種利用分離出的具有營養(yǎng)缺陷或抗性性質(zhì)的各種菌株生產(chǎn)L-賴氨酸的發(fā)酵方法美國專利2,979,439公開了需要高絲氨酸(或甲硫氨酸和蘇氨酸)的突變株；美國專利3,700,557公開了對蘇氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、組氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸或半胱氨酸有營養(yǎng)需求的突變株；美國專利3,707,441公開了對賴氨酸類似物具有抗性的突變株；美國專利3,687,810公開了能夠產(chǎn)生L-賴氨酸并具有桿菌肽、青霉素G或多粘菌素抗性的突變株；美國專利3,708,395公開了對高絲氨酸、蘇氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸或它們的混合物具有營養(yǎng)需求并對賴氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸或其類似物具有抗性的突變株；美國專利3,825,472公開了對賴氨酸類似物具有抗性的突變株；美國專利4,169,763公開了產(chǎn)生L-賴氨酸并對至少一種天冬氨酸類似物和磺胺類藥劑具有抗性的棒桿菌屬突變菌株；美國專利5,846,790公開了在缺少任何的生物素作用抑制劑的情況下能夠產(chǎn)生L-谷氨酸和L-賴氨酸的突變菌株；美國專利5,650,304公開了對4-N-(D-丙氨?；?-2，4-二氨基-2，4-二脫氧-L-阿拉伯醣2，4-二脫氧-L-阿拉伯醣或其衍生物具有抗性的、產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌屬或短桿菌屬菌株。
在利用棒桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-賴氨酸的領(lǐng)域中，更近來的發(fā)展涉及到采用分子生物學技術(shù)增加賴氨酸的生產(chǎn)。提供以下實例作為此領(lǐng)域的例證美國專利申請4,560,654和5,236,831公開了通過用重組DNA分子轉(zhuǎn)化對S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸敏感的宿主棒桿菌屬或短桿菌屬微生物獲得的產(chǎn)L-賴氨酸突變菌株，在所述重組DNA分子中賦予S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸抗性和賴氨酸生產(chǎn)能力的DNA片段被插入載體DNA中；美國專利申請5,766,925公開了通過在具有滲漏型高絲氨酸脫氫酶的棒桿菌屬細菌或高絲氨酸脫氫酶基因缺陷型棒桿菌屬細菌的染色體DNA中整合編碼天冬氨酸激酶的基因產(chǎn)生的突變菌株，其中所述天冬氨酸激酶來源于棒桿菌并對L-賴氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制不敏感。
可以對打算利用細菌突變株的許多方法進行設(shè)計，以便減弱細菌的生長并由此通過補加其它營養(yǎng)物質(zhì)來增加氨基酸的產(chǎn)量。通常，設(shè)計用以提高來自底物(例如葡萄糖)的氨基酸產(chǎn)量百分數(shù)的突變株也將喪失如同其野生型菌株一樣的極強生長能力。除了導致氨基酸產(chǎn)量的整體下降外，這些突變株還需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)來支持其生長，這就會顯著地增加生產(chǎn)的成本。
因此，開發(fā)能夠以低生產(chǎn)成本最大化地產(chǎn)生特定氨基酸的新的產(chǎn)氨基酸細菌株是本領(lǐng)域中一直存在的需要。鑒于這些問題，一種可替代的方法包含采用特殊的突變株和培養(yǎng)基以增加生產(chǎn)力并降低成本。
發(fā)明概述
廣義上，本發(fā)明提供具有改良的提余液(raffinate)抗性和改良的生長性質(zhì)的新微生物，這使得可以產(chǎn)生更大產(chǎn)量的氨基酸。
本發(fā)明的第一個目的是提供制備產(chǎn)氨基酸能力增強的微生物的新方法。在本發(fā)明的第一個實施方案中，提供制備新菌株的方法，該方法通過誘變產(chǎn)氨基酸的親本細菌株，然后篩選具有改良提余液抗性的本發(fā)明菌株來實現(xiàn)。在本發(fā)明的一個更為具體的實施方案中，這些方法涉及產(chǎn)氨基酸的親本細菌株例如棒桿菌(Corynebacterium)和短桿菌(Brevibacterium)。一個尤其有利的實施方案涉及制備具有改良提余液抗性的產(chǎn)氨基酸細菌株的方法，該細菌株是產(chǎn)L-賴氨酸的短桿菌屬菌株。
