本發(fā)明屬于再生資源循環(huán)利用和生物質能源領域，具體涉及一種以木質纖維素為原料制備高濃度發(fā)酵糖的方法。

背景技術：

近年來，社會對資源的需求與日俱增，傳統(tǒng)化石資源儲量逐漸減少，滿足不了人類社會可持續(xù)發(fā)展的需要；另一方面，燃燒化石資源造成的環(huán)境污染和溫室效應，也帶來了嚴重的環(huán)境和社會問題。因此，尋求清潔可再生的“資源替代”和“過程替代”已經迫在眉睫。生物質是地球上儲量最豐富的可再生資源庫，可代替石油生產各種生物燃料和生物基化學品，產生良好的環(huán)境效益。譬如，生物乙醇代替汽油，可有效地降低溫室氣體排放量；生物乳酸可用作為生物兼容和可降解的醫(yī)用材料。2004年，美國能源部指出，由生物質制取糖類化合物，是非常重要的平臺化合物，然后通過生物煉制技術可以轉化為各種各樣的化學和生物產品：燃料替代品如乙醇，烷烴等；材料替代品如乳酸，丁二酸等；食品替代品如木糖醇，山梨糖醇等等。

通過查閱專利和文獻報道，我們發(fā)現(xiàn)，木質纖維素制糖是決定木質纖維素生物煉制放大成本的關鍵步驟，至今仍存在諸多挑戰(zhàn)。木質纖維素生物質中碳水化合物包含纖維素和半纖維素，其中纖維素是葡萄糖單體經過β1-4糖苷鍵聚合而成，約占30-40％，半纖維素主要成分是木聚糖，還包含少量的葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖等，約占15-33％。目前，阻礙木質纖維素生物煉制產業(yè)化的困難在于，纖維素和半纖維素水解效率低，水解液中糖濃度不高，后續(xù)發(fā)酵目標產物濃度低，分離成本大。以生物乙醇發(fā)酵為例，工業(yè)化纖維素乙醇濃度要求達到40g/L以上，意味著水解液中糖濃度理論上至少需要80g/L。因此，高濃度可發(fā)酵糖溶液的制備，是木質纖維素生物煉制工程化的關鍵所在。

提高木質纖維素水解液中糖濃度和發(fā)酵目標產物產量的方法，主要集中于原料預處理和發(fā)酵過程優(yōu)化。國外文獻(DOI：10.1039/c5ee03718b，2016)報道了以玉米秸稈為原料，通過脫乙?；?機械精煉和纖維素酶水解，制得總糖濃度為230g/L的水解液，酵母發(fā)酵后，乙醇濃度86g/L。國外文獻(DOI：10.1039/c5ee02940f，2015)報道了一種以玉米秸稈為原料，通過離子液體預處理，分批補料(物料裝載量～30％)，同步糖化發(fā)酵技術，乙醇濃度41g/L。國內文獻(DOI：10.13880/j.cnki.65-1174/n.2015.01.005，2015)報道了以棉花秸稈為原料，通過濃度為2.3％稀硫酸預處理，水解時間為55min，得到可發(fā)酵糖產量最高為11.81g/100g棉花秸稈。發(fā)明專利(CN101899479A，2010)公布了一種以農業(yè)廢棄物為原料，通過稀酸高溫蒸煮預處理、脫毒、脫色、離子交換、濃縮等工藝步驟，制備了高濃度糖液，用于木糖醇的生產。專利(CN103467532A，2013)公開了一種以玉米芯為原料，通過稀酸預處理和閃蒸噴爆的技術路線，制備木糖溶液。專利(CN102766703A，2012)公布了一種以甲酸，乙酸和鹵素鹽催化木質纖維素，制備高濃度糖液的方法，糖濃度高為90.0-130g/L。

可以看出，目前公開有關木質纖維素制備高濃度糖溶液的專利和文獻，技術上往往存在工藝操作過程繁雜(包括預處理、水解、濃縮等工藝)、水解時外加催化劑(如稀酸或離子液體等)、反應條件苛刻(反應溫度≥200℃)、發(fā)酵糖濃度低(葡萄糖最高濃度～130g/L)、裝載量少(固載量≤30％)等不足。針對上述問題，本發(fā)明提供了一種原料固相輻照預處理，繼而通過高物料一次水解和二次酶解糖化，可獲得高濃度發(fā)酵木糖和葡萄糖溶液的方法。本發(fā)明整個水解過程，無需添加酸催化劑，綠色經濟。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種輻照預處理木質纖維素，高物料水解糖化，制備高濃度可發(fā)酵糖溶液的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明以木質纖維素為原料，經由輻照預處理，高物料水解和酶解糖化，制備高濃度C5和C6可發(fā)酵糖溶液。主要包括以下操作步驟：

