本發(fā)明屬于疫苗生產(chǎn)制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種C群腦膜炎球菌高密度產(chǎn)糖的方法。
背景技術(shù)：
流行性腦脊髓膜炎是一種由奈瑟氏腦膜炎球菌(Neisseriameningitidis)引起的急性呼吸道傳染病。一百多年來,一直在世界各地流行或散在發(fā)生,感染病原菌后可引起敗血癥、腦膜炎。易感人群主要為兒童,以暴發(fā)型病死率最高,可達40％～60％。當(dāng)今世界各大洲發(fā)病率在1/10萬～10/10萬,總病死率在5％～15％,高達20％的腦膜炎患者會有神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,包括智力受損和耳聾等。
腦膜炎球菌根據(jù)莢膜多糖型別進行血清學(xué)分類可分13個血清型,其中A群,B群,C群約占流行菌群的90％。其中A群腦膜炎球菌是較大流行的主要致病血清群，特別是在所謂的非洲“流腦流行帶”，每隔7～14年就會出現(xiàn)一次較大流行，引起兒童和年輕成人超額發(fā)病率與死亡率。近年來，一些西方國家則出現(xiàn)過C群引起的流腦爆發(fā)。我國于1938年、1949年、1959年、1967年和1977年發(fā)生過5次全國性流腦流行。其中以1967年春季最為嚴重,發(fā)病率高達403/10萬,病死率為5.49％。我國過去90％以上的病例是A群病菌致病,現(xiàn)在B群或C群病菌有時亦引起流腦暴發(fā)。2003年開始,C群流腦的發(fā)病率明顯上升。目前A群和C群共占所有血清群的50％以上,且C群仍有進一步增高的趨勢。
即使是在醫(yī)療條件比較完善的地方，流腦病死率仍然很高(5-15％)。一般來說，僅靠藥物預(yù)防措施來控制此病是不夠的。目前預(yù)防流腦最有效的方法是接種疫苗。我國從2007年起已將流腦疫苗納入國家免疫規(guī)劃，在全國范圍對適齡兒童普及接種。
目前國際市場的疫苗主要有群特異的莢膜多糖聯(lián)合疫苗(A+C疫苗，或A、C、Y和W135疫苗)或C群莢膜多糖與蛋白載體結(jié)合的結(jié)合疫苗。多糖疫苗安全并具有較高的免疫原性，但多糖疫苗對2歲以下兒童效果不理想。另一方面，已經(jīng)上市的C群結(jié)合疫苗即使在很小的兒童也安全有效。
制備C群腦膜炎球菌多糖結(jié)合疫苗首先要獲得C群腦膜炎球菌莢膜多糖。目前大規(guī)模生產(chǎn)C群腦膜炎球菌莢膜多糖的工藝主要是通過發(fā)酵罐培養(yǎng)C群腦膜炎球菌，然后通過一系列分離純化技術(shù)制備細菌夾膜多糖。但是，現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的細菌莢膜多糖產(chǎn)量低、質(zhì)量不高、且在發(fā)酵過程中核酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)含量高，不利用后續(xù)多糖純化。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種C群腦膜炎球菌高密度產(chǎn)糖的方法，該方法操作簡單、制備方便、成本低、適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：一種C群腦膜炎球菌高密度產(chǎn)糖的方法，它包括以下步驟：
S1.開啟菌種及傳代：開啟C群腦膜炎球菌菌種傳代至氯化血紅素流行性腦膜炎半綜合培養(yǎng)基上，放入二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中，35～37℃培養(yǎng)16～24h，經(jīng)擴增培養(yǎng)，將菌種量放大；
