L-賴氨酸基因工程生產(chǎn)菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種L-賴氨酸基因工程生產(chǎn) 菌。
【背景技術(shù)】
[0002] L-賴氨酸作為人類和動(dòng)物必需的氨基酸之一，在飼料添加劑、食品強(qiáng)化劑和醫(yī)藥 產(chǎn)品等方面被廣泛使用，其中約90%用于飼料工業(yè)，10%用于食品和醫(yī)藥行業(yè)。目前，L-賴 氨酸已是世界上第二大氨基酸品種。
[0003] L-賴氨酸的生產(chǎn)方法主要有四種，分別是提取法、化學(xué)合成法、酶法和微生物發(fā)酵 法，前三種方法由于前體物成本高、工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)，難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的目的，發(fā)酵法 制備L-賴氨酸是當(dāng)前的主要生產(chǎn)方式。發(fā)酵法生產(chǎn)L-賴氨酸的微生物主要是谷氨酸棒桿 菌和大腸桿菌，黃色短桿菌、枯草芽孢桿菌等也有使用。
[0004] 利用谷氨酸棒桿菌或黃色短桿菌生產(chǎn)L-賴氨酸，多采用誘變方法獲得高產(chǎn)菌 株。1960年日本的木下祝郎、中山清等經(jīng)紫外誘變獲得了一株谷氨酸棒桿菌營養(yǎng)缺陷 型菌株，開始了發(fā)酵法生產(chǎn) L-賴氨酸。Chaudhuri A(Chaudhuri A, Mishra AK, Nanda G. Lysine excretion by S_(2-aminoethyl)L-cysteine resistant mutants of Bacillus subtilis.Acta Microbiol Pol. 1983 ;32(1):37_45.)等以枯草芽抱桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng) MNNG誘變處理后，利用AEC平板進(jìn)行抗反饋抑制天冬氨酸激酶突變株的篩選，再利用紫外 誘變，獲得了產(chǎn)酸達(dá)21g/L的突變株。但是由于谷氨酸棒桿菌和短桿菌的最適生長溫度是 30度，生產(chǎn)效率在一定程度上制約了大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸的需求，另外傳統(tǒng)誘變方法由 于其局限性，獲取高產(chǎn)菌株的難度非常大。
[0005] 隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，大腸桿菌作為背景研宄得最為清楚的模式微生物，具 有生長速度快，遺傳操作方法成熟的特點(diǎn)，適合作為宿主菌發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸。大腸桿菌 合成賴氨酸通過天冬氨酸途徑，從天冬氨酸開始，經(jīng)過九步酶催化途徑合成賴氨酸。天 冬氨酸激酶（IysC編碼）作為合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶，受該途徑的末端產(chǎn)物賴氨 酸反饋抑制，Brigitte Dauce-Le Reverend (Brigitte Dauce-Le Reverend, Middle Boitel, Alain M. Deschamps,et al. Improvement of Escherichia coli strains overproducing lysine using recombinant DNA techniques. European J Appl Microbiol Biotechnol (1982) 15:227-231.)等報(bào)道的高產(chǎn)賴氨酸的大腸桿菌TOC R21中的IysC發(fā)生 了突變，天冬氨酸激酶活力較野生型提高了 10倍。二氫吡啶二羧酸合酶（dapA編碼）作為 賴氨酸生物合成分支途徑中的第一個(gè)酶，也是控制L-賴氨酸產(chǎn)量的最主要酶，在大腸桿菌 中，dapA被賴氨酸抑制；而在黃色短桿菌或谷氨酸棒桿菌中，dapA不被末端產(chǎn)物賴氨酸抑 制，Jong -Won Oh(Jong-Won Oh, Jin-Ho Lee Kap-Soo Noh, Hyune-Hwan Lee, et al. Improved L-Iysine production by the amplification of the Corynebacterium glutamicum dapA gene encoding dihydrodipicolinate synthetase in E. coli. Biotechnology letters Vol 13No 10,727-737(1991).)等將谷氨酸棒桿菌的dapA基因在大腸桿菌中進(jìn)行過表達(dá)， 提高了賴氨酸產(chǎn)量。日本味之素申請(qǐng)的專利US6040160中，報(bào)道了解除dapA、IysC反饋抑 制作用的突變位點(diǎn)，增強(qiáng)了大腸桿菌L-賴氨酸合成途徑相關(guān)基因的表達(dá)，過表達(dá)了來源于 谷氨酸棒桿菌的二氨基庚二酸脫氫酶基因（ddh)，可直接催化四氫二吡啶二羧酸轉(zhuǎn)化為二 氨基庚二酸，提高了 L-賴氨酸產(chǎn)量，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到了 30% ;在EP0796912A1專利中，同時(shí) 失活L-賴氨酸脫羧酶基因 cadA和ldcC，減少了 L-賴氨酸降解，使賴氨酸產(chǎn)量增加了約2. 3 倍。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明利用基因工程技術(shù)改造大腸桿菌，并根據(jù)代謝流分析，增強(qiáng)L-賴氨酸合成 途徑的相關(guān)基因，弱化分支代謝途徑，篩選獲得一株L-賴氨酸高產(chǎn)菌株CCTCC M 2015232， 能有效的積累L-賴氨酸，具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
