專利名稱：利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)蘋果幼苗的方法
利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)蘋果幼苗的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng) 蘋果幼苗的方法。
背景技術(shù)：
砧木“M26”是一種矮化砧木，易繁殖，壓條生根好，繁殖率高，抗白粉病，與蘋果品 種嫁接親和力強，植株生長矮化、產(chǎn)量高，果實品質(zhì)好。但由于其根系淺，并且不抗綿蚜和頸 腐病，有“大腳”現(xiàn)象，在一些地區(qū)越冬抽條嚴(yán)重，不宜在沙質(zhì)土和貧瘠干旱地域栽植。其僅 宜作中間砧，在華北地區(qū)應(yīng)用，中間砧段需埋入地下，但不抗寒，要求具有較好的土壤和管 理條件。
在我國針對此問題研究開展較廣泛，但主要研究的是栽培及病蟲害防治方面，在 組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化方面研究甚少。國內(nèi)外有關(guān)文獻報道不多，且國外的仙客來轉(zhuǎn)化材料 基本上都選用的是黃化子葉節(jié)。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)目前廣泛應(yīng)用于植物基因工程研究。根癌農(nóng)桿菌 中含Ti質(zhì)粒，該質(zhì)粒的部分DNA片斷可整合到宿主細(xì)胞中，從而整合到植物的基因組中。農(nóng) 桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法同其它方法相比具有以下優(yōu)點轉(zhuǎn)化效率高，轉(zhuǎn)化效果好，可轉(zhuǎn)移大片 斷DNA ；轉(zhuǎn)移的外源基因成為單拷貝；遺傳穩(wěn)定，并且多數(shù)符合孟德爾遺傳定律；價格廉價。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種建立蘋果矮化砧木“iC6”農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系的 方法，該方法有效的克服現(xiàn)有的農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)遺傳轉(zhuǎn)化效率低的缺陷。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是
—種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)蘋果轉(zhuǎn)基因幼苗的方法，其特殊之處在 于，該方法包括以下步驟
1)切取組培苗葉片置于包括4. Omg/L 6_芐基氨基嘌呤和0. 2mg/L3-吲哚乙酸的 MS培養(yǎng)基的分化培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)作為受體材料；
2)將供體菌株接種到加有100mg/L卡那霉素以及50mg/L鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基 上培養(yǎng)，收集菌液，離心，倒去上清，沉淀用液體MS溶解并稀釋至濃度0D600為0. 4 0. 6 ； 其中LB液體培養(yǎng)基還可以添加利福平，卡那霉素、鏈霉素和利福平三種成分以利于農(nóng)桿菌 生長同時抑制其它雜菌生長。
3)將步驟2~)收集的菌液加入稀釋后的液體MS中，放入步驟1)培養(yǎng)好的受體材 料進行浸染；取出浸染后的葉片吸去表面附著的菌液，并接種到所述分化培養(yǎng)基上共培養(yǎng) 2 4天，再接種到篩選分化培養(yǎng)基上，24 27°C暗培養(yǎng)直至長出抗性芽，尤其溫度在 生長較好；其中共培養(yǎng)就是讓含有此基因的菌液和受體材料共同生存在一起兩天到四天左 右這樣以利于轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化效率較高時間太長菌液太多不易清除；侵染后的共培養(yǎng)時間和培養(yǎng) 條件對轉(zhuǎn)化都有影響，農(nóng)桿菌附著外菌株才能誘發(fā)腫瘤，因此共培養(yǎng)時間必須長于16h，共培養(yǎng)時間的確定以不對葉片造成傷 害，又能最大限度的提高轉(zhuǎn)化效率為準(zhǔn)，確定方法主要采用gus基因瞬時表達測定法，即共 培養(yǎng)后確定外植體的gus基因顏色反應(yīng)，以瞬時表達率高，表達面積大為優(yōu)。一般2 4d 較為適宜；
所述篩選分化培養(yǎng)基包括200mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素、0. 6mg/L6_芐基氨 基嘌呤、0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培養(yǎng)基；
4)將步驟幻得到的抗性芽移植到繼代培養(yǎng)基上進行進一步的篩選培養(yǎng)，3 5周 后，事實上4周較合適，進行生根培養(yǎng)，而后進行移栽，培養(yǎng)蘋果幼苗完成；
所述繼代培養(yǎng)基包括200mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素、0. 6mg/L 6-芐基氨基 嘌呤、0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培養(yǎng)基。
上述步驟1)的組培苗葉片通過以下步驟獲取
1)取蘋果芽，用體積百分比為70%的酒精浸泡30 40s后，再用體積百分比為 0. 1 %的升汞浸泡7 8min，再用無菌水沖洗5 6遍，最后浸沒于無菌水中；其中升汞是 一種組培苗建立外植體時的消毒殺菌劑；
2)無菌條件下將經(jīng)步驟1)處理后的蘋果芽接于包含30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、 0. 6mg/L 6-芐基氨基嘌呤、0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為 20 22°C，光照1 500 20001x，培養(yǎng)一個半月左右得組培苗葉片。
上述步驟幻先將培養(yǎng)好的受體材料進行浸染前，在其背部橫切數(shù)刀。
上述供體菌株是農(nóng)桿菌EHA105。
上述LB液體培養(yǎng)基包括10g/L氯化鈉、5g/L酵母以及10g/L胰蛋白胨或10g/L氯 化鈉、5g/L酵母、10g/L胰蛋白胨以及瓊脂158/1，其？!1為7.2。其中液體培養(yǎng)基不需要瓊 脂，在培養(yǎng)菌之前加入卡那霉素、鏈霉素和利福平三種成分作用抑制其它雜菌生長有利于 農(nóng)桿菌生長。
上述供體菌株接種到LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的條件是置于恒溫?fù)u床，以ISOrpm的 轉