本發(fā)明的另一目的涉及具有改良提余液抗性和改良生長特性的、產(chǎn)生更大量氨基酸的新細菌株。在第一個實施方案中，通過如下方法制備本發(fā)明細菌株，其中對親本細菌株進行誘變?nèi)缓蠛Y選具有改良的提余液抗性、改良的生長特性和氨基酸生產(chǎn)增加的突變后代細菌。一個更為具體的實施方案涉及具有改良的提余液抗性、改良的生長特性和氨基酸生產(chǎn)增加的新棒桿菌屬或短桿菌屬微生物。本發(fā)明尤其有利的實施方案涉及產(chǎn)生大量L-賴氨酸的短桿菌。最為有利的實施方案涉及菌株ADM L63.148(NRRL B-30059)、ADM L64.132(NRRL B-30060)、ADM L69.53(NRRLB-30061)、ADM L69.74(NRRL B-30062)、和ADM L69.100(NRRL B-30063)、或它們的突變株。
本發(fā)明的第三個目的是提供生產(chǎn)氨基酸的工藝，包括步驟(a)在含有提余液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌和(b)從該培養(yǎng)基中回收氨基酸。在一個優(yōu)選實施方案中，步驟(a)的培養(yǎng)細菌是通過如下方法獲得的，在該方法中對產(chǎn)氨基酸的親本細菌株進行誘變并篩選具有改良的提余液抗性、改良的生長特性和氨基酸生產(chǎn)增加的后代。有利的實施方案涉及利用棒桿菌或短桿菌生產(chǎn)氨基酸的工藝。氨基酸生產(chǎn)工藝的本發(fā)明尤其有利的實施方案利用產(chǎn)L-賴氨酸的短桿菌。
應(yīng)當理解，前述一般描述和之后的詳細描述僅是示例性和解釋性的，旨在對要求保護的本發(fā)明作進一步解釋。
附圖簡述
圖1.A)棒桿菌中導致L-賴氨酸產(chǎn)生的生化途徑的示意圖；B)棒桿菌中導致L-異亮氨酸產(chǎn)生的生化途徑的示意圖。
優(yōu)選實施方案的詳述1.定義
為了清晰和一致地理解說明書和權(quán)利要求，包括給定這些術(shù)語的范圍，提供以下定義。
高產(chǎn)衍生物本文所用該術(shù)語是指當與其來源的親本菌株比較時從右旋糖產(chǎn)生更高產(chǎn)量的特定氨基酸的微生物菌株。
突變本文所用該術(shù)語是指目的核苷酸序列中的單堿基改變、插入或缺失。
操縱子本文所用該術(shù)語是指細菌基因表達和調(diào)節(jié)的單元，包括結(jié)構(gòu)基因和DNA中的調(diào)節(jié)元件。
親本菌株本文所用該術(shù)語是指接受某種形式的誘變以產(chǎn)生本發(fā)明微生物的微生物菌株。
表型本文所用該術(shù)語是指取決于微生物遺傳組成的可見物理特性。
提余液本文所用該術(shù)語是指來自用于回收賴氨酸的離子交換操作的廢液產(chǎn)品。提余液含有大量硫酸銨、L-賴氨酸、其它氨基酸、鹽、和糖如異麥芽糖。采用熱處理滅菌含提余液的培養(yǎng)基產(chǎn)生抑制培養(yǎng)物生長的氨基酸衍生物和其它代謝拮抗劑。
經(jīng)熱滅菌含提余液的培養(yǎng)基可以用于篩選對其中所含抑制培養(yǎng)物生長的氨基酸衍生物具有抗性；對其中所含抑制培養(yǎng)物生長的代謝抑制劑具有抗性；和/或?qū)ζ渲兴种婆囵B(yǎng)物生長的賴氨酸降解產(chǎn)物和/或賴氨酸前體具有抗性的微生物，例如短桿菌或棒桿菌。
相對生長本文所用該術(shù)語是指在一段規(guī)定時間期限內(nèi)采用規(guī)定培養(yǎng)基通過直接比較親本菌株和后代菌株的生長以提供對生長的評價的測量法。
誘變本文所用該術(shù)語是指用于在DNA中產(chǎn)生突變的方法。采用“隨機”誘變，突變的確切位點是不可預(yù)測的，即可以發(fā)生在微生物基因組中的任何位置，而且造成該突變的原因是由放射或化學處理等因素引起的物理破壞。2.親本細菌株的誘變
本發(fā)明提供制備產(chǎn)生大量氨基酸并具有改良提余液抗性的微生物的方法。通過研究，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可以用提余液，即來自賴氨酸回收中離子交換操作的廢液產(chǎn)品，替代生長和氨基酸生物合成所必需的硫酸銨。提余液含有大量硫酸銨、L-賴氨酸、其它氨基酸、鹽、和糖如異麥芽糖。然而，在熱處理滅菌培養(yǎng)基的過程中，提余液培養(yǎng)基會產(chǎn)生大量抑制培養(yǎng)物生長的氨基酸衍生物和其它代謝拮抗劑。為了克服此問題，我們設(shè)計了一種方法來篩選能夠抵抗培養(yǎng)基中高水平的提余液并能增加其氨基酸產(chǎn)量的菌株。
本發(fā)明的細菌株優(yōu)選通過誘變親本細菌株然后篩選改良的提余液抗性表型來制備。親本微生物可以選自本領(lǐng)域已知的對于氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)有用的任何生物；有利的親本微生物是產(chǎn)生氨基酸的棒桿菌和短桿菌，最為尤其有利的生物是產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌和短桿菌。
在第一實施方案中，本發(fā)明提供制備具有改良提余液抗性的產(chǎn)氨基酸細菌株的方法，包括
(a)對親本細菌株A進行誘變；
(b)用含有按硫酸銨含量計至少約1％提余液的培養(yǎng)基接觸所述經(jīng)誘變的親本菌株A；
(c)選擇提余液抗性細菌株B；和
(d)測定所述提余液抗性細菌株B的L-賴氨酸生產(chǎn)。
