專利名稱：一種a、c型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種酶聯(lián)診斷試劑盒及其用途，具體說，是涉及一種A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，屬于醫(yī)學、生物技術領域。
背景技術：
腦膜炎奈瑟菌是一種革蘭氏陰性雙球菌，通過呼吸道傳染引起的流行性腦脊髓膜炎(簡稱流腦)是一種對人類危害嚴重的傳染性疾病，此外還可引起菌血癥、肺炎、關節(jié)炎、結膜炎、心肌炎、泌尿系統(tǒng)等多種炎癥，是一種常見和多發(fā)疾病。腦膜炎奈瑟球菌可分為A、B、C、D、H、I、K、L、X、Y、Z、29E和W135共13個血清群，對人類致病的多屬A、B、C群，其他類群在帶菌者中經常發(fā)現，但很少致病。我國的流腦流行菌群仍以A群為主，但近年來也發(fā)人群中的絕大多數人對腦膜炎奈瑟球菌易感，該菌可寄生于正常人的鼻咽腔內，處于這種寄生狀態(tài)的細菌并不導致任何病理變化，亦不引起任何疾病癥狀；但這種帶菌狀態(tài)可以持續(xù) I周到數月之久，這種處于潛伏感染狀態(tài)的帶菌者在人群中的比例可高達50% 85%。人群中的帶菌者是造成流行性腦脊髓膜炎流行的最重要的傳染源，由于腦膜炎奈瑟菌的惟一自然宿主是人，因此，在人群較為密集的場所，容易造成細菌的高效率的傳播，特別是在兒童、中小學生為最易感人群，極易在短時間內造成兒童發(fā)病流行，所以，控制人群中的帶菌者傳染源成為控制流腦流行的重要環(huán)節(jié)之一。目前國內市場上腦膜炎奈瑟菌的各種免疫診斷試劑盒質量參差不齊，既無統(tǒng)一的質量標準，又在無序生產與應用，給腦膜炎奈瑟菌的預防和診治造成嚴重障礙。目前雖有國外試劑商提供同類商品化診斷試劑盒用于檢測，但是此種試劑盒價格十分昂貴，限制了臨床的廣泛使用。

實用新型內容針對現有技術存在的上述問題，本實用新型的目的是提供一種A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒。為實現上述實用新型目的，本實用新型采用的技術方案如下一種A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，包括盒體，盒體內置有5個下凹瓶位，5瓶設有密封蓋的試劑瓶、一酶標反應板和封板膜構成，所述試劑瓶內的試劑分別為標本稀釋液、酶標二抗、洗滌液、底物液和終止液，其中所述酶標反應板由A、C型腦膜炎奈瑟菌包被；所述標本稀釋液為含10%小牛血清和2%抗人IgG的0. 01M、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液；所述洗滌液為含有0. 05%Tween20的磷酸鹽緩沖液；所述酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgM單抗； 所述底物液為TMB-H000尿素溶液；所述終止液為2mol/LH2S04溶液；[0013]作為進一步優(yōu)選方案，所述下凹瓶位可由塑料或紙板制成。作為進一步優(yōu)選方案，所述酶標反應板位于所述試劑瓶之上或之下，所述封板膜與所述酶標反應板相鄰；且所述封板膜與所述酶標反應板的大小一致。作為進一步優(yōu)選方案，所述酶標反應板包括支撐架，及放置在支撐架之上的數條可拆卸的微孔反應板條，每條微孔反應條上設有數個可拆卸的微反應孔。作為進一步優(yōu)選方案，所述酶標反應板上共設有96個微反應孔，且所述酶標反應板外設有封套。本實用新型提供的A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒具有較好的特異性，檢測結果與美國R&D試劑盒腦膜炎奈瑟菌A+C型IgMELISA檢測試劑盒的一致性高，靈敏度為98%，特異度為99. 7%，因此具有十分廣闊的應用前景。

·圖I為本實用新型提供的A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒的結構示意圖；圖2為本實用新型提供的A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒中的96孔酶標版的結構示意圖。
具體實施方式
以下結合具體實施例，進一步闡明本實用新型。應理解，下述實施例僅用于說明本實用新型而不用于限制本實用新型的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。
以下結合附圖及其實施例對本實用新型進一步詳細說明。
實施例如圖I和圖2所示，本實用新型提供的一種A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，包括盒體(I)，盒體內置有5個下凹瓶位(2 )，5瓶設有密封蓋的試劑瓶組(3 )、一塊酶標反應板(4)及一張封板膜(5)，其中所述的5個下凹瓶位內分別相應放置裝有樣品稀釋液
