專利名稱：焦磷酸測序檢測hbv拉米夫定耐藥突變位點(diǎn)的pcr與測序引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種適用焦磷酸測序方法檢測HBV拉米大定耐藥突變位點(diǎn)的 PCR引物和 測序引物。
背景技術(shù)：
焦磷酸測序技術(shù)是一項(xiàng)新型DNA測序技術(shù)。在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素 酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將DNA單鏈上每一個(gè)dNTP聚合與一次熒光 信號釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測定DNA序列的目的。乙肝病毒(HBV)是雙鏈DNA分子，由3200個(gè)左右堿基對(bp)組成，根據(jù)HBV基因 序列的同源性，可將HBV分為A、B、C、D、E、F，G，H8種基因型。HBV基因組由S、C，P、X4個(gè) 開放閱讀框組成，HBV變異可發(fā)生在其4個(gè)閱讀框的任何一個(gè)區(qū)域內(nèi)，常見的基因變異有前 c區(qū)、c基因啟動(dòng)子區(qū)變異異以及HBV聚合酶(P)基因區(qū)YMDD變異等。乙肝病毒是一種易 高度變異的病毒，在其逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制過程中因RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校正功能，可發(fā)生 一個(gè)或多個(gè)核苷酸的變異。HBV-DNA可以在慢性持續(xù)性感染過程中自然變異，也可以在免疫 壓力下發(fā)生變異，甚至在各種抗病毒治療藥物誘導(dǎo)下變異。HBV變異的發(fā)生可引起乙肝病毒 的生物學(xué)特性發(fā)生改變、對藥物產(chǎn)生拮抗性，最終導(dǎo)致肝炎再發(fā)作。拉米夫定是一種核苷類 似物，已廣泛應(yīng)用于慢性乙肝患者的抗病毒治療，能抑制HBV逆轉(zhuǎn)錄酶活性，阻止病毒核酸 的復(fù)制但長期使用會(huì)導(dǎo)致HBV P基因區(qū)發(fā)生點(diǎn)突變而導(dǎo)致耐藥。乙肝病毒耐藥突變的檢測方法包括直接測序法，基因芯片法，PCRmnh-ELISA法等。 對比這些方法，焦磷酸測序法有其獨(dú)特的優(yōu)勢，焦磷酸測序具有高通量，操作簡便，檢測靈 敏度高等特點(diǎn)。在焦磷酸測序的過程中，對目的片段很好的擴(kuò)增和對待測位點(diǎn)的確定是整 個(gè)實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供適用于焦磷酸檢測HBV拉米大定耐藥突變的PCR引物和測 序引物?；谝陨夏康?，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案用于擴(kuò)增目的片段的PCR引物序列包括上游引物5‘ TATTCCCATCCCATCATC3 ‘下游引物5‘ CCCAACWYCCAATTACATATCCC3 ‘用于檢測耐藥突變位點(diǎn)的測序引物包括sequencing primerl 5' GCTTTCGCAARATWCC3‘；(用于檢測 rtV173L)sequencing primer 2 5 ‘ AGTGGGCCTCAGTCCGTTTC3 ‘；(用于檢測 rtL180M， rtA181V/T)sequencing primer 3 5 ' CCAYTGTBTGGCTTTC3 ‘(用于檢測 rtS202G/I，rtM204V/I)本發(fā)明的具體是原理是，利用PCR擴(kuò)增出要檢測的目的片段，通過DNA聚合酶，ATP 硫酸化酶，熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶協(xié)同作用，將DNA單鏈上每一個(gè)dNTP聚合與一 次熒光信號釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)檢測DNA序列的目的，再 與標(biāo)準(zhǔn)序列比較，得出結(jié)果。


利用PCR引物對與測序引物進(jìn)行焦磷酸測序檢測HBV DNA rtV173L突變位點(diǎn)測序圖。見附圖1