S2.種子罐培養(yǎng)：將放大后的C群腦膜炎球菌種子接種到種子罐中，恒溫培養(yǎng)4～8h，所述培養(yǎng)的條件為：溫度35～37℃，攪拌轉(zhuǎn)速150～250rpm，通氣量為10～20L/min，培養(yǎng)至種子罐中菌濃度OD600≥2.0時結(jié)束培養(yǎng)，轉(zhuǎn)種到發(fā)酵罐；
S3.發(fā)酵：將種子罐中的細菌接種到發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，所述發(fā)酵的條件為：溫度35～37℃，攪拌轉(zhuǎn)速200～300rpm，通氣量20～50L/min，發(fā)酵過程中加入葡萄糖溶液，當(dāng)細菌生長至對數(shù)生長末期或穩(wěn)定生長期前期時，停止發(fā)酵；
S4.純化莢膜多糖：將發(fā)酵后的細菌采用甲醛殺菌后收集莢膜多糖并純化，即制得精制得C群腦膜炎球菌多糖。
進一步地，所述氯化血紅素流行性腦膜炎半綜合培養(yǎng)基由下述原料組成：每100ml培養(yǎng)基中含有酸水解酪蛋白5g、磷酸二氫鉀0.2g、七水合硫酸鎂0.06g、葡萄糖0.5g、無水乙酸鈉0.5g、瓊脂粉2g、可溶性淀粉0.5g、氯化血紅素6mg。
進一步地，步驟S1中將菌種量放大至接種種子罐后初始菌濃度的OD600≥0.15。
進一步地，步驟S2中種子罐中培養(yǎng)基和步驟S3中發(fā)酵罐中培養(yǎng)基均由下述原料組成：每100ml培養(yǎng)基中含有酸水解酪蛋白20g、磷酸氫二鈉1.0g、磷酸二氫鉀0.2g、氯化銨1.5g、甘氨酸0.1g、L-谷氨酸鈉1.0g、葡萄糖5g、七水合硫酸鎂0.6g。
進一步地，步驟S3中所述葡萄糖溶液的質(zhì)量百分比濃度為15～25％。
進一步地，步驟S4所述純化莢膜多糖的具體操作為：
(1)制得粗制多糖：將發(fā)酵后的細菌采用甲醛殺菌后離心收集上清夜，加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度為1.0g/L，充分攪拌后靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用氯化鈣溶液解離2.5～3.5h，離心收集上清液，上清液中加入乙醇至終濃度為25％，2～8℃靜置過夜，離心，棄去沉淀，上清液中再加入乙醇至終濃度為75～85％，振蕩后并靜置至少18h，沉淀用無水乙醇和丙酮洗滌并干燥即為粗制多糖；
(2)精制：將粗制多糖溶于10％的飽和中性醋酸鈉溶液中，按體積比為1:1的比例加入冷酚溶液，振蕩離心收集上清液，抽提1～3次至上清液澄清，上清液用超濾膜包超濾，超濾后的多糖溶液加入NaCl溶液至其終濃度為0.3mol/L，然后加入乙醇至乙醇的終濃度為75％，充分混勻后2～8℃靜置過夜，收集沉淀，依次用無水乙醇和丙酮洗滌并干燥，即為精制得C群腦膜炎球菌多糖。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點：本發(fā)明建立了一套使用發(fā)酵罐高密度培養(yǎng)C群腦膜炎球菌產(chǎn)莢膜多糖的方法，可以將C群腦膜炎球菌培養(yǎng)達到較高的濃度，增加莢膜多糖的產(chǎn)量；同時控制發(fā)酵液中的核酸和蛋白等雜質(zhì)含量處于較低水平，較低的蛋白含量減少了苯酚抽提去除雜蛋白的次數(shù)，降低了后續(xù)純化過程中的苯酚用量，減少對環(huán)境的污染，降低生產(chǎn)成