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一種C群腦膜炎球菌高密度產(chǎn)糖的方法與流程

文檔序號(hào):11936884閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種C群腦膜炎球菌高密度產(chǎn)糖的方法,其特征在于,它包括以下步驟:

S1. 開啟菌種及傳代:開啟C群腦膜炎球菌菌種傳代至氯化血紅素流行性腦膜炎半綜合培養(yǎng)基上,放入二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中,35~37℃培養(yǎng)16~24h,經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng),將菌種量放大;

S2. 種子罐培養(yǎng):將放大后的C群腦膜炎球菌種子接種到種子罐中,恒溫培養(yǎng)4~8h,所述培養(yǎng)的條件為:溫度35~37℃,攪拌轉(zhuǎn)速150~250rpm,通氣量為10~20L/min,培養(yǎng)至種子罐中菌濃度OD600≥2.0時(shí)結(jié)束培養(yǎng),轉(zhuǎn)種到發(fā)酵罐;

S3. 發(fā)酵:將種子罐中的細(xì)菌接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵,所述發(fā)酵的條件為:溫度35~37℃,攪拌轉(zhuǎn)速200~300rpm,通氣量20~50L/min,發(fā)酵過程中加入葡萄糖溶液,當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期或穩(wěn)定生長(zhǎng)期前期時(shí),停止發(fā)酵;

S4. 純化莢膜多糖:將發(fā)酵后的細(xì)菌采用甲醛殺菌后收集莢膜多糖并純化,即制得精制得C群腦膜炎球菌多糖。

2.如權(quán)利要求1所述的一種C群腦膜炎球菌高密度產(chǎn)糖的方法,其特征在于,所述氯化血紅素流行性腦膜炎半綜合培養(yǎng)基由下述原料組成:每100ml培養(yǎng)基中含有酸水解酪蛋白5g、磷酸二氫鉀0.2g、七水合硫酸鎂0.06g、葡萄糖0.5g、無水乙酸鈉0.5g、瓊脂粉2g、可溶性淀粉0.5g、氯化血紅素6mg。

3.如權(quán)利要求1所述的一種C群腦膜炎球菌高密度產(chǎn)糖的方法,其特征在于,步驟S1中將菌種量放大至接種種子罐后初始菌濃度的OD600≥0.15。

4.如權(quán)利要求1所述的一種C群腦膜炎球菌高密度產(chǎn)糖的方法,其特征在于,步驟S2中種子罐中培養(yǎng)基和步驟S3中發(fā)酵罐中培養(yǎng)基均由下述原料組成:每100ml培養(yǎng)基中含有酸水解酪蛋白20g、磷酸氫二鈉1.0g、磷酸二氫鉀0.2g、氯化銨1.5g、甘氨酸0.1g、L-谷氨酸鈉1.0g、葡萄糖5g、七水合硫酸鎂0.6g。

5.如權(quán)利要求1所述的一種C群腦膜炎球菌高密度產(chǎn)糖的方法,其特征在于,步驟S3中所述葡萄糖溶液的質(zhì)量百分比濃度為15~25%。

6.如權(quán)利要求1所述的一種C群腦膜炎球菌高密度產(chǎn)糖的方法,其特征在于,步驟S4所述純化莢膜多糖的具體操作為:

(1)制得粗制多糖:將發(fā)酵后的細(xì)菌采用甲醛殺菌后離心收集上清夜,加入十六烷基三甲基溴化銨至終濃度為1.0g/L,充分?jǐn)嚢韬箪o置過夜,離心收集沉淀,沉淀用氯化鈣溶液解離2.5~3.5h,離心收集上清液,上清液中加入乙醇至終濃度為25%,2~8℃靜置過夜,離心,棄去沉淀,上清液中再加入乙醇至終濃度為75~85%,振蕩后并靜置至少18h,沉淀用無水乙醇和丙酮洗滌并干燥即為粗制多糖;

(2)精制:將粗制多糖溶于10%的飽和中性醋酸鈉溶液中,按體積比為1:1的比例加入冷酚溶液,振蕩離心收集上清液,抽提1~3次至上清液澄清,上清液用超濾膜包超濾,超濾后的多糖溶液加入NaCl溶液至其終濃度為0.3mol/L,然后加入乙醇至乙醇的終濃度為75%,充分混勻后2~8℃靜置過夜,收集沉淀,依次用無水乙醇和丙酮洗滌并干燥,即為精制得C群腦膜炎球菌多糖。

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