親本菌株的誘變可以采用本領(lǐng)域已知的任何隨機誘變技術(shù)來進行，這些技術(shù)包括但不限于放射和化學方法。尤其優(yōu)選隨機化學誘變，最優(yōu)選采用適合藥劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)進行的誘變。
用于誘變和新細菌株篩選的一般方法是本領(lǐng)域所熟知的，描述于例如J.H.Miller，分子遺傳學實驗(Experiments in Molecular Genetics)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，紐約(1972)；J.H.Miller，細菌遺傳學短教程(A Short Course in BacterialGenetics)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，紐約(1992)；M.Singer和P.Berg，基因和基因組(Genes & Genomes)，University Science Books，Mill Valley，California(1991)；J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第2版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，紐約(1989)；P.B.Kaufman等，生物學和醫(yī)學中的分子和細胞方法手冊(Handbook of Molecular andCellular Methods in Biology and Medicine)，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)lorida(1995)；植物分子生物學和生物技術(shù)中的方法(Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology)，B.R.Glick和J.E.Thompson編，CRC Press，F(xiàn)lorida(1993)；和P.F.Smith-Keary，大腸桿菌的分子遺傳學(Molecular Genetics of Escherichia coli)，TheGuilford Press，紐約，NY(1989)。
本發(fā)明菌株具有改良的提余液抗性表型，該抗性表型是由所用選擇培養(yǎng)基中按硫酸銨含量度量的提余液濃度確定的。在第一實施方案中，可以在含有至少約1％提余液的培養(yǎng)基中進行表型篩選。在一個最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明微生物是在含有約5％提余液的培養(yǎng)基中選擇的。其它實例包括將含有至少約2％、3％、4％、5％、6％、7％和8％提余液的培養(yǎng)基用于改良提余液抗性菌株的篩選。
廣義上，本發(fā)明提供具有改良提余液抗性和改良生長特性、并能夠產(chǎn)生更高產(chǎn)量氨基酸的新微生物。本發(fā)明方法、工藝或微生物的一個重要要素或性質(zhì)與提余液抗性有關(guān)。
氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知本文所用術(shù)語“提余液”。然而，為了更為全面地詳細描述申請人的發(fā)明，本文提供了提余液的定義和其制備方法。
術(shù)語“提余液”與化學工程領(lǐng)域中的液-液提取領(lǐng)域有極為緊密的聯(lián)系。該術(shù)語在溶劑精制中定義為“被處理的液體混合物中未被選擇性溶劑溶解并且未被除去的那部分”(科學和技術(shù)術(shù)語詞典(Dictionary ofScientific and Technical Terms)，Sybil P.Parker編，McGraw-Hill(1989))。本文所用該術(shù)語與氨基酸分離過程中離子交換層析的應(yīng)用相關(guān)。以與液-液抽取方法類似的方式，與離子交換層析相連使用的術(shù)語提余液是指液體混合物中未被層析樹脂選擇性結(jié)合的那部分。更具體地，與氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)相聯(lián)系的提余液是指細胞培養(yǎng)基中未與層析柱結(jié)合的那部分；提余液是氨基酸的離子交換層析純化過程中產(chǎn)生的液體培養(yǎng)基流出廢液產(chǎn)品。典型地，本文所用提余液是指在初次對生長培養(yǎng)基使用離子交換樹脂后產(chǎn)生的第一道廢液產(chǎn)品。