本；本發(fā)明在現(xiàn)有工藝的基礎(chǔ)上提高了約100％的莢膜多糖產(chǎn)量，并且莢膜多糖經(jīng)檢驗符合國家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，部分雜質(zhì)的含量低于國家藥典的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的描述，本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所述。
實施例1：一種C群腦膜炎球菌高密度產(chǎn)糖的方法，它包括以下步驟：
S1.開啟菌種及傳代：開啟C群腦膜炎球菌菌種傳代至氯化血紅素流行性腦膜炎半綜合培養(yǎng)基上，放入二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中，35℃培養(yǎng)16h，經(jīng)擴增培養(yǎng)，將菌種量放大至接種種子罐后初始菌濃度的OD600≥0.15；所述氯化血紅素流行性腦膜炎半綜合培養(yǎng)基由下述原料組成：每100ml培養(yǎng)基中含有酸水解酪蛋白5g、磷酸二氫鉀0.2g、七水合硫酸鎂0.06g、葡萄糖0.5g、無水乙酸鈉0.5g、瓊脂粉2g、可溶性淀粉0.5g、氯化血紅素6mg；
S2.種子罐培養(yǎng)：將放大后的C群腦膜炎球菌種子接種到種子罐中，恒溫培養(yǎng)4h，所述培養(yǎng)的條件為：溫度35℃，攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，通氣量為10L/min，培養(yǎng)至種子罐中菌濃度OD600≥2.0時結(jié)束培養(yǎng)，轉(zhuǎn)種到發(fā)酵罐；種子罐中培養(yǎng)基由下述原料組成：每100ml培養(yǎng)基中含有酸水解酪蛋白20g、磷酸氫二鈉1.0g、磷酸二氫鉀0.2g、氯化銨1.5g、甘氨酸0.1g、L-谷氨酸鈉1.0g、葡萄糖5g、七水合硫酸鎂0.6g；
S3.發(fā)酵：將種子罐中的細菌接種到發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，所述發(fā)酵的條件為：溫度35℃，攪拌轉(zhuǎn)速200rpm，通氣量20L/min，發(fā)酵過程中加入質(zhì)量百分比濃度為15％％的葡萄糖溶液，當(dāng)細菌生長至對數(shù)生長末期或穩(wěn)定生長期前期時，停止發(fā)酵；發(fā)酵罐中培養(yǎng)基均由下述原料組成：每100ml培養(yǎng)基中含有酸水解酪蛋白20g、磷酸氫二鈉1.0g、磷酸二氫鉀0.2g、氯化銨1.5g、甘氨酸0.1g、L-谷氨酸鈉1.0g、葡萄糖5g、七水合硫酸鎂0.6g；
S4.純化莢膜多糖：純化莢膜多糖的具體操作為：
(1)制得粗制多糖：將發(fā)酵后的細菌采用甲醛殺菌后離心收集上清夜，加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度為1.0g/L，充分攪拌后靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用氯化鈣溶液解離2.5h，離心收集上清液，上清液中加入乙醇至終濃度為25％，2℃靜置過夜，離心，棄去沉淀，上清液中再加入乙醇至終濃度為75％，振蕩后并靜置至少18h，沉淀用無水乙醇和丙酮洗滌并干燥即為粗制多糖；
