本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種酶法制備三磷酸腺苷的方法。

背景技術(shù)：

三磷酸腺苷(ATP)由一個腺苷(A)和三個磷酸基團(tuán)組成，分子量為507，分子式C₁₀H₁₆N₅O₁₃P₃。它是生物體內(nèi)的能量轉(zhuǎn)換器和貯存器，在人體能量代謝中起著重要的作用，作為代謝的中間體、輔酶參與生物體內(nèi)糖類、蛋白質(zhì)、核酸和脂肪等的代謝。在臨床應(yīng)用上，ATP作用廣泛，對進(jìn)行性肌肉萎縮、中風(fēng)后遺癥、心肌梗塞、心肌炎、冠狀動脈硬化、肝炎等病癥具有良好的治療和輔助治療作用。

ATP的合成主要有化學(xué)合成法、生物酶催化法、光合磷酸化和氧化磷酸化法以及微生物酶系發(fā)酵等方法。目前，工業(yè)生產(chǎn)ATP普遍采用的方法是以腺苷(A)或腺苷酸(AMP)為底物，利用酵母菌酶系，通過糖酵解途徑，進(jìn)行底物水平磷酸化合成ATP。此方法雖然生產(chǎn)效果良好，成本不高，但是經(jīng)酵母細(xì)胞酶系催化合成ATP的反應(yīng)過程復(fù)雜，參與催化反應(yīng)的酶系眾多，反應(yīng)過程不易控制，產(chǎn)品批次間質(zhì)量差異較大。同時，酵母質(zhì)量常因供應(yīng)的廠家不同、批次不同、甚至季節(jié)不同而有很大差異。且酵母酶系活力下降快，使用壽命短，一般是一次性使用，大量廢棄酵母對大氣、水源、土壤環(huán)境污染相對較大。另外，反應(yīng)過程中添加大量酵母細(xì)胞酶液，引入了大量的蛋白、色素等雜質(zhì)給ATP后期純化帶來很多困難。

相較而言，生物酶法催化生產(chǎn)ATP技術(shù)更加高效穩(wěn)定、容易控制且節(jié)能環(huán)保。在原料成本方面，除底物和一定量鎂鹽等無機(jī)鹽外，酵母發(fā)酵法需消耗大量酵母泥、葡萄糖及磷酸鹽，而生物酶法則需要添加一定量的磷酸供體和相應(yīng)的催化酶。因此，長期以來，磷酸供體和催化用酶的選擇是酶法催化工藝無法規(guī)?；瘧?yīng)用于生產(chǎn)的限制條件。根據(jù)文獻(xiàn)報道，乙酸激酶、氨激酶、丙酮酸激酶、精氨酸激酶及肌酸激酶等酶均可用于制備ATP。但是，上述酶所利用的磷酸供體或者價值昂貴，如丙酮酸激酶、肌酸激酶所需磷酸供體磷酸烯醇式丙酮酸和磷酸肌酸，或者生成的副產(chǎn)物有一定的生物毒性和污染性，如乙酸激酶、氨激酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物分別為乙酸和氨氣，因此都較難在工業(yè)生產(chǎn)中大量使用。

專利CN201610165471.7利用較簡單的酶系，以固定化方式，使用成本低廉的多聚磷酸或其鹽為磷酸供體制備ATP，獲得高效穩(wěn)定的效果。所用的“ATP生產(chǎn)酶”包括多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1，Ppk)、腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3，Adk)和多聚磷酸-腺苷酸磷酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.7.4.-，Pap，有文獻(xiàn)報道該酶也屬于Ppk酶中的一類，但I(xiàn)UBMB對該酶分類尚不十分明確)。其中，Ppk酶催化ADP與多聚磷酸或其鹽反應(yīng)生成ATP(Ppk酶有Ppk1和Ppk2兩種不同形式，在一定條件下，兩者均可催化ADP生成ATP)，Adk酶催化2分子ADP生成1分子ATP和1分子AMP，Pap酶則催化AMP與多聚磷酸或其鹽反應(yīng)生成ADP。Ppk、Adk及Pap三種酶的合理組合均可合成ATP，所利用的底物為AMP。