多種離子交換層析方法可以用于氨基酸的純化。典型地，利用陽離子交換樹脂純化賴氨酸。可以利用固定床或模擬移動床樹脂進行離子交換層析。例如，Van Walsern和Thompson描述了用于分離賴氨酸的模擬移動床技術(shù)(Van Walsem，H.J.和Thompson，M.C.，生物技術(shù)雜志(J.Biotechnology)59127-132(1997))；美國專利4,714,767和5,684,190描述了固定床層析技術(shù)在氨基酸純化中的使用，而且Wolfgang和Prior利用環(huán)狀層析在糖的分離中實現(xiàn)了連續(xù)操作模式(Wolfgang，J.和Prior，A.，分離科學和技術(shù)(Separation Science and Technology)3271-82(1997))。因此，產(chǎn)生提余液的具體層析方法可以不同，但定義提余液的基本原則保持不變。
僅為了舉例的目的，申請人在實施例5中提供了用作細胞生長培養(yǎng)基補加物的提余液的制備細節(jié)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將明了，提余液可以根據(jù)從中分離提余液的發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生的具體氨基酸來定性表征；例如，當提余液分離自賴氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基時可以將其稱作賴氨酸提余液，當分離自甘氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基時稱作甘氨酸提余液，當分離自異亮氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基時可以稱作異亮氨酸提余液，等等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易明了，當本文采用一般術(shù)語提余液時，所選提余液的具體類型將取決于實施者的設(shè)計。
本文提供的實例用于對提余液，尤其是賴氨酸提余液的制備進行舉例說明。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，很明顯可以利用其它方法產(chǎn)生提余液。3.本發(fā)明改良的提余液抗性菌株
本發(fā)明的另一目的涉及具有改良的提余液抗性的產(chǎn)氨基酸微生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，可以篩選對任何特定類型的提余液，例如甘氨酸提余液、纈氨酸提余液、異亮氨酸提余液、賴氨酸提余液等，具有改良抗性的此類微生物。在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，該微生物具有改良的賴氨酸提余液抗性。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，該提余液抗性微生物是通過如下方法制備的，在該方法中
(a)對親本細菌株A進行誘變；
(b)用含有按硫酸銨含量計至少約1％提余液的培養(yǎng)基接觸該誘變親本菌株A；
(c)選擇提余液抗性細菌株B；和
(d)測定所述提余液抗性細菌株B的氨基酸生產(chǎn)。
對親本細菌株的選擇、誘變和對具有改良提余液抗性的本發(fā)明微生物的篩選可以按前述進行。
本發(fā)明更為具體的實施方案涉及棒桿菌或短桿菌；尤其有利的是產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌或短桿菌。
本發(fā)明還提供當生長在含有至少約1％提余液的培養(yǎng)基中時每24小時內(nèi)每升產(chǎn)生至少約10g L-賴氨酸的棒桿菌菌株。
本發(fā)明尤其有利的實施方案涉及產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌屬菌株，其中所述菌株選自NRRL B-30059、NRRL B-30060、NRRL B-30061、NRRLB-30062、NRRL B-30063和它們的突變株。4.氨基酸的生產(chǎn)和純化
本發(fā)明的其它實施方案涉及在含有提余液的培養(yǎng)基中生產(chǎn)氨基酸的工藝。這些工藝包括(a)培養(yǎng)改良提余液抗性細菌株和(b)從培養(yǎng)基中回收氨基酸。
在第一個具體實施方案中，本發(fā)明提供氨基酸生產(chǎn)工藝，包括
(a)在含有提余液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌株B，其中所述菌株是通過如下方法獲得的
(i)選擇產(chǎn)生氨基酸的親本細菌株A；
(ii)對所述親本菌株A進行誘變；
(iii)篩選具有改良的提余液抗性的細菌株B；和
(b)從該培養(yǎng)基中回收氨基酸。
對親本菌株的選擇、誘變和對具有改良提余液抗性的本發(fā)明微生物的篩選可以按前述進行。
在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，其它工藝涉及選自產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌屬和短桿菌屬微生物的親本菌株，本發(fā)明的一個最優(yōu)選實施方案涉及產(chǎn)L-賴氨酸的短桿菌屬親本菌株。
本發(fā)明工藝還可以隨培養(yǎng)本發(fā)明微生物的具體方法而改變。因此，有多種本領(lǐng)域已知的發(fā)酵技術(shù)可以用于本發(fā)明的氨基酸生產(chǎn)工藝中。