(2)精制：將粗制多糖溶于10％的飽和中性醋酸鈉溶液中，按體積比為1:1的比例加入冷酚溶液，振蕩離心收集上清液，抽提1次至上清液澄清，上清液用超濾膜包超濾，超濾后的多糖溶液加入NaCl溶液至其終濃度為0.3mol/L，然后加入乙醇至乙醇的終濃度為75％，充分混勻后2℃靜置過夜，收集沉淀，依次用無水乙醇和丙酮洗滌并干燥，即為精制得C群腦膜炎球菌多糖。
實施例2：一種C群腦膜炎球菌高密度產(chǎn)糖的方法，它包括以下步驟：
S1.開啟菌種及傳代：開啟C群腦膜炎球菌菌種傳代至氯化血紅素流行性腦膜炎半綜合培養(yǎng)基上，放入二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h，經(jīng)擴增培養(yǎng)，將菌種量放大至接種種子罐后初始菌濃度的OD600≥0.15；所述氯化血紅素流行性腦膜炎半綜合培養(yǎng)基由下述原料組成：每100ml培養(yǎng)基中含有酸水解酪蛋白5g、磷酸二氫鉀0.2g、七水合硫酸鎂0.06g、葡萄糖0.5g、無水乙酸鈉0.5g、瓊脂粉2g、可溶性淀粉0.5g、氯化血紅素6mg；
S2.種子罐培養(yǎng)：將放大后的C群腦膜炎球菌種子接種到種子罐中，恒溫培養(yǎng)8h，所述培養(yǎng)的條件為：溫度37℃，攪拌轉(zhuǎn)速250rpm，通氣量為20L/min，培養(yǎng)至種子罐中菌濃度OD600≥2.0時結(jié)束培養(yǎng)，轉(zhuǎn)種到發(fā)酵罐；種子罐中培養(yǎng)基由下述原料組成：每100ml培養(yǎng)基中含有酸水解酪蛋白20g、磷酸氫二鈉1.0g、磷酸二氫鉀0.2g、氯化銨1.5g、甘氨酸0.1g、L-谷氨酸鈉1.0g、葡萄糖5g、七水合硫酸鎂0.6g；
S3.發(fā)酵：將種子罐中的細菌接種到發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，所述發(fā)酵的條件為：溫度37℃，攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，通氣量50L/min，發(fā)酵過程中加入質(zhì)量百分比濃度為25％的葡萄糖溶液，當(dāng)細菌生長至對數(shù)生長末期或穩(wěn)定生長期前期時，停止發(fā)酵；發(fā)酵罐中培養(yǎng)基均由下述原料組成：每100ml培養(yǎng)基中含有酸水解酪蛋白20g、磷酸氫二鈉1.0g、磷酸二氫鉀0.2g、氯化銨1.5g、甘氨酸0.1g、L-谷氨酸鈉1.0g、葡萄糖5g、七水合硫酸鎂0.6g；
S4.純化莢膜多糖：純化莢膜多糖的具體操作為：
(1)制得粗制多糖：將發(fā)酵后的細菌采用甲醛殺菌后離心收集上清夜，加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度為1.0g/L，充分攪拌后靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用氯化鈣溶液解離3.5h，離心收集上清液，上清液中加入乙醇至終濃度為25％，8℃靜置過夜，離心，棄去沉淀，上清液中再加入乙醇至終濃度為85％，振蕩后并靜置至少18h，沉淀用無水乙醇和丙酮洗滌并干燥即為粗制多糖；
(2)精制：將粗制多糖溶于10％的飽和中性醋酸鈉溶液中，按體積比為1:1的比例加入冷酚溶液，振蕩離心收集上清液，抽提3次至上清液澄清，上清液用超濾膜包超濾，超濾后的多糖溶液加入NaCl溶液至其終濃度為0.3mol/L，然后加入乙醇至乙醇的終濃度為75％，充分混勻后8℃靜置過夜，收集沉淀，依次用無水乙醇和丙酮洗滌并干燥，即為精制得C群腦膜炎球菌多糖。
實施例3：一種C群腦膜炎球菌高密度產(chǎn)糖的方法，它包括以下步驟：