1.木質纖維素切成大塊(5-10cm)，以固相形式進行高能輻照預處理，破壞木質纖維素化學和物理結構，促進后續(xù)粉碎和水解糖化。

(2)輻照預處理后物料經粉碎后進行第一步水解糖化，在溶液中進行催化降解，水解液過濾得到富含木糖的高濃度發(fā)酵糖，發(fā)酵糖濃度為100g/L以上，固體殘渣回收進行第二步酶解糖化；水解糖化溫度為100-200℃，水解時間為0.5-2h；

(3)第二步酶解糖化，是將固體殘渣用纖維素酶進一步水解，得到富含葡萄糖的高濃度發(fā)酵糖溶液；發(fā)酵糖溶液濃度達200g/L；纖維素酶用量為1-50mg酶蛋白/g纖維素；酶解糖化溫度為40-60℃，酶解時間為24-96h。

其中，第一步水解糖化溶液是指純水、水與有機溶劑混合物，含酸水溶液中的任何一種。

所述方法，其中，高濃度發(fā)酵糖溶液是指，生物質第一步水解糖化時，富含木糖的發(fā)酵總糖濃度可達128g/L，纖維殘渣第二步酶解糖化時，富含葡萄糖的發(fā)酵總糖濃度可達257g/L。

所述方法，其中，木質纖維素包括林業(yè)廢棄物、農業(yè)廢棄物和工業(yè)廢棄物等生物質。

所述方法，其中，輻照預處理射線種類包含γ-輻射、電子、等離子體等任何一種。

所述方法，其中，輻射劑量范圍為100-2000kGy。

所述方法，其中的，木質纖維素輻照預處理后，以高物料比進行第一步水解糖化，水解體系包括去離子純水、有機溶劑/水混合溶液、稀酸水溶液等中的任何一種。

所述方法，其中，第一步水解糖化時，物料濃度為15-50wt.％，水解糖化溫度為100-190℃，水解時間為0.5-2h。

所述方法，其中，稀酸水溶液中，酸的種類為硫酸、鹽酸、乙酸、甲酸、固體酸等中的任何一種，酸濃度為1-50mM。

所述方法，其中，有機溶劑/水混合體系中，有機溶劑包括乙醇、四氫呋喃、γ-戊內酯、二惡烷、乙腈、丙酮等中的任何一種，水與有機溶劑體積比為1:9-9:1。

所述方法，其中，高物料酶解糖化時，所用酶為纖維素酶、半纖維素酶、葡聚糖酶等中的一種或一種以上混合酶。

所述方法，其中，酶用量為1-50mg酶蛋白/g纖維素。酶解糖化溫度為40-60℃，酶解時間為24-96h。

本發(fā)明的積極作用

相對于已報道文獻和專利，本發(fā)明具有以下積極作用：

1.本發(fā)明中，木質纖維素輻照預處理后容易粉碎，所需能耗降低3倍以上，時間縮短2倍以上，粉碎顆粒粒徑更小，在高物料條件下黏度較低，傳質效果佳，適合物料高裝載量的水解糖化，有利于降低操作成本。

2.本發(fā)明中，木質纖維素輻照預處理后產生的乙?；嵛稽c，具有自催化降解特性，無需添加外來催化劑，在溫和條件下，半纖維素水解轉化率為99％，第一步水解后，總糖濃度為73-127g/L。

3.本發(fā)明中，纖維素固體殘渣很容易被酶解，纖維素酶解率為90-99％，葡萄糖最高濃度為204.5g/L，總糖最高濃度為257g/L，是目前文獻報道最高。

附圖說明

圖1木質纖維素輻照預處理后粉碎所需能耗、時間及其粒徑大小。

圖2蘆葦輻照預處理后的粒徑分布、黏度大小和自催化降解效果。

圖3 X射線光電子能譜分析蘆葦輻照預處理前后的O/C質量比和化學態(tài)。

圖4蘆葦輻照預處理后的水解糖化物料衡算。

圖5一種以木質纖維素為原料制備高濃度發(fā)酵糖溶液的技術路線。

具體實施方式

結合以下具體實施例，進一步解釋本發(fā)明，僅以5種不同木質纖維素為原料，采用⁶⁰Co-γ輻照預處理，通過一次水解和二次酶解，制備高濃度發(fā)酵木糖和葡萄糖為例，來說明本發(fā)明的具體實施方式，而非用于限定本發(fā)明的范圍。