適合碳源的示例性例子包括，但不限于糖，如葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉水解物、纖維素水解物和糖蜜；有機酸，如乙酸、丙酸、甲酸、蘋果酸、檸檬酸、和反丁烯二酸；和醇，如甘油。
適合氮源的示例性例子包括，但不限于氨，包括氨氣和氨水；無機或有機酸的銨鹽，如氯化銨、磷酸銨、硫酸銨和乙酸銨；和其它含氮物，包括肉膏、胨、玉米漿、酪蛋白水解物、豆餅水解物和酵母提取物。
一般地，氨基酸可以在發(fā)酵工藝如分批型或補料分批型發(fā)酵工藝中根據(jù)本發(fā)明商業(yè)性地生產(chǎn)。在分批型發(fā)酵中，在發(fā)酵開始時加入所有養(yǎng)料。在補料分批或持續(xù)補料分批型發(fā)酵中，從發(fā)酵一開始或在培養(yǎng)物達到某個時期后，或當供給的一或多種養(yǎng)料從培養(yǎng)液中被耗盡時，向培養(yǎng)物中連續(xù)不斷地供給一或多種養(yǎng)料。持續(xù)單批的補料分批型發(fā)酵的變體是重復補料分批或補充-抽取式(fill-and-draw)發(fā)酵，其中在持續(xù)補給養(yǎng)料不時地(例如發(fā)酵罐裝滿時)移出發(fā)酵罐中的部分內(nèi)容物。以此方式，可以更長時間地持續(xù)進行發(fā)酵。
另一發(fā)酵類型，即連續(xù)發(fā)酵或恒化培養(yǎng)，采用連續(xù)補給全部培養(yǎng)基的形式進行，并同時連續(xù)不斷地或半連續(xù)地抽取培養(yǎng)物液體以便發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液體積大約保持恒定。連續(xù)發(fā)酵在原則上可以維持無限長的時間。
在分批發(fā)酵中，生物體一直生長至培養(yǎng)基中的一種必需養(yǎng)料耗竭時，或直到發(fā)酵條件變得不利(例如，pH降低至對微生物生長產(chǎn)生抑制的值)為止。在補料分批發(fā)酵中，通常采取措施(例如通過采用pH控制)以維持有利的生長條件，并通過向培養(yǎng)物中補加一或多種必需養(yǎng)料防止這些養(yǎng)料的耗竭。微生物將以養(yǎng)料補給速度所規(guī)定的生長速度持續(xù)生長。一般單純一種養(yǎng)料，極常見的是碳源，即可限制生長。相同的原理被應(yīng)用到連續(xù)發(fā)酵中，通常在供給的培養(yǎng)基中一種養(yǎng)料是受限的，而其它所有養(yǎng)料均過剩。受限的養(yǎng)料將在培養(yǎng)物液體中以極低的濃度，常常是無法測量到的低濃度，存在?？梢圆捎貌煌愋偷臓I養(yǎng)限制。最常采用的是碳源限制。其它例子有氮源造成的限制、氧造成的限制、特殊養(yǎng)料如維生素或氨基酸(當微生物是該化合物的營養(yǎng)缺陷型時)造成的限制、硫造成的限制和磷造成的限制。
回收和純化氨基酸(尤其是L-賴氨酸)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。典型地，可以在離心和過濾除去細胞后，通過陽離子交換從生長培養(yǎng)基中回收氨基酸。美國專利5,684,190描述了對L-賴氨酸等氨基酸的回收，該回收涉及到(1)在低于該氨基酸等電點的pH下將含有氨基酸的水性溶液通過第一個陽離子交換樹脂以使該氨基酸吸附在樹脂上，隨后通過采用氫氧化銨增加pH以洗脫該氨基酸，產(chǎn)生第一溶液；和(2)以相似的方式將此第一溶液通過第二個陽離子交換樹脂以進一步清除雜質(zhì)。
另一個例子可參見美國專利4,714,767，該專利提供了一種采用系列陽離子交換樹脂塔以從水性溶液中分離堿性氨基酸的方法。該方法包括依次的重復吸附和洗脫步驟，其中用于這些吸附和洗脫步驟的洗滌水是通過在隨后的循環(huán)中重新循環(huán)從前一個塔的吸附步驟或洗脫步驟中排出的液體的較后部分而產(chǎn)生的。
從這些陽離子交換分離程序獲得的洗脫物可以通過蒸發(fā)濃縮，此外蒸發(fā)還可以除去氨。然后可以采用鹽酸從溶液中結(jié)晶氨基酸，產(chǎn)生例如L-賴氨酸·HCl·2H2O。在離心或過濾后，干燥此分離的L-賴氨酸晶體。
實施例
實施例1
誘變、篩選和選擇
具有改良提余液抗性的微生物
對其生長受到較高濃度提余液抑制的產(chǎn)賴氨酸菌株如T125、L58.23和96T116進行誘變，然后回收對較高濃度提余液表現(xiàn)出抗性的突變株。為了進行誘變，在B培養(yǎng)基(表1)中將細菌培養(yǎng)物培養(yǎng)至對數(shù)中期，通過離心沉淀后在15ml聚丙烯錐形管中將之重懸在2ml過濾除菌的TM緩沖液(Tris·HCl 6.0g/L，順丁烯二酸5.8g/L，(NH4)2SO4 1.0g/L，Ca(NO3)25mg/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.25mg/L，采用KOH調(diào)節(jié)至pH6.0)中。將此2ml細胞懸浮物與50μl 5.0mg/L N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)混合，然后30℃孵育30分鐘。作為對照，以相似方式對未經(jīng)處理的細胞懸浮物進行孵育以估計殺傷率。孵育后，向每個管中加入10ml TM緩沖液，并通過離心沉淀細胞，在TM緩沖液中洗滌細胞兩次，然后將細胞重懸在4.0ml采用KOH調(diào)節(jié)至pH7.2的0.1M NaH2PO4(磷酸緩沖液)中。將洗滌過的細胞懸液在磷酸緩沖液中作進一步稀釋，并將部分涂布在A培養(yǎng)基(表1)平板上。30℃孵育4-6天后，挑取生長在A培養(yǎng)基瓊脂上的菌落，并在搖瓶和發(fā)酵罐中測試其從右旋糖產(chǎn)生L-賴氨酸的改良潛能。