具體實(shí)施例方式1，PCR引物的設(shè)計(jì)通過對HBV各個(gè)基因型進(jìn)行序列比較分析，選擇含有拉米夫定 耐藥突變位點(diǎn)的P區(qū)基因高保守區(qū)域，設(shè)計(jì)多對引物。最優(yōu)引物為上游引物5'TATTCCCATCCCATCATC3‘下游引物5‘ CCCAACWYCCAATTACATATCCC3 ‘2，測序引物設(shè)計(jì)，選取拉米夫定耐藥突變位點(diǎn)前10個(gè)左右堿基，設(shè)計(jì)測序引物如 下sequencing primerl 5' GCTTTCGCAARATWCC3‘；(用于檢測 rtV173L)sequencing primer 2 5 ‘ AGTGGGCCTCAGTCCGTTTC3 ‘；(用于檢測 rtL180M， rtA181V/T)sequencing primer 3 5 ' CCAYTGTBTGGCTTTC3 ‘(用于檢測 rtS202G/I， rtM204V/I)3，反應(yīng)體系的優(yōu)化病人的血清作為待檢樣本，分裝后保存于-20°C。3. 1，PCR引物濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將PCR引物的濃 度分別從0. 1 μ M至1. 6 μ M作倍比連續(xù)稀釋，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，確定了 PCR引物最佳濃 度為0. 25 μ M利用上述引物進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最終確定PCR反應(yīng)體系為50μΜ。4，PCR反應(yīng)條件如下950C 2min, 1 個(gè)循環(huán)；95°C IOsec, 52°C 15sec, 72°C 20sec，40 個(gè)循環(huán)；72°C 2min, 1 個(gè)循環(huán)。5，上機(jī)操作按照測序儀說明書進(jìn)行設(shè)置和操作。6，檢測結(jié)果分析測序圖上直接讀出序列，與標(biāo)準(zhǔn)序列比較，如果樣品含有拉米夫定耐藥突變，測序圖上的序列與標(biāo)準(zhǔn)序列會(huì)不一致。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明提供的PCR引物擴(kuò)增目的片段，跑膠結(jié)果顯示，低至10000拷貝/ml的 HBVDNA片段的條帶亮，說明本發(fā)明提供的PCR引物擴(kuò)增效率高。(2)不含目的片段的陰性樣本沒有條帶，說明本發(fā)明提供的PCR引物特異性好
(3)從測序圖上看，本發(fā)明提供的測序引物能很好的檢測待測突變位點(diǎn)，靈敏度高。
權(quán)利要求
一種用于擴(kuò)增HBV DNA片段的引物序列，其特征在于所述的引物上游引物序列為5′TATTCCCATCCCATCATC3′，下游引物序列為5′CCCAACWYCCAATTACATATCCC3′。
2.用于焦磷酸測序檢測HBV拉米夫定耐藥突變的測序引物序列，其特征在于所述 的引物序列為sequencing primerl 5 ‘ GCTTTCGCAARATWCC3 ‘；(用于檢測 rtV173L) sequencingprimer 2:5' AGTGGGCCTCAGTCCGTTTC3‘；(用于檢測 rtL 180M, rtA 181V/T) sequencingprimer 3:5' CCAYTGTBTGGCTTTC3‘(用于檢測 rtS202G/I，rtM204V/I)。
全文摘要
一種用于焦磷酸測序檢測HBV拉米夫定耐藥突變位點(diǎn)的PCR引物與測序引物。引物序列包括上游引物5′TATTCCCATCCCATCATC3′下游引物5′CCCAACWYCCAATTACATATCCC3′測序引物sequencing primer15′GCTTTCGCAARATWCC3′；(用于檢測rtV173L)sequencing primer 25′AGTGGGCCTCAGTCCGTTTC3′；(用于檢測rtL180M，rtA181V/T)sequencing primer 35′CCAYTGTBTGGCTTTC3′(用于檢測rtS202G/I，rtM204V/I)。
文檔編號C12R1/93GK101812534SQ20091002442
公開日2010年8月25日 申請日期2009年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月24日
發(fā)明者王志宇, 王軼, 符芳芳 申請人:江蘇默樂生物科技有限公司