專利名稱：回流工藝生產(chǎn)ε－聚－L－賴氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種回流工藝生產(chǎn)ε-聚-L-賴氨酸的方法。
背景技術(shù)：
ε-聚-L-賴氨酸是由白色鏈霉菌分泌的含有25～30個(gè)賴氨酸殘基的多肽，它水溶性好，易溶于水、微溶于乙醇，但不溶于乙酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶劑；抑菌譜廣，在酸性和微酸性環(huán)境中對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌都有抑制作用，最低抑菌濃度低于100μg/mL，但對(duì)于霉菌和酵母菌的抑制濃度要高一些，最低抑菌濃度低于250μg/mL，且對(duì)耐熱性芽孢桿菌和一些病菌也有抑制作用，在一定條件下，可使某些噬菌體明顯失活；熱穩(wěn)定性高，ε-聚-L-賴氨酸在100℃煮沸30min或120℃滅菌20min情況下也不會(huì)降解；ε-聚-L-賴氨酸能在人體內(nèi)分解為賴氨酸，而賴氨酸是人體必需的八種氨基酸之一，也是世界范圍內(nèi)各國允許在食品中強(qiáng)化的一種氨基酸，因此其安全性高。2004年1月FDA批準(zhǔn)ε-聚-L-賴氨酸可以作為食品添加劑使用，并主要用于肉制品、高鹽食品、快餐、色拉、蛋糕和面點(diǎn)類食品等。因此ε-聚L-賴氨酸是一種非常理想的生物防腐劑。
已知有一種發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚-L-賴氨酸的方法(巖田敏治等人在中國申請(qǐng)的專利，專利名稱為大量生產(chǎn)ε-聚-L-賴氨酸的菌株和生產(chǎn)方法，專利號(hào)為97182253.0)是在培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株B21021(FERM BP-5926)，然后從培養(yǎng)基中分離和純化ε-聚-L-賴氨酸。該菌株是通過對(duì)小白鏈霉菌lysinopolymerus亞種11011A-1菌株(FERM BP-1109)進(jìn)行誘變處理而獲得的，其對(duì)濃度為10mg/mL或更高的S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸具有抗性。
在現(xiàn)有的ε-聚-L-賴氨酸提取工藝中，后期的穿透液和后期的洗脫液是直接排放出去的，沒有任何措施進(jìn)行處理或者再利用，容易造成環(huán)境污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種采用回流工藝生產(chǎn)ε-聚-L-賴氨酸的方法，該方法可將提取過程的后期穿透液循環(huán)使用，流加發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚-L-賴氨酸，后期的洗脫液用于下一批洗脫。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是一種回流工藝生產(chǎn)ε-聚-L-賴氨酸的生產(chǎn)方法是步驟1采用從土壤中篩選所獲得的白色鏈霉菌(Streptomyces albulus)在培養(yǎng)基進(jìn)行ε-聚-L-賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)，培養(yǎng)條件為pH 6.8左右、溫度25～35℃、好氣條件下振蕩培養(yǎng)或攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)15～30h，80～100h結(jié)束發(fā)酵；步驟2將結(jié)束發(fā)酵后的發(fā)酵液離心、過濾除去菌體及部分固形物，上清液經(jīng)脫色及采用陰離子交換樹脂去除游離強(qiáng)酸根后，經(jīng)陽離子交換樹脂進(jìn)行吸附后，用鹽酸洗脫，收集前期洗脫液脫色后，再經(jīng)過濾、真空濃縮、干燥，得到ε-聚-L-賴氨酸；后期洗脫液留存待用。
步驟3在發(fā)酵罐內(nèi)采用白色鏈霉菌(Streptomyces albulus)進(jìn)行ε-聚-L-賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)，培養(yǎng)條件為pH 6.8左右、溫度25～35℃、轉(zhuǎn)速220r/min左右，好氣條件下振蕩培養(yǎng)或攪拌培養(yǎng)15～30h，流加提取過程的后期穿透液，繼續(xù)培養(yǎng)40～60h，結(jié)束發(fā)酵后離心除去菌體及部分固形物，上清液采用陽離子交換樹脂交換后進(jìn)行吸附并洗脫，收集前期洗脫液經(jīng)脫色后，再經(jīng)過濾、真空濃縮、干燥，得到ε-聚-L-賴氨酸；后期洗脫液留存待用。
步驟4循環(huán)步驟3。
而且，所述的實(shí)驗(yàn)室保藏菌種白色鏈霉菌(Streptomyces albulus)是對(duì)S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸、甘氨酸和磺胺胍都具有抗性。