實施例2
菌株在提余液培養(yǎng)基中的生長
對于每種被測試菌株(表2)，將0.1ml的冷凍培養(yǎng)物接種在含有20ml提余液培養(yǎng)基C(表1)的250ml帶擋板瓶中，然后30℃以240rpm孵育18個小時。孵育后，取出50μl培養(yǎng)物，并按1∶100的比例稀釋在0.1NHCl溶液中。采用分光光度計測量該稀釋樣品在660nm的光密度(OD)。結(jié)果顯示在表2中。在提余液培養(yǎng)基C中，具有改良提余液抗性(RF)的所有菌株，即L63.148、L64.132、L69.53和L69.74，均比其親本菌株，即108T125、LS8.23和96T116，生長更好(更高的OD)。
實施例3
搖瓶發(fā)酵中右旋糖的消耗、生長、和賴氨酸的產(chǎn)生
對于每種菌株，將0.1ml冷凍培養(yǎng)物接種在含有20ml種子培養(yǎng)基C的250ml帶擋板瓶中，30℃以240rpm孵育18小時。將2ml種子培養(yǎng)物接種在含有20ml發(fā)酵培養(yǎng)基D的250ml帶擋板瓶中。然后在30℃以240rpm對這些搖瓶振搖24小時。發(fā)酵24小時后，取出樣品用于分析。為了測量右旋糖的濃度，取出100μl樣品，用去離子(DI)水按1∶50稀釋，然后采用YSI生化分析儀(Yellow Springs Instrument Co.Inc.)進行測量。用HPLC測定L-賴氨酸的濃度。按實施例2所述進行光密度測量以檢測生長。結(jié)果顯示在表3中；所有提余液抗性菌株，L63.148、L64.132、L69.53和L69.74，均比其親本菌株，108T125、L58.23和96T116，生長更好、更為有效地利用右旋糖、和產(chǎn)生更多的L-賴氨酸。
實施例4
在小規(guī)模的發(fā)酵罐中的生長和L-賴氨酸產(chǎn)生
采用一種兩階段接種方法設(shè)置小規(guī)模的發(fā)酵。第一階段培養(yǎng)基由50.0g/l蔗糖、3.0g/l K2HPO4、3.0g/l尿素、0.5g/l MgSO4·7H2O、30.0g/l豆蛋白胨、5.0g/l酵母提取物、0.765mg/l生物素、3.0mg/l鹽酸硫胺素、和0.125g/l煙酰胺組成。采用培養(yǎng)物接種含有500ml該培養(yǎng)基的2升帶擋板搖瓶，30℃以250rpm孵育19小時。此時，采用22.5ml該成熟的第一培養(yǎng)物接種第二階段接種培養(yǎng)基。
在6.6升發(fā)酵罐中采用3000ml培養(yǎng)基制備第二階段接種物。該培養(yǎng)基配方是20.0g/l(db)玉米漿、10.0g/l提余液形式的硫酸銨、12.0mg/lMnSO4·H2O、3.0gml/l生物素、3.0g/l鹽酸硫胺素、125mg/l煙酰胺、0.5mls/l消泡劑、和60g/l右旋糖，其以360g/l溶液的形式單獨滅菌后臨接種前加入發(fā)酵罐中。發(fā)酵罐在32℃、1.2vvm空氣、600rpm、和7.2的pH控制點下進行操作。pH的控制通過加入NH3或NH4OH來實現(xiàn)。18-20小時后，接種物被認為成熟，然后用于接種生產(chǎn)階段的容器。
生產(chǎn)階段培養(yǎng)基由40g/l(db)玉米漿、20g/l提余液形式的硫酸銨、12.0mg/l MnSO4·H2O、0.75mls/l消泡劑、和12g/l右旋糖，其以250g/l溶液的形式單獨滅菌后在臨接種前加入。培養(yǎng)基配方是以包括500ml成熟的第二階段培養(yǎng)液作為接種物的2.1升初始體積為基礎(chǔ)的。操作參數(shù)如下32℃、2.1vvm空氣、和7.2的起始及控制點pH。再次用NH3或NH4OH進行pH控制。最初以600rpm振搖，在第9小時培養(yǎng)時間時增加至700rpm，在第19小時的培養(yǎng)時間時增加至900rpm。根據(jù)由于右旋糖消耗引起的pH增加所指示的，按需要補加右旋糖和硫酸銨的混合物進行發(fā)酵。補料的制備方式是單獨滅菌2310g右旋糖+800mls水以及含有總共176g硫酸銨的提余液量，然后在冷卻至室溫后合并這兩種溶液?？偟陌l(fā)酵時間為48小時。容器大小與產(chǎn)生第二階段接種物所用的相同。
在小規(guī)模發(fā)酵中比較親本菌株與上述分離物的實驗結(jié)果顯示在表4中。
實施例5
提余液的制備