案例1：木質纖維素輻照預處理后，一次水解糖化制備高濃度還原糖溶液，主要實驗步驟和結果如下：

1.自然干燥的木質纖維素原料，包含蘆葦，玉米芯，甘蔗渣，松木，桉木切成5-10cm碎片，用60Co-γ輻照預處理，輻照劑量約為800kGy，每次處理原料2000g，處理時間20d，之后，用粉碎機(DFY-1000C,大德藥機)粉碎過60目篩子，備用。

2.采用激光粒度分析儀(MASTERSIZER 2000,MALVERN)和旋轉黏度計(HB DV-II,BROOKFIELD)測定原料碎粒徑和高物料條件下的黏度，采用酸堿滴定法和X射線光電子能譜測定(ESCALAB 250,ThermoFisher Scientific)分析原料的化學結構變化。

3.從圖1可以看出，與未處理木質纖維素相比，輻照預處理后原料，粉碎所需能耗降低了3-4倍，時間縮短了2-4倍，粉碎顆粒粒徑更小。

4.從圖2可以看出，輻照原料粉碎后，粒徑集中于29.4μm，未處理原料粉碎后，粒徑主要為117.0μm。輻照原料粉碎后，堆積密度增加了2倍，在物料濃度是未輻照原料2倍條件下，剪切黏度低10倍以上。

5.從表1和圖3看出，輻照預處理后，原料發(fā)生了氧化，O/C質量濃度比增加了17％，原料中酸位點增加了2-5倍。

6.采用以下2種方法，進行高物料濃度的第一步水解糖化，制備高濃度還原糖溶液：

方法1：輻照預處理生物質以一定物料比與去離子水混合(見表2)，在500ml反應釜中，反應1小時，反應結束后，冷卻至40℃以下，過濾，分別收集濾液和固體殘渣，濾液即為富含木糖水溶液，用高效液相色譜(ALLTECH 1500)分析糖類組成及其含量。

方法2：輻照預處理生物質以一定的物料比與水/γ-戊內酯(GVL，體積比6:4)混合(見表2)，170℃條件下，在500ml反應釜中，反應1小時，反應結束后，通冷凝水將反應釜溫度降到40℃以下，反應物用布氏漏斗過濾，得濾液和殘渣。殘渣用水洗后，60℃烘箱干燥48h，保藏備用。濾液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，靜置分相，有機相用于回收γ-戊內酯(Sigma,V900552)，水相即為富含木糖水溶液，用高效液相色譜(ALLTECH 1500)分析糖類組成及其含量。

7.從表2可以看出，木質纖維素經過輻照預處理后，都很容易降解，秸稈類原料半纖維素轉化率為96-99％，軟硬木類半纖維素轉化率～85％，總發(fā)酵糖溶液濃度為75-128g/L。

表1輻照對木質纖維素酸密度的影響。

表2輻照木質纖維素的第一步水解效果與還原糖濃度

案例2：纖維素殘渣高物料二次酶解糖化，制備高濃度發(fā)酵糖溶液，主要實驗步驟和結果如下：

1.案例1得到的纖維素固體殘渣按表3中的物料濃度，與濃度50mM，pH5.0檸檬酸緩沖液(北京化工廠)混合，加入纖維素酶(Sigma,C9748)，加酶量為20mg酶蛋白/g纖維素，在200rpm，50℃搖床(IS-RDV1,CRYSTAL)中反應96小時，水解液10,000×g離心10分鐘，上清液即為高葡萄糖濃度溶液，含量采用高效液相色譜測定。

2.從表3可以看出，經過案例1水解糖化后殘渣，纖維素酶解效果顯著，纖維素和半纖維素轉化率為90-99％，總發(fā)酵糖濃度高為173-257g/L。

表3纖維素殘渣的第二步酶解效果與還原糖濃度

案例3.以蘆葦生物質為例，分析生物質輻照預處理后，第一步水解和第二步酶解糖化，纖維素和半纖維素降解的物料衡算，主要實驗步驟和結果如下：

1.以輻照蘆葦為原料，根據(jù)案例1和案例2實驗數(shù)據(jù)，建立纖維素、半纖維素、C5和C6等物質的衡算模型。

2.如圖4所示，1kg蘆葦中含有373g葡聚糖和171g木聚糖，經過兩步高物料糖化后，分別得到413g葡萄糖和可溶性低聚葡萄糖，181g木糖和可溶性低聚木糖。C6得率為理論值的99％，C5得率為理論值的93％。