S1.開啟菌種及傳代：開啟C群腦膜炎球菌菌種傳代至氯化血紅素流行性腦膜炎半綜合培養(yǎng)基上，放入二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中，36℃培養(yǎng)18h，經(jīng)擴增培養(yǎng)，將菌種量放大至接種種子罐后初始菌濃度的OD600≥0.15；所述氯化血紅素流行性腦膜炎半綜合培養(yǎng)基由下述原料組成：每100ml培養(yǎng)基中含有酸水解酪蛋白5g、磷酸二氫鉀0.2g、七水合硫酸鎂0.06g、葡萄糖0.5g、無水乙酸鈉0.5g、瓊脂粉2g、可溶性淀粉0.5g、氯化血紅素6mg；
S2.種子罐培養(yǎng)：將放大后的C群腦膜炎球菌種子接種到種子罐中，恒溫培養(yǎng)5h，所述培養(yǎng)的條件為：溫度36℃，攪拌轉(zhuǎn)速180rpm，通氣量為14L/min，培養(yǎng)至種子罐中菌濃度OD600≥2.0時結(jié)束培養(yǎng)，轉(zhuǎn)種到發(fā)酵罐；種子罐中培養(yǎng)基由下述原料組成：每100ml培養(yǎng)基中含有酸水解酪蛋白20g、磷酸氫二鈉1.0g、磷酸二氫鉀0.2g、氯化銨1.5g、甘氨酸0.1g、L-谷氨酸鈉1.0g、葡萄糖5g、七水合硫酸鎂0.6g；
S3.發(fā)酵：將種子罐中的細菌接種到發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，所述發(fā)酵的條件為：溫度36℃，攪拌轉(zhuǎn)速250rpm，通氣量35L/min，發(fā)酵過程中加入質(zhì)量百分比濃度為18％的葡萄糖溶液，當(dāng)細菌生長至對數(shù)生長末期或穩(wěn)定生長期前期時，停止發(fā)酵；發(fā)酵罐中培養(yǎng)基均由下述原料組成：每100ml培養(yǎng)基中含有酸水解酪蛋白20g、磷酸氫二鈉1.0g、磷酸二氫鉀0.2g、氯化銨1.5g、甘氨酸0.1g、L-谷氨酸鈉1.0g、葡萄糖5g、七水合硫酸鎂0.6g；
S4.純化莢膜多糖：純化莢膜多糖的具體操作為：
(1)制得粗制多糖：將發(fā)酵后的細菌采用甲醛殺菌后離心收集上清夜，加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度為1.0g/L，充分攪拌后靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用氯化鈣溶液解離3h，離心收集上清液，上清液中加入乙醇至終濃度為25％，4℃靜置過夜，離心，棄去沉淀，上清液中再加入乙醇至終濃度為78％，振蕩后并靜置至少18h，沉淀用無水乙醇和丙酮洗滌并干燥即為粗制多糖；
(2)精制：將粗制多糖溶于10％的飽和中性醋酸鈉溶液中，按體積比為1:1的比例加入冷酚溶液，振蕩離心收集上清液，抽提2次至上清液澄清，上清液用超濾膜包超濾，超濾后的多糖溶液加入NaCl溶液至其終濃度為0.3mol/L，然后加入乙醇至乙醇的終濃度為75％，充分混勻后4℃靜置過夜，收集沉淀，依次用無水乙醇和丙酮洗滌并干燥，即為精制得C群腦膜炎球菌多糖。
實施例4：一種C群腦膜炎球菌高密度產(chǎn)糖的方法，它包括以下步驟：
S1.開啟菌種及傳代：開啟C群腦膜炎球菌菌種傳代至氯化血紅素流行性腦膜炎半綜合培養(yǎng)基上，放入二氧化碳細胞培養(yǎng)箱中，36℃培養(yǎng)22h，經(jīng)擴增培養(yǎng)，將菌種量放大至接種種子罐后初始菌濃度的OD600≥0.15；所述氯化血紅素流行性腦膜炎半綜合培養(yǎng)基由下述原料組成：每100ml培養(yǎng)基中含有酸水解酪蛋白5g、磷酸二氫鉀0.2g、七水合硫酸鎂0.06g、葡萄糖0.5g、無水乙酸鈉0.5g、瓊脂粉2g、可溶性淀粉0.5g、氯化血紅素6mg；