如前所述，提余液可以根據(jù)從中分離提余液的發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生的具體氨基酸來定性表征。此處提供的此實施例是用于制備賴氨酸提余液的。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，其它類型的提余液，例如纈氨酸或異亮氨酸提余液等，可以通過簡單地以適合的發(fā)酵培養(yǎng)基如纈氨酸或異亮氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基等開始，按相似的方式產(chǎn)生。
作為制備賴氨酸提余液的第一個步驟，將賴氨酸發(fā)酵生長培養(yǎng)基稀釋到65.5g/l的賴氨酸濃度。經(jīng)超濾產(chǎn)生40.3g/l賴氨酸濃度的透過物后，將該透過物濃縮到123g/l賴氨酸，總固體濃度為207g/l。
然后將透過濃縮物添加到層析分離系統(tǒng)，如Advanced SeperationTechnologies Incorporated(St.Petersburg，F(xiàn)L)制造的I-SEP或C-SEP中。離子交換層析分離系統(tǒng)是本領(lǐng)域通常知道的，實例參見美國專利4,808,317和4,764,276，這些文獻以參考文獻形式并入本文。由此獲得的廢流出液被認為是“稀釋的賴氨酸提余液”溶液。該稀釋的賴氨酸提余液溶液具有5.1的pH，并含有34.3g/l硫酸銨和2.8g/l賴氨酸，總固體水平為67g/l。
將此稀釋的賴氨酸提余液溶液濃縮至295g/l總固體。經(jīng)測定的此“濃縮賴氨酸提余液”溶液的成分包括137.9g/l硫酸銨、14.8g/l賴氨酸、8.7g/l纈氨酸、8.1g/l丙氨酸、2.4g/l乳酸和2.2g/l乙酸。將此濃縮賴氨酸提余液溶液用于培養(yǎng)基的制備。
表
實施例部分中引用了下列表格。
表1
實施例1、2和3中所用培養(yǎng)基1.玉米漿的量以每升培養(yǎng)基中干固體的克數(shù)來表示。2.提余液的量以每升培養(yǎng)基中硫酸銨的克數(shù)來表示。
表2
菌株在含有提余液的培養(yǎng)基C中的生長1.菌株108T125、L58.23和96T116是用于產(chǎn)生本發(fā)明改良提余液抗性菌 株的親本野生型菌株。2.菌株L63.148、L64.123、L69.53和L69.74是來源于其上述野生型親 本菌株的改良提余液抗性(RF)菌株。
表3
在培養(yǎng)基D中經(jīng)24小時搖瓶發(fā)酵后
菌株的右旋糖消耗(Dex)、生長(OD660)、和賴氨酸生產(chǎn)(Lys)
表4
6.6升發(fā)酵罐中親本和后代的
生長(OD660)和L-賴氨酸生產(chǎn)的比較1.總產(chǎn)量是指收獲的發(fā)酵罐中賴氨酸的總克數(shù)。2.基于初始的2.1升體積進行計算。
關(guān)于保藏的微生物的說明
(PCT實施細則第13條之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
關(guān)于保藏的微生物的說明
(PCT實施細則第13條之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
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(PCT實施細則第13條之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
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(PCT實施細則第13條之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
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(PCT實施細則第13條之二)
PCT/RO/134表(1992年7月)
權(quán)利要求
1.制備具有改良的提余液抗性的產(chǎn)氨基酸菌株B的方法，包括
(a)對親本細菌株A進行誘變；
(b)用含有按硫酸銨含量計至少約1％提余液的培養(yǎng)基接觸所述經(jīng)誘變
的親本菌株A；
(c)篩選提余液抗性細菌株B；和
(d)測定所述提余液抗性細菌株B的氨基酸生產(chǎn)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中對所述親本細菌株進行隨機化學誘變。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述親本細菌株選自
(a)棒桿菌屬的種(Corynebacterium sp.)；
(b)短桿菌屬的種(Brevibacterium sp.)；
(c)大腸桿菌(Escherichia coli)；和
(d)芽孢桿菌屬的種(Bacillus sp.)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述細菌株B產(chǎn)生選自下組的氨基酸
(a)甘氨酸；
(b)丙氨酸；
(c)甲硫氨酸；
(d)苯丙氨酸；