而且，所述的陽離子交換樹脂為D152型弱酸性陽離子交換樹脂；所述的陰離子交換樹脂為已處理為氯型或氫氧根的D392型弱堿性的陰離子交換樹脂。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是本發(fā)明改變了現(xiàn)有生產(chǎn)工藝步驟，將提取的后期洗脫液液流加發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚-L-賴氨酸，不僅提高了ε-聚-L-賴氨酸的產(chǎn)率，節(jié)約了成本而且減少了環(huán)境污染；由于采用陰離子交換樹脂對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行脫色，脫色效果明顯，損失減少。
具體實(shí)施例方式
以下對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例做進(jìn)一步詳述，但不局限于本實(shí)施例需要說明的是實(shí)施例1及實(shí)施例2基本上敘述的是現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝；實(shí)施例3及實(shí)施例5基本上敘述的是現(xiàn)有的循環(huán)生產(chǎn)工藝；實(shí)施例4及實(shí)施例6為分別與實(shí)施例3與實(shí)施例5相對(duì)比的創(chuàng)新工藝。
實(shí)施例15L發(fā)酵罐，裝入2.7L培養(yǎng)基，接種300mL白色鏈霉菌的種子培養(yǎng)液，30℃培養(yǎng)，待DO降至30％時(shí)自動(dòng)控制為30％，好氣培養(yǎng)96h，空氣流速為3L/min～7.5L/min。當(dāng)pH降至5.8左右時(shí)，流加氨水(25～28％)維持pH為5.8至發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛冉抵?0g/L時(shí)通過流加使殘?zhí)菨舛染S持在10g/L左右，同時(shí)不再控制pH讓其自然降至4并控制在4。流加物葡萄糖800g/L，(NH4)2SO480g/L。
培養(yǎng)96h，結(jié)束發(fā)酵，離心除去菌體及部分固形物，上清液用D152型弱酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行洗脫，收集前期洗脫液，經(jīng)過濾，真空濃縮，旋風(fēng)干燥器干燥，得到ε-聚-L-賴氨酸。后期洗脫液留待以后洗脫用。
實(shí)施例230L發(fā)酵罐，裝入13.5L培養(yǎng)基，接種1500mL白色鏈霉菌的種子培養(yǎng)液，30℃培養(yǎng)，待DO降至30％時(shí)自動(dòng)控制為30％，好氣培養(yǎng)96h，空氣流速為15L/min～30L/min。當(dāng)pH降至5.8左右時(shí)，流加氨水(25～28％)維持pH為5.8至發(fā)酵液中的殘?zhí)菨舛冉抵?0g/L時(shí)通過流加使殘?zhí)菨舛染S持在10g/L左右，同時(shí)不再控制pH讓其自然降至4并控制在4。流加物葡萄糖800g/L，(NH4)2SO480g/L。
培養(yǎng)96h，結(jié)束發(fā)酵，離心除去菌體及部分固形物，上清液用D152型弱酸性陽離子交換樹脂進(jìn)行交換吸附后洗脫，收集前期洗脫液脫色，過濾，經(jīng)真空濃縮，旋風(fēng)干燥器干燥，得到ε-聚-L-賴氨酸。后期洗脫液留待下次洗脫用。
實(shí)施例3500mL三角瓶(本實(shí)施例中的發(fā)酵罐是以三角瓶為例進(jìn)行敘述，以下同)，裝90mL培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中接入10mL白色鏈霉菌的種子培養(yǎng)液，30℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速220r/min，好氣培養(yǎng)48h。
培養(yǎng)48h后ε-聚-L-賴氨酸的產(chǎn)量如表1所示。
實(shí)施例4500mL三角瓶，裝90mL培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中接入10mL白色鏈霉菌的種子培養(yǎng)液，30℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速220r/min，好氣培養(yǎng)24h時(shí)，流加10mL提取過程的后期穿透液，繼續(xù)培養(yǎng)至48h。
培養(yǎng)48h后ε-聚-L-賴氨酸的產(chǎn)量如表1所示。
表1

實(shí)施例5500mL三角瓶，裝90mL培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中接入10mL白色鏈霉菌的種子培養(yǎng)液，30℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速220r/min，好氣培養(yǎng)60h。