但AMP作為生產(chǎn)原料價格偏高，本發(fā)明專利在原有“ATP生產(chǎn)酶”基礎(chǔ)上添加腺苷激酶(EC 2.7.1.20，AK)，該酶可催化腺苷生成AMP，組合上述其它ATP生產(chǎn)酶，可共同作用合成ATP，總反應(yīng)方程式為：A+3PolyP_n→ATP+3PolyP_n-1。腺苷售價僅為AMP的30％左右，價格低廉，來源廣泛，為工業(yè)生產(chǎn)節(jié)約了大量成本。且加入AK酶后，不影響其它ATP生產(chǎn)酶的活性，ATP的生成速率及最適反應(yīng)條件也基本保持不變。整個反應(yīng)過程中催化用酶可循環(huán)利用，成本低，節(jié)能環(huán)保。產(chǎn)物ATP易于純化，適于開發(fā)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種酶法制備三磷酸腺苷的方法，其克服了現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷。以腺苷為底物，通過添加“ATP生產(chǎn)酶”，即AK酶及Ppk、Adk和Pap酶的任意兩種或三種組合催化生產(chǎn)ATP，大大降低現(xiàn)有酶法制備ATP的成本，使之進(jìn)一步應(yīng)用于規(guī)模化生產(chǎn)。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

一種酶法制備三磷酸腺苷的方法，包括以下步驟：

(1)制備ATP生產(chǎn)酶：

通過基因工程改造、發(fā)酵、純化或直接提取等其它方式獲得ATP生產(chǎn)酶。ATP生產(chǎn)酶可以游離酶的形式制成酶液或者干粉；也可進(jìn)一步固定于固定化載體上，制得固定化ATP生產(chǎn)酶。

(2)反應(yīng)液中ATP的制備：

在酶促反應(yīng)體系中，按需求添加腺苷進(jìn)行酶促反應(yīng)。同時，按比例添加ATP生產(chǎn)酶，即AK酶及Ppk、Adk和Pap酶的任意兩種或三種組合，并添加少量用以啟動反應(yīng)的ATP、ADP或AMP中的一種或幾種組合，以及作為磷酸供體的多聚磷酸或其鹽，進(jìn)行ATP制備反應(yīng)。反應(yīng)體系中還包含鎂離子和/或錳離子，鉀離子、鈉離子、銨離子中的一種或幾種，Tris或磷酸根離子。本發(fā)明添加的底物、酶及各類鹽可一次性加入反應(yīng)體系，也可按照工業(yè)生產(chǎn)工藝流程分批次流加補(bǔ)入。

(3)分離產(chǎn)物和ATP生產(chǎn)酶：

固定化的ATP生產(chǎn)酶在反應(yīng)罐中直接分離。上述分離可通過過濾方式分離，也可在反應(yīng)柱中直接分離。或

游離的ATP生產(chǎn)酶通過濾器中超濾膜分離。其中，過濾器具有進(jìn)料口、出料口和回流口，內(nèi)設(shè)截留的超濾膜。經(jīng)過濾器的截留液為回收的酶液，濾出液為分離出酶之后含產(chǎn)物ATP的反應(yīng)液。

回收的固定化或游離的ATP生產(chǎn)酶可重復(fù)利用于步驟(2)。

(4)成品制備：步驟(3)中分離出酶的反應(yīng)液通過離子交換層析、濃縮、結(jié)晶、干燥等步驟制備成品ATP。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，步驟(1)所述的ATP生產(chǎn)酶為腺苷激酶(EC2.7.1.20，AK)以及多聚磷酸激酶(EC 2.7.4.1，Ppk，包括Ppk1酶和Ppk2酶)、腺苷酸激酶(EC 2.7.4.3，Adk)、多聚磷酸-腺苷酸磷酸轉(zhuǎn)移酶(EC 2.7.4.-，Pap)中的任意兩種或三種組合，即使用AK、Ppk和Adk組合，或AK、Adk和Pap組合，或AK、Ppk和Pap組合，或AK、Ppk、Adk和Pap的組合；其中，當(dāng)選擇四種酶組合時，AK、Ppk、Adk和Pap酶的添加比例優(yōu)選為(0.1-10)：(0.1-10)：(0.1-10)：1。