S2.種子罐培養(yǎng)：將放大后的C群腦膜炎球菌種子接種到種子罐中，恒溫培養(yǎng)7h，所述培養(yǎng)的條件為：溫度36℃，攪拌轉(zhuǎn)速220rpm，通氣量為18L/min，培養(yǎng)至種子罐中菌濃度OD600≥2.0時結(jié)束培養(yǎng)，轉(zhuǎn)種到發(fā)酵罐；種子罐中培養(yǎng)基由下述原料組成：每100ml培養(yǎng)基中含有酸水解酪蛋白20g、磷酸氫二鈉1.0g、磷酸二氫鉀0.2g、氯化銨1.5g、甘氨酸0.1g、L-谷氨酸鈉1.0g、葡萄糖5g、七水合硫酸鎂0.6g；
S3.發(fā)酵：將種子罐中的細菌接種到發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，所述發(fā)酵的條件為：溫度37℃，攪拌轉(zhuǎn)速280rpm，通氣量45L/min，發(fā)酵過程中加入質(zhì)量百分比濃度為22％的葡萄糖溶液，當(dāng)細菌生長至對數(shù)生長末期或穩(wěn)定生長期前期時，停止發(fā)酵；發(fā)酵罐中培養(yǎng)基由下述原料組成：每100ml培養(yǎng)基中含有酸水解酪蛋白20g、磷酸氫二鈉1.0g、磷酸二氫鉀0.2g、氯化銨1.5g、甘氨酸0.1g、L-谷氨酸鈉1.0g、葡萄糖5g、七水合硫酸鎂0.6g；
S4.純化莢膜多糖：純化莢膜多糖的具體操作為：
(1)制得粗制多糖：將發(fā)酵后的細菌采用甲醛殺菌后離心收集上清夜，加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度為1.0g/L，充分攪拌后靜置過夜，離心收集沉淀，沉淀用氯化鈣溶液解離3.2h，離心收集上清液，上清液中加入乙醇至終濃度為25％，6℃靜置過夜，離心，棄去沉淀，上清液中再加入乙醇至終濃度為82％，振蕩后并靜置至少18h，沉淀用無水乙醇和丙酮洗滌并干燥即為粗制多糖；
(2)精制：將粗制多糖溶于10％的飽和中性醋酸鈉溶液中，按體積比為1:1的比例加入冷酚溶液，振蕩離心收集上清液，抽提3次至上清液澄清，上清液用超濾膜包超濾，超濾后的多糖溶液加入NaCl溶液至其終濃度為0.3mol/L，然后加入乙醇至乙醇的終濃度為75％，充分混勻后7℃靜置過夜，收集沉淀，依次用無水乙醇和丙酮洗滌并干燥，即為精制得C群腦膜炎球菌多糖。
以下通過實驗說明本發(fā)明的有益效果：
采用本發(fā)明方法生產(chǎn)三批C群腦膜炎球菌莢膜多糖，測定復(fù)合多糖產(chǎn)量、多糖產(chǎn)量、蛋白含量、核酸含量、O-乙?；?、唾液酸含量和內(nèi)毒素，實驗結(jié)果如表1所示：
表1：實驗結(jié)果
由表1可知：經(jīng)過各項檢定后，得到的三批C群莢腦膜炎球菌膜多糖均符合藥典要求，計算多糖產(chǎn)量發(fā)現(xiàn)，通過本發(fā)酵工藝得到的復(fù)合多糖產(chǎn)量在0.3g/L左右，與工藝改進前0.15g/L的產(chǎn)量相比，有了較大的提高。
經(jīng)過多次試驗后，本發(fā)明方法可以用于培養(yǎng)C群腦膜炎球菌，C群腦膜炎球菌生長的濃度可以達到100～200億/ml左右，同時細菌的狀態(tài)良好。多糖產(chǎn)量穩(wěn)定，純化后的精糖蛋白和內(nèi)毒素等雜質(zhì)的含量都大大低于國家控制的標(biāo)準(zhǔn)，并且得到的多批多糖原液各項檢定結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性很高，可操作性強，有利于大規(guī)模生產(chǎn)。