[0007] 因此，本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種L-賴氨酸基因工程生產(chǎn)菌的構(gòu)建方法。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種L-賴氨酸基因工程生產(chǎn)菌。
[0009] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種L-賴氨酸的生產(chǎn)方法。
[0010] 本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供所述L-賴氨酸基因工程生產(chǎn)菌用于生產(chǎn)L-賴氨酸 的應(yīng)用。
[0011] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的第一個(gè)方面，一種L-賴氨酸基因工程生產(chǎn)菌的構(gòu)建方法，包括以下 步驟：
[0013] A、敲除原始菌株中與L-賴氨酸代謝途徑相關(guān)的基因，獲得基因敲除菌株，所述敲 除的基因選自：cadA、ldcC、gltl、thrC、cynT、thrL和maeB中的一個(gè)或多個(gè)；
[0014] B、增強(qiáng)步驟A中所述基因敲除菌株中與L-賴氨酸代謝途徑相關(guān)的基因，獲得基因 增強(qiáng)菌株，所述增強(qiáng)的基因選自：ybjE和cyo operon中的一個(gè)或多個(gè)；
[0015] C、構(gòu)建包含過表達(dá)原始菌株中與L-賴氨酸代謝途徑相關(guān)的基因的重組質(zhì)粒，所 述過表達(dá)的基因選自 dapA* (H118Y)、IysO (M318I, G333D)、dapB* (I114T)、ddh、ppc、aspA、 pntAB和asd中的一個(gè)或多個(gè)；
[0016] D、將步驟C中所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入步驟A中所述基因敲除菌株和/或步驟B中所述 基因增強(qiáng)菌株中，獲得L-賴氨酸基因工程生產(chǎn)菌。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述的L-賴氨酸基因工程生產(chǎn)菌的構(gòu)建方法包括以 下步驟：
[0018] A、敲除原始菌株中與L-賴氨酸代謝途徑相關(guān)的基因，獲得基因敲除菌株，所述敲 除的基因?yàn)?cadA、ldcC、gltl、thrC、cynT、thrL 和 maeB ;
[0019] B、增強(qiáng)步驟A中所述基因敲除菌株中與L-賴氨酸代謝途徑相關(guān)的基因，獲得基因 增強(qiáng)菌株，所述增強(qiáng)的基因?yàn)閥bjE和cyo operon ;
[0020] C、構(gòu)建包含過表達(dá)原始菌株中與L-賴氨酸代謝途徑相關(guān)的基因的重組質(zhì)粒，所 述過表達(dá)的基因?yàn)?dapA*(H118Y)、lysC*(M318I，G333D)、dapB*(I114T)、ddh、ppc、aspA、 pntAB 和 asd ;
[0021] D、將步驟C中所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入步驟B中所述基因增強(qiáng)菌株中，獲得L-賴氨酸基 因工程生產(chǎn)菌。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，所述原始菌株為大腸桿菌。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述大腸桿菌為大腸桿菌MG1655。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的第二個(gè)方面，根據(jù)如上所述的方法構(gòu)建獲得的L-賴氨酸基因工程 生產(chǎn)菌。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明，一種L-賴氨酸基因工程生產(chǎn)菌，保藏號(hào)為CCTCC M 2015232。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的第三個(gè)方面，一種L-賴氨酸的生產(chǎn)方法，通過發(fā)酵如上所述的L-賴 氨酸基因工程生產(chǎn)菌生產(chǎn)。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述發(fā)酵的發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖20g/L， (NH 4) 2S0416g/L，KH2PO4L Og/L，MgSO4 · 7H20 1.0 g/L，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0· 01g/L，MnSO4 · 7H20 0· 01g/L，酵母粉 2g/L，CaC0330g/L，KOH 調(diào) pH7. 0。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的第四個(gè)方面，如上所述的L-賴氨酸基因工程菌可用