上述的AK、Ppk、Adk、Pap四種酶可以來源于任何生物、或者是經(jīng)過人工改造具有同樣催化功能的酶。Ppk可以是Ppk1酶和/或Ppk2酶。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，步驟(1)所述固定化載體選自于高分子載體、無機(jī)載體、磁性高分子微球載體中的一種或多種。其中，高分子載體選自于纖維素、葡萄糖凝膠、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、多聚氨基酸、聚苯乙烯、聚丙烯酸、海藻酸鈉、殼聚糖、淀粉、聚乙烯醇、明膠、卡拉膠、尼龍或合成高聚物等；無機(jī)載體選自于多孔玻璃、氧化硅、硅膠、活性炭或硅藻土等。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，所述的固定化ATP生產(chǎn)酶通過下列方式固定于固定化載體：吸附、包埋、共價、結(jié)合、交聯(lián)或其組合。其中，AK、Ppk、Adk、Pap四種酶可分別固定或按比例混合固定。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，步驟(2)ATP生產(chǎn)反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)溫度為25-60℃，優(yōu)選溫度為30-50℃，最優(yōu)選為45℃；

反應(yīng)pH為5-9.5，優(yōu)選pH為6-9，最優(yōu)選為7.5。

酶促反應(yīng)體系包括：底物腺苷；

還包括：ATP或ADP或AMP中的一種或幾種，用以啟動反應(yīng)，腺苷與添加的ATP、ADP、AMP總量的摩爾濃度比例為(1-100)：1；

還包括：多聚磷酸或其鹽，鎂離子、錳離子中的一種或兩種，銨離子、鉀離子、鈉離子的一種或幾種，Tris或磷酸根離子。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，本發(fā)明添加的底物、酶及各類鹽可一次性加入反應(yīng)體系，也可按照工業(yè)生產(chǎn)工藝流程分批次補(bǔ)入。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，本發(fā)明添加的腺苷濃度1-80g/L；多聚磷酸或其鹽的摩爾濃度為反應(yīng)添加的腺苷摩爾濃度的0.01-10倍；鎂離子濃度為0.01-0.2M；錳離子濃度為0.01-0.15M；鉀離子濃度為0.01-0.5M；鈉離子濃度為0.01-0.5M；銨離子濃度為0.01-0.3M；Tris濃度為0.01-0.1M、磷酸鹽濃度為0.01-0.1M。

優(yōu)選地，上述技術(shù)方案中，多聚磷酸或其鹽選自于多聚磷酸鈉、多聚磷酸鉀、多聚磷酸銨、六偏磷酸(鈉)、四聚磷酸(鈉)和三聚磷酸(鈉)中的一種或多種；鎂離子選自于氯化鎂、硫酸鎂、亞硫酸鎂和硝酸鎂中的一種或多種；錳離子選自于氯化錳和硫酸錳中的一種或多種；鉀離子選自于氯化鉀、硫酸鉀、硝酸鉀、氫氧化鉀、亞硫酸鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、醋酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和檸檬酸鉀中的一種或多種；鈉離子選自于氯化鈉、硫酸鈉、硝酸鈉、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、醋酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和檸檬酸鈉中的一種或多種；銨離子選自于氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、氨水、碳酸銨、碳酸氫銨、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨和醋酸銨中的一種或多種。