培養(yǎng)60h后ε-聚-L-賴氨酸的產(chǎn)量如表2所示。
實(shí)施例6500mL三角瓶，裝90mL培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中接入10mL白色鏈霉菌的種子培養(yǎng)液，30℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速220r/min，好氣培養(yǎng)24h時(shí)，流加10mL提取的后期穿透液，繼續(xù)培養(yǎng)至60h。
培養(yǎng)60h后ε-聚-L-賴氨酸的產(chǎn)量如表2所示。
表2

權(quán)利要求
1.一種回流工藝生產(chǎn)ε-聚-L-賴氨酸的方法，其特征在于生產(chǎn)方法是步驟1采用從土壤中篩選所獲得白色鏈霉菌(Streptomyces albulus)在培養(yǎng)基進(jìn)行ε-聚-L-賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)，培養(yǎng)條件為pH6.8左右、溫度25～35℃、好氣條件下振蕩培養(yǎng)或攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)15～30h，80～100h結(jié)束發(fā)酵；步驟2將結(jié)束發(fā)酵后的發(fā)酵液離心除去菌體及部分固形物，上清液采用陽離子交換樹脂進(jìn)行交換吸附后洗脫，收集的前期洗脫液，經(jīng)陰離子交換樹脂脫色后，再經(jīng)過濾、真空濃縮、干燥，得到ε-聚-L-賴氨酸；后期洗脫液留待下次備用；步驟3在發(fā)酵罐內(nèi)采用白色鏈霉菌(Streptomyces albulus)進(jìn)行ε-聚-L-賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)，培養(yǎng)條件為pH6.8左右、溫度25～35℃、轉(zhuǎn)速220r/min左右，好氣條件下振蕩培養(yǎng)或攪拌培養(yǎng)15～30h，流加提取過程中產(chǎn)生的后期穿透液，繼續(xù)培養(yǎng)40～60h，結(jié)束發(fā)酵后離心除去菌體及部分固形物，上清液采用陽離子交換樹脂進(jìn)行洗脫，前期洗脫液經(jīng)陰離子交換樹脂脫色后，再經(jīng)過濾、真空濃縮、干燥，得到ε-聚-L-賴氨酸；收集后期洗脫液留存待用；步驟4循環(huán)步驟3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的回流工藝生產(chǎn)ε-聚-L-賴氨酸的方法，其特征在于所述的實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選獲得菌種白色鏈霉菌(Streptomyces albulus)是對(duì)S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸、甘氨酸和磺胺胍都具有抗性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的回流工藝生產(chǎn)ε-聚-L-賴氨酸的方法，其特征在于所述的陽離子交換樹脂為D152型弱酸性陽離子交換樹脂；所述的陰離子交換樹脂為已處理為氯型和氫氧根型的D392型弱堿性的陰離子交換樹脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種回流工藝生產(chǎn)ε－聚－L－賴氨酸的方法，是采用從土壤中篩選所獲得的白色鏈霉菌(Streptomyces albulus)[對(duì)S－(2－氨基乙基)－L－半胱氨酸(以下簡(jiǎn)稱AEC)、甘氨酸和磺胺胍都具有抗性]進(jìn)行ε－聚－L－賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)，將提取過程的后期穿透液循環(huán)使用，進(jìn)行流加發(fā)酵生產(chǎn)ε－聚－L－賴氨酸；洗脫過程的后期洗脫液循環(huán)使用，用于下一批洗脫；用陰離子交換樹脂對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行脫色。本發(fā)明改變了已有生產(chǎn)工藝步驟。不僅提高了ε－聚－L－賴氨酸的產(chǎn)率，節(jié)約了成本而且減少了發(fā)酵廢液和洗脫用鹽酸廢液的排放，減輕環(huán)境污染；由于采用陰離子交換樹脂對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行脫色，脫色效果明顯，損失減少。
文檔編號(hào)C12R1/47GK101078021SQ200610013800
公開日2007年11月28日 申請(qǐng)日期2006年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月22日
發(fā)明者賈士儒, 曹偉峰, 張愷瑞, 譚之磊, 孫艷芳, 李婷 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)