(e)色氨酸；
(f)脯氨酸；
(g)絲氨酸；
(h)蘇氨酸；
(i)半胱氨酸；
(j)酪氨酸；
(k)天冬酰胺；
(l)谷氨酰胺；
(m)天冬氨酸；
(n)谷氨酸；
(o)賴氨酸；
(p)精氨酸；
(q)組氨酸；
(r)異亮氨酸；
(s)亮氨酸；和
(t)纈氨酸。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述親本細菌株是產(chǎn)L-賴氨酸的棒桿菌屬的種。
6.通過如下方法制備的產(chǎn)氨基酸細菌株B，在該方法中
(a)對親本細菌株A進行誘變；
(b)用含有按硫酸銨含量計至少約1％提余液的培養(yǎng)基接觸該經(jīng)誘變的
親本菌株；
(c)從所述經(jīng)誘變的親本菌株中篩選提余液抗性細菌株B；并
(d)測定所述細菌株B的氨基酸生產(chǎn)。
7.權(quán)利要求6的細菌株，其中該親本細菌株A選自
(a)棒桿菌屬的種；
(b)短桿菌屬的種；
(c)大腸桿菌；和
(d)芽孢桿菌屬的種。
8.權(quán)利要求7的細菌株，其中所述細菌株B產(chǎn)生選自下組的氨基酸
(a)甘氨酸；
(b)丙氨酸；
(c)甲硫氨酸；
(d)苯丙氨酸；
(e)色氨酸；
(f)脯氨酸；
(g)絲氨酸；
(h)蘇氨酸；
(i)半胱氨酸；
(j)酪氨酸；
(k)天冬酰胺；
(l)谷氨酰胺；
(m)天冬氨酸；
(n)谷氨酸；
(o)賴氨酸；
(p)精氨酸；
(q)組氨酸；
(r)異亮氨酸；
(s)亮氨酸；和
(t)纈氨酸。
9.棒桿菌屬菌株，其在生長于含有至少約1％提余液的培養(yǎng)基中時，24小時內(nèi)產(chǎn)生至少約10g/l L-賴氨酸。
10.短桿菌屬菌株，其在生長于含有至少約1％提余液的培養(yǎng)基中時，24小時內(nèi)產(chǎn)生至少約10g/l L-賴氨酸。
11.產(chǎn)L-賴氨酸的細菌株，其中所述菌株選自
(a)NRRL B-30059；
(b)NRRL B-30060；
(c)NRRL B-30061；
(d)NRRL B-30062；
(e)NRRL B-30063；和
(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的突變株。
12.權(quán)利要求11的菌株，其中所述菌株是NRRL B-30059。
13.權(quán)利要求11的菌株，其中所述菌株是NRRL B-30060。
14.權(quán)利要求11的菌株，其中所述菌株是NRRL B-30061。
15.權(quán)利要求11的菌株，其中所述菌株是NRRL B-30062。
16.權(quán)利要求11的菌株，其中所述菌株是NRRL B-30063。
17.用于氨基酸生產(chǎn)的工藝，包括
(a)在含有提余液的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細菌B，其中所述菌株是通過如下方
法獲得的
(i)選擇產(chǎn)氨基酸的親本細菌株A；
(ii)對所述親本菌株進行誘變；
(iii)從所述經(jīng)誘變的親本菌株中篩選具有改良的提余液抗性的
細菌株B；和
(b)從該培養(yǎng)基中回收該氨基酸。
18.權(quán)利要求17的工藝，其中培養(yǎng)基中提余液的濃度為按硫酸銨含量計至少約1％。
19.權(quán)利要求17的工藝，其中產(chǎn)生的L-賴氨酸量為24小時內(nèi)至少約10克/升L-賴氨酸。
20.權(quán)利要求17的工藝，其中提余液在培養(yǎng)基中的濃度為按硫酸銨含量計至少約1％，而產(chǎn)生的L-賴氨酸量為24小時內(nèi)至少約10克/升L-賴氨酸。
21.權(quán)利要求17的工藝，其中該提余液的濃度為按硫酸銨含量計約5％，而產(chǎn)生的L-賴氨酸量為24小時內(nèi)至少約10克/升L-賴氨酸。
22.權(quán)利要求17的工藝，其中細菌B選自
(a)棒桿菌屬的種；
(b)短桿菌屬的種；
(c)大腸桿菌；和
(d)芽孢桿菌屬的種。
23.權(quán)利要求22的工藝，其中細菌B是選自下組的棒桿菌屬菌株
(a)NRRL B-30059；
(b)NRRL B-30060；
(c)NRRL B-30061；
(d)NRRL B-30062；
(e)NRRL B-30063；和
(f)(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的突變株。
全文摘要
本發(fā)明提供新的微生物、其制備方法和用于生產(chǎn)氨基酸的新工藝。對親本細菌株的誘變和對改良提余液抗性表型的篩選使得能夠分離出產(chǎn)生更大量氨基酸的、具有增強生長特性的菌株。本發(fā)明的微生物是從產(chǎn)氨基酸的親本菌株例如棒桿菌屬或短桿菌屬制備的。尤其優(yōu)選產(chǎn)生L－賴氨酸的親本菌株。
文檔編號C12R1/15GK1367827SQ00811098
公開日2002年9月4日 申請日期2000年8月1日 優(yōu)先權(quán)日1999年8月2日
發(fā)明者H·J·劉, J·M·愛丁頓, 楊月琴, R·丹西, S·斯維舍, 毛維穎 申請人:阿徹-丹尼爾斯-米德蘭公司