本發(fā)明方法步驟(3)中采用的超濾膜選自于醋酸纖維素膜、聚砜膜、聚丙烯腈膜、聚氯乙烯膜、聚偏氟乙烯膜、聚酰胺膜或陶瓷膜。

本發(fā)明上述技術(shù)方案，具有如下有益效果：

(1)采用新型ATP生產(chǎn)酶，酶高效穩(wěn)定且價格低廉，ATP生產(chǎn)過程簡單、容易控制；

(2)使用廉價的腺苷作為底物生產(chǎn)ATP，進(jìn)一步降低了生物酶催化法制備ATP的成本；

(3)反應(yīng)需添加的磷酸供體多聚磷酸或其鹽價格低廉，污染小，且對反應(yīng)用酶的影響較?。?/p>

(4)建立了ATP生產(chǎn)酶回收體系，適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)；

(5)酶法制備反應(yīng)液中雜蛋白、色素等雜質(zhì)含量少，易于后續(xù)ATP純化工作。

附圖說明

圖1為本發(fā)明酶法制備三磷酸腺苷的方法所使用的AK酶的SDS-PAGE圖。

圖2為本發(fā)明酶法制備三磷酸腺苷的方法所使用的Ppk、Adk、Pap酶的SDS-PAGE圖。

圖3為本發(fā)明酶法制備三磷酸腺苷的方法使用游離的ATP生產(chǎn)酶的反應(yīng)工藝流程圖。

圖4為本發(fā)明酶法制備三磷酸腺苷的方法使用固定化ATP生產(chǎn)酶的反應(yīng)工藝流程圖。

圖5為本發(fā)明酶法制備三磷酸腺苷的方法實施例2反應(yīng)3小時HPLC圖。

圖6為本發(fā)明酶法制備三磷酸腺苷的方法實施例2反應(yīng)6小時終止時HPLC圖。

具體實施方式

下面對本發(fā)明的具體實施例進(jìn)行詳細(xì)描述，以便于進(jìn)一步理解本發(fā)明。

實施例1 AK、Ppk、Adk和Pap酶的制備

本發(fā)明方法中的AK、Ppk(Ppk1和/或Ppk2)、Adk和Pap酶可以商購獲得，或者是經(jīng)過人工改造具有同樣催化功能的酶。

AK、Ppk1、Ppk2、Adk和Pap酶的制備過程如下：

根據(jù)五種酶基因的序列，設(shè)計五對擴(kuò)增引物。提取釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株基因組DNA，以其為模板，PCR擴(kuò)增ado1(AK酶基因)片段，并將其連接至pET 22b載體(購于Novagene公司)；提取大腸桿菌(Escherichia coli)K12菌株(購于天根生化科技有限公司)基因組DNA，以其為模板，PCR擴(kuò)增ppk1和adk基因片段，并將其分別連接至pET 22b載體(購于Novagene公司)；提取銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)菌株(CICC 10419)基因組DNA，以其為模板，PCR擴(kuò)增ppk2基因片段，并將其連接至pET22b載體(購于Novagene公司)；提取約氏不動桿菌(Acinetobacter johnsonii)菌株(CGMCC 1.8030)基因組DNA，以其為模板，PCR擴(kuò)增pap基因片段，并將其連接至pET22b載體(購于Novagene公司)。5段連接序列經(jīng)測序正確后，分別轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)菌株(購于天根生化科技有限公司)。

將轉(zhuǎn)化后的E.coli BL21(DE3)單克隆接入LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)期后，加入1mM異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)5小時，收集菌體，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)篩選高表達(dá)菌株。

將篩選出的高表達(dá)菌株在無菌條件下接入種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后接入含5L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期后接入含50L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，培養(yǎng)5小時后加入1mM IPTG誘導(dǎo)5小時，離心收集菌體約1kg。

其中LB培養(yǎng)基成分為：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％氯化鈉；種子培養(yǎng)基成分為：1％蛋白胨、0.5％酵母粉和1％氯化鈉；發(fā)酵培養(yǎng)基成分為：1％蛋白胨、0.5％酵母粉、1％氯化鈉、5％磷酸氫二鈉、1％磷酸二氫鈉、0.01％硫酸鎂和1％甘油。

收獲的菌體分別經(jīng)超聲或高壓均質(zhì)破碎后，離心收集上清。在上清中加入40-60％飽和硫酸銨，離心。收集的沉淀經(jīng)Tris緩沖液(pH 8.0)溶解后，使用G25柱(購于通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)有限公司)脫鹽，再經(jīng)CM-或DEAE-Sepharose FF(購于通用電氣醫(yī)療生物科學(xué)有限公司)層析可得到初步純化的游離酶。