(31)、酶標二抗(32)、濃縮洗液(33)、顯色液(34)和終止液(35)各一瓶，所述的酶標反應板包括數個底面封閉且頂面敞口的微反應孔的內壁包被有A、C型腦膜炎奈瑟菌；所述酶標反應板位于所述試劑瓶之上或之下，所述封板膜與所述酶標反應板相鄰；且所述封板膜與所述酶標反應板的大小一致；所述酶標反應板包括支撐架(41)，及放置在支撐架之上的數條可拆卸的微孔反應板條(42)，每條微孔反應條上設有數個可拆卸的微反應孔(43);所述酶標反應板上共設有96個微反應孔，且所述酶標反應板外設有封套(6)。試劑盒的制備(I)、試劑包被液(0. 05mol/L, pH9. 6的碳酸鈉_碳酸氫鈉緩沖液)=Na2CO3 I. 5g、NaHCO3
2.9g、Na2N3 0. 2g,加雙蒸水至 1000ml,調至 pH9. 6 ；標本稀釋液(含10%小牛血清和2%抗人IgG的0. 01mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)pH7. 4)，PBS :由 NaCl 8. 0g、KH2PO4 0. 2g、Na2HPO4. 12H20 2. 9g、KCl 0. 2g、硫柳汞 0. lg，加雙蒸水至lOOOmL，調至pH7. 4，即得；[0027]封閉液(10%小牛血清IPRS溶液)小牛血清100ml XPBS (pH7. 4) 900ml ；洗滌液(PBST,pH7. 4):由 NaCl 8. 0g、KH2PO4 0. 2g、Na2HPO4. 12H20 2. 9g、KCl
0.2g、Tween200. 5ml、硫柳萊 0. lg、加雙蒸水至 1000ml,調至 pH7. 4 ；酶標二抗(HRP*鼠抗人IGM單抗)辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgM單抗；底物液(TMB-H202尿素溶液)①底物液A(3、3’、5、5’ -四甲基聯(lián)苯胺，TMB) :TMB200mg，無水乙醇100ml，加雙蒸水至 IOOOml ②底物液B緩沖液(0. Imol/L檸檬酸-0. 2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液，pH5. 0 5.4) Na2HP04 14. 60g，朽1檬酸9. 33g,0. 75%過氧化氫尿素6. 4ml,加雙蒸水至1000ml,調至pH5. 0-5. 5 ；⑧將底物液A和B按I : I或I : I. 5混合，即成TMB-H000尿素溶液。終止液(2mol/LH2S04溶液)雙蒸水600ml，濃硫酸IOOml (緩慢滴加并不斷攪拌)，加雙蒸水至900ml。(2)、主要儀器酶標儀BI0_RADModel550；ELISA 反應板Comning Incorporated costar 96Well EIA/RIA plate。(3)、方法酶標二抗最適滴度的選擇取96孔酶標板一塊，用100ng/ml人IgMlOOull孔4°C包被過夜，洗滌液洗板3次，350ul/孔，甩干；將酶標抗人IgM單抗用稀釋液作一系列稀釋后分別加入己包被的孔中，IOOull孔，37°C孵育40min，后用洗板3次，350ul/孔，甩干；加底物顯色，每孔加入底物液IOOul，37°C或室溫避光顯色15分鐘；后加入終止液50U1終止反應、，在酶標儀上讀取450nm波長處吸光度，即A值，取A值在I. 0時的酶標抗體稀釋度，作為酶標二抗的最適滴度為 I 1000 1100。棋盤滴定法選擇包被抗原最適滴度取96孔酶標板一塊；每孔加入0. lmol/L的NaHCO3稀釋的5%戊二醛200uL，37°C溫箱放置I小時；去離子水洗滌96孔酶標板4次，甩干；將腦膜炎奈瑟菌A與C型(2X109cfu/mL)等體積混合后，用包被液將抗原作一系列稀釋后進行包被，每孔IOOuL ;37°C溫箱過夜烘干；取過夜烘干的抗原包被板加200uLPBS稀釋的10%小牛血清37°C封閉I. 5小時，得到梯度稀釋抗原包被酶標反應板；將強陽性參考血清、弱陽性參考血清和陰性參考血清用標本稀釋液按I :100倍稀釋，加樣，保溫，洗滌。加按最適滴度稀釋的酶標抗人IgM單抗，保溫，洗滌。加底物顯色，加酸終止反應后在酶標儀上讀取450nm波長處吸光度，即A值；選擇強陽性參考血清的A值為0. 8 I. 0間、陰性參考血清的A值小于0. 2的包被抗原的稀釋度作為最適滴度，本試劑盒最適包被A、C型腦膜炎奈瑟菌的稀釋度為2X105cfu/ml, IOOul/ 孔。A、C型腦膜炎奈瑟菌包被反應板的制備方法取96孔酶標板一塊；每孔加入0. Imol/L的NaHCO3稀釋的5%戊二醛200ul，37°C溫箱放置I小時；去離子水洗滌96孔酶標板4次，甩干；將腦膜炎奈瑟球菌A與C型(3X109cfu/ml)等體積混合后，用包被液I :1000 1100稀釋包板，每孔IOOuL ;37°C溫箱過夜烘干；取過夜烘干的抗原包被板加200ulPBS稀釋的10%小牛血清37°C封閉I. 5小時，得到抗原包被酶標反應板；腦膜炎奈瑟菌IgMELISA檢測試劑盒，由上述腦膜炎奈瑟球菌全菌包被酶標反應板、標本稀釋液、洗漆液、酶標二抗、底物液、終止液及參考血清構成。具體分為標本稀釋液含10%小牛血清和2%抗人IgG的0. 