圖1為所制備AK酶的SDS-PAGE圖，如圖所示：泳道1為蛋白標(biāo)志物14.4-116kDa(購于北京中科瑞泰生物技術(shù)有限公司)；泳道2為AK酶，約40kDa。

圖2為所制備其它酶的SDS-PAGE圖，如圖所示：泳道1為蛋白標(biāo)志物14.4-116kDa(購于北京中科瑞泰生物技術(shù)有限公司)；泳道2為Ppk1酶，約60kDa；泳道3為Ppk2酶，約40kDa；泳道4為Adk酶，約25kDa；泳道5為Pap酶，約55kDa。

使用現(xiàn)有技術(shù)記載的公知的測定酶活性的方法，檢測到1mg/ml AK、Ppk1、Ppk2、Adk和Pap酶液活性分別約為800U、100U、500U、1000U和800U，其中將1μM底物在1分鐘內(nèi)完全轉(zhuǎn)化定義為1個活性單位(U)。

實施例2使用游離酶制備ATP

圖3為本發(fā)明方法使用游離酶生產(chǎn)ATP工藝流程圖。參見圖3，使用游離酶制備ATP的操作步驟如下：

(1)在反應(yīng)罐中合成ATP的反應(yīng)：

在反應(yīng)罐中，100L無菌水的反應(yīng)體系為含有底物2.5kg腺苷，以及0.1kg ATP、0.5kg磷酸二氫鈉、0.3kg氯化鈉、0.3kg硫酸銨、1.0kg六水氯化鎂和2.0kg六偏磷酸鈉的溶液，配制時均勻攪拌防止出現(xiàn)沉淀。調(diào)節(jié)pH值至7.5，在反應(yīng)體系中添加500U/LAK酶、800U/L Ppk2酶及800U/L Pap酶開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH值為7.5，溫度為45℃。

圖5、圖6分別為反應(yīng)3小時及6小時HPLC檢測圖。

反應(yīng)6小時后，ATP生成量約為44g/L，腺苷轉(zhuǎn)化率90％以上。HPLC檢測條件為：Kromasil C18色譜柱(購于AKZO NOBEL公司)(150×4.6mm)，檢測波長210nm，檢測溫度30℃，檢測流速1ml/min，流動相為含有5％甲醇及50mM磷酸鹽的緩沖液，pH＝3.0。

(2)在過濾器中分離ATP生產(chǎn)酶：

通過超濾方法，將步驟(1)中反應(yīng)體系的反應(yīng)液通過過濾器分離AK、Ppk2及Pap三種ATP生產(chǎn)酶，參見圖3。過濾器內(nèi)裝膜包(購于Pall公司，截留分子量20kDa)，濾出液為分離出酶之后的反應(yīng)液，含有ATP、少量ADP、少量AMP及鹽離子。

檢測到回收的AK、Ppk2及Pap酶的活性較反應(yīng)前減少5％-10％不等，添加相應(yīng)新酶后再次用于步驟(1)反應(yīng)。

(3)分離產(chǎn)物ATP：

步驟(2)的濾出液通過離子交換層析、濃縮、結(jié)晶、干燥后制得成品ATP，純度可達(dá)98％以上，總收率達(dá)85％。

實施例3使用游離酶制備ATP

參見圖3，使用游離酶制備ATP的操作步驟如下：

(1)在反應(yīng)罐中合成ATP的反應(yīng)：

在反應(yīng)罐中，100L無菌水的反應(yīng)體系為含有底物3.0kg腺苷，以及0.1kg AMP、0.5kg磷酸氫二鈉、0.3kg氯化鉀、0.25kg氯化銨、2.5kg七水硫酸鎂和3.0kg四聚磷酸的溶液，配制時均勻攪拌防止出現(xiàn)沉淀。調(diào)節(jié)pH值至7.0，在反應(yīng)體系中添加500U/LAK酶、500U/L Ppk2酶、300U/LAdk酶及500U/L Pap酶開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH值為7.0，溫度為40℃。

反應(yīng)8小時后，ATP生成量約為50g/L，腺苷轉(zhuǎn)化率達(dá)85％。HPLC檢測條件同實施例2步驟(1)。

(2)在過濾器中分離ATP生產(chǎn)酶：

通過超濾方法，將步驟(1)中反應(yīng)體系的反應(yīng)液通過過濾器分離AK、Ppk2、Adk及Pap四種ATP生產(chǎn)酶，參見圖3。過濾器內(nèi)裝膜包(購于Pall公司，截留分子量8kDa)，濾出液為分離出酶之后的反應(yīng)液，含有ATP、少量ADP、少量AMP及鹽離子。

檢測到回收的AK、Ppk2、Adk及Pap酶的活性較反應(yīng)前減少5％-10％不等，添加相應(yīng)新酶后再次用于步驟(1)反應(yīng)。

(3)分離產(chǎn)物ATP：

步驟(2)的濾出液通過離子交換層析、濃縮、結(jié)晶、干燥后制得成品ATP，純度可達(dá)98％以上，總收率達(dá)80％。

實施例4使用固定化酶制備ATP

圖4為本發(fā)明方法使用固定化酶生產(chǎn)ATP工藝流程圖。參見圖4，使用固定化酶制備ATP的操作步驟如下：

(1)ATP生產(chǎn)酶的固定：

催化用ATP生產(chǎn)酶AK、Ppk2和Adk酶一同以商業(yè)化的環(huán)氧基固定化載體LX1000EP固定。

將AK、Ppk2和Adk游離酶酶液按照活性比1：1：1配成混合酶液20L，酶液中各酶活性均為600U。在恒溫攪拌罐中加入LX1000EP濕載體3kg與上述酶液混合，在20℃條件下，150rpm攪拌12小時。過濾收集載體，用0.02M磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)清洗2遍，即得固定化混合酶。AK、Ppk2和Adk酶固定化后，活性降低至原活性的50-60％。

(2)在反應(yīng)柱中生成ATP：

配制反應(yīng)液，每50L含有底物1.0kg腺苷，以及0.05kg ATP、0.2kg Tris、0.15kg氯化鈉、0.15kg氯化銨、1.0kg七水硫酸鎂和1.0kg四聚磷酸鈉的溶液，配制時均勻攪拌防止出現(xiàn)沉淀。調(diào)節(jié)pH值至6.8，溫度為35-40℃。

將上述步驟(1)中的混合固定酶3kg裝入反應(yīng)柱，排盡氣泡后制得酶反應(yīng)柱。使用恒流泵將反應(yīng)液以15L/h流速由下而上緩慢泵入通過酶反應(yīng)柱，反應(yīng)期間控制溫度為37℃。循環(huán)反應(yīng)7小時后，收集反應(yīng)液，檢測ATP的生成量為35g/L，90％腺苷轉(zhuǎn)化為ATP。

固定化酶循環(huán)反應(yīng)20次以上或者-4℃儲存時間一月以上，酶活性降低10-15％，需按比例補(bǔ)加或更換部分新酶。

(3)分離產(chǎn)物ATP：

步驟(2)的反應(yīng)液通過離子交換層析、濃縮、結(jié)晶、干燥后制得成品ATP，純度可達(dá)98％以上，總收率達(dá)82％。

實施例5使用固定化酶制備ATP

參見圖4，使用固定化酶制備ATP的操作步驟如下：

(1)ATP生產(chǎn)酶的固定：

催化用ATP生產(chǎn)酶AK、Adk和Pap酶分別以商業(yè)化的含氨基合成高聚物載體LX1000HA固定。

將AK游離酶酶液配成酶液6L，酶活性為600U。在恒溫攪拌罐中加入LX1000HA濕載體2kg與上述酶液混合，在20℃條件下，150rpm攪拌12小時。過濾收集載體，用0.02M磷酸鉀緩沖液(pH 8.0)清洗2遍，即得固定化AK酶。將600UAdk酶、1200U Pap酶以同樣方式分別固定于LX1000HA載體。AK、Adk和Pap酶固定化后，活性降低至原活性的30-50％。