0IMpH7. 4的磷酸鹽緩沖液(PBS)； 洗滌液含有0. 05%Tween20 的 0. 01mol/LpH7. 4 的磷酸鹽緩沖液(PBST)；酶標二抗辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgM單抗；底物液TMB-H000尿素溶液；終止液2mol/LH2S04溶液。利用上述試劑盒采用ELISA法檢測血清中腦膜炎奈瑟菌IgM抗體(I)待檢血清，加入用標本稀釋液I :100稀釋的待檢血清到包被好的酶標反虛板，IOOuL/孔，同時另設兩孔分別加入強陽性參考血清和陰性參考血清IOOuL/孔，37°C孵育I小時，洗滌液洗板3次，350ul/孔，甩干；(2)加酶標物，加入HRP (辣根過氧化酶)標記的鼠抗人IGM單抗，IOOuL/孔，37°C孵育40min，洗滌液洗板3次，350ul/孔，甩干；(3)顯色，用洗滌液洗板后每孔加入底物液lOOuL，37°C或室溫避光顯色15分鐘；(4)每孔加入終止液50UL，終止反應；(5)結果判斷，空白孔調零，讀取450nm波長處吸光度，即0D450值，強陽性參考血清的A值需> 0. 9、陰性參考血清的A值需〈O. 2則證明試劑盒結果正確。(6)計算結果，將待檢標本血清平均OD值(P)除以陰性血清平均OD值(N)，求得P/N值，P/N彡2. I為陽性，P/N<2. I為陰性。特異性實驗以腦膜炎奈瑟菌A+C型標準IGM陽性血清、乙型腦炎病毒陽性血清、麻疹病毒IgM陽性血清、風疹病毒IGM陽性血清、人巨細胞病毒陽性血清和腦膜炎奈瑟菌A+C型標準IgM ;陰性血清采用A、C型腦膜炎奈瑟菌抗原包被酶標反應板ELISA誡劑盒檢測，P/N值分別為
6.17、I. 13、I. 17、I. 16和I. 08，說明該試劑盒特異性良好。重復性實驗隨機抽取20份腦膜炎奈瑟菌A+C型標準IgM陽性、陰性血清分別于不同的時間進行ELISA重復檢測，同一份血清檢測結果的P/N值上下浮動均不超過0. 05，變異系數均〈5%，證明該試劑盒具有良好的穩(wěn)定性和重復性。臨床標本檢測采用美國R&D公司流腦A+C型IgM ELISA檢測試劑盒檢測576例正常人血清血清，其中IgM抗體陽性40例，陰性434例，采用A、C型腦膜炎奈瑟菌包被酶標反應板法檢測結果與R&D公司流腦A+C型IGMELISA檢測試劑盒相比靈敏度為95%，特異度為99. 5%，具體結果如表I所示。[0068]表I兩種試劑盒IgM檢測結果比較
權利要求1.一種A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，其特征在于，包括盒體，盒體內置有5個下凹瓶位，5瓶設有密封蓋的試劑瓶、一酶標反應板和封板膜構成,所述試劑瓶內的試劑分別為標本稀釋液、酶標二抗、洗滌液、底物液和終止液，其中 所述酶標反應板由A、C型腦膜炎奈瑟菌包被； 所述酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的鼠抗人IgM單抗； 所述終止液為2mol/LH2S04溶液。
2.根據權利要求I所述的A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，其特征在于所述下凹瓶位可由塑料或紙板制成。
3.根據權利要求I所述的A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，其特征在于所述酶標反應板位于所述試劑瓶之上或之下，所述封板膜與所述酶標反應板相鄰；且所述封板膜與所述酶標反應板的大小一致。
4.根據權利要求I所述的A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，其特征在于所述酶標反應板包括支撐架，及放置在支撐架之上的數條可拆卸的微孔反應板條，每條微孔反應板條上設有數個可拆卸的微反應孔。
5.根據權利要求I所述的A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，其特征在于所述酶標反應板上共設有96個微反應孔，且所述酶標反應板外設有封套。
專利摘要本實用新型公開了一種A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒，包括盒體，盒體內置有5個下凹瓶位，5瓶設有密封蓋的試劑瓶、一塊A、C型腦膜炎奈瑟菌包被酶標反應板及一張封板膜，其中所述的5個下凹瓶位內分別相應放置裝有樣品稀釋液、酶標二抗、濃縮洗液、顯色液和終止液各一瓶。本實用新型提供的A、C型腦膜炎奈瑟菌酶聯(lián)診斷試劑盒的檢測結果與美國R&D試劑盒腦膜炎奈瑟菌A+C型IgMELISA檢測試劑盒的一致性高，靈敏度為98%，特異度為99.7%，因此具有十分廣闊的應用前景。
文檔編號G01N33/569GK202794183SQ201220376670
公開日2013年3月13日 申請日期2012年7月31日 優(yōu)先權日2012年7月31日
發(fā)明者劉昊智, 吳克, 史晉, 鮑路偉, 王文灝, 程超, 張愛暉 申請人:上海博沃生物科技有限公司