(2)在反應(yīng)柱中生成ATP：

配制反應(yīng)液，每50L含有底物1.25kg腺苷，以及0.1kg ATP、0.1kg ADP、0.05kg AMP、0.2kg Tris、0.1kg氯化鈉、0.1kg氯化銨、0.25kg一水氯化錳和1.0kg六偏磷酸鈉的溶液，配制時均勻攪拌防止出現(xiàn)沉淀。調(diào)節(jié)pH值至6.5，溫度為30-35℃。

將上述步驟(1)中的固定酶共6kg裝入反應(yīng)柱，排盡氣泡后制得酶反應(yīng)柱。使用恒流泵將反應(yīng)液以20L/h流速由下而上緩慢泵入通過酶反應(yīng)柱，反應(yīng)期間控制溫度為33℃。循環(huán)反應(yīng)約6小時后，收集反應(yīng)液，檢測ATP的生成量為45g/L，80％以上腺苷轉(zhuǎn)化為ATP。

固定化酶循環(huán)反應(yīng)20次以上或者-4℃儲存時間一月以上，酶活性降低約10-15％，需按比例補(bǔ)加或更換部分新酶。

(3)分離產(chǎn)物ATP：

步驟(2)的反應(yīng)液通過離子交換層析、濃縮、結(jié)晶、干燥后制得成品ATP，純度可達(dá)98％以上，總收率達(dá)78％。

實施例6

參見圖3，使用游離酶制備ATP的操作步驟如下：

(1)在反應(yīng)罐中合成ATP的反應(yīng)：

在反應(yīng)罐中，100L無菌水的反應(yīng)體系為含有底物5.0kg腺苷，以及3.0kg ATP、3.0kg AMP、1.42kg磷酸氫二鈉、3.73kg氯化鉀、1.61kg氯化銨、5.0kg七水硫酸鎂和6.0kg多聚磷酸銨(分子量>20000)的溶液，配制時均勻攪拌。調(diào)節(jié)pH值至6.0，在反應(yīng)體系中添加1000U/L AK酶、1000U/L Ppk1酶及1000U/L Pap酶開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH值為6.0，溫度為50℃。

反應(yīng)3小時后，以0.6kg/小時的速度補(bǔ)入腺苷，補(bǔ)加5小時，使加入的總腺苷量達(dá)到80g/L。

反應(yīng)12小時后，ATP生成量為120g/L。HPLC檢測條件同實施例2步驟(1)。

(2)在過濾器中分離ATP生產(chǎn)酶：

通過超濾方法，將步驟(1)中反應(yīng)體系的反應(yīng)液通過過濾器分離AK、Ppk1及Pap三種ATP生產(chǎn)酶，參見圖3。過濾器內(nèi)裝膜包(購于Pall公司，截留分子量20kDa)，濾出液為分離出酶之后的反應(yīng)液，含有ATP、少量ADP、少量AMP及鹽離子。

檢測到回收的AK、Ppk1及Pap酶的活性較反應(yīng)前減少20％-30％不等，添加相應(yīng)新酶后再次用于步驟(1)反應(yīng)。

(3)分離產(chǎn)物ATP：

步驟(2)的濾出液通過離子交換層析、濃縮、結(jié)晶、干燥后制得成品ATP，純度可達(dá)98％以上，總收率40-50％。

實施例7

參見圖3，使用游離酶制備ATP的操作步驟如下：

(1)在反應(yīng)罐中合成ATP的反應(yīng)：

在反應(yīng)罐中，100L無菌水的反應(yīng)體系為含有底物5.0kg腺苷，以及0.095kg ATP、1.42kg磷酸氫二鈉、0.8kg氯化銨、1.0kg六水氯化鎂、2.0kg多聚磷酸銨和2.0kg六偏磷酸鈉的溶液，配制時均勻攪拌。調(diào)節(jié)pH值至9.0，在反應(yīng)體系中添加1000U/L AK酶、1000U/L Ppk1酶、100U/L Ppk2酶及1000U/L Pap酶開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH值為9.0，溫度為30℃。

反應(yīng)9小時后，ATP生成量為70g/L。HPLC檢測條件同實施例2步驟(1)。

(2)在過濾器中分離ATP生產(chǎn)酶：

通過超濾方法，將步驟(1)中反應(yīng)體系的反應(yīng)液通過過濾器分離AK、Ppk1、Ppk2及Pap四種ATP生產(chǎn)酶，參見圖3。過濾器內(nèi)裝膜包(購于Pall公司，截留分子量20kDa)，濾出液為分離出酶之后的反應(yīng)液，含有ATP、ADP、AMP及鹽離子。

檢測到回收的AK、Ppk1、Ppk2及Pap酶的活性較反應(yīng)前減少20％-30％不等，添加相應(yīng)新酶后再次用于步驟(1)反應(yīng)。

(3)分離產(chǎn)物ATP：

步驟(2)的濾出液通過離子交換層析、濃縮、結(jié)晶、干燥后制得成品ATP，純度可達(dá)98％以上，總收率達(dá)62％。

實施例8

參見圖3，使用游離酶制備ATP的操作步驟如下：

(1)在反應(yīng)罐中合成ATP的反應(yīng)：

在反應(yīng)罐中，100L無菌水的反應(yīng)體系為含有底物1.0kg腺苷，以及0.02kg ATP、0.12kg Tris、0.075kg氯化鉀、0.054kg氯化銨、0.246kg七水硫酸鎂和1.0kg四聚磷酸鈉的溶液，配制時均勻攪拌。調(diào)節(jié)pH值至5.0，在反應(yīng)體系中添加50U/L AK酶、500U/L Ppk2酶及300U/L Pap酶開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH值為5.0，溫度為25℃。

反應(yīng)15小時后，ATP生成量為10g/L。HPLC檢測條件同實施例2步驟(1)。

(2)在過濾器中分離ATP生產(chǎn)酶：

通過超濾方法，將步驟(1)中反應(yīng)體系的反應(yīng)液通過過濾器分離AK、Ppk2及Pap三種ATP生產(chǎn)酶，參見圖3。過濾器內(nèi)裝膜包(購于Pall公司，截留分子量20kDa)，濾出液為分離出酶之后的反應(yīng)液，含有ATP、ADP、AMP及鹽離子。

檢測到回收的AK、Ppk2及Pap酶的活性較反應(yīng)前減少35％-40％不等，添加相應(yīng)新酶后再次用于步驟(1)反應(yīng)。

(3)分離產(chǎn)物ATP：

步驟(2)的濾出液通過離子交換層析、濃縮、結(jié)晶、干燥后制得成品ATP，純度可達(dá)98％以上，總收率達(dá)40％。

實施例9

參見圖3，使用游離酶制備ATP的操作步驟如下：

(1)在反應(yīng)罐中合成ATP的反應(yīng)：

在反應(yīng)罐中，100L無菌水的反應(yīng)體系為含有底物0.1kg腺苷，以及0.16kg ADP、0.12kg Tris、0.075kg氯化鉀、0.058kg氯化鈉、0.203kg六水氯化鎂、0.144kg一水氯化錳和2.3kg六偏磷酸鈉的溶液，配制時均勻攪拌。調(diào)節(jié)pH值至9.5，在反應(yīng)體系中添加10U/L AK酶、20U/L Adk酶及100U/L Pap酶開始反應(yīng)。反應(yīng)期間控制pH值為9.5，溫度為60℃。

反應(yīng)9小時后，ATP生成量為1.8g/L。HPLC檢測條件同實施例2步驟(1)。

(2)在過濾器中分離ATP生產(chǎn)酶：

通過超濾方法，將步驟(1)中反應(yīng)體系的反應(yīng)液通過過濾器分離AK、Adk及Pap三種ATP生產(chǎn)酶，參見圖3。過濾器內(nèi)裝膜包(購于Pall公司，截留分子量8kDa)，濾出液為分離出酶之后的反應(yīng)液，含有ATP、ADP、AMP及鹽離子。

檢測到回收的AK、Adk及Pap酶的活性較反應(yīng)前減少35％-40％不等，添加相應(yīng)新酶后再次用于步驟(1)反應(yīng)。

(3)分離產(chǎn)物ATP：

步驟(2)的濾出液通過離子交換層析、濃縮、結(jié)晶、干燥后制得成品ATP，純度可達(dá)98％以上，總收率達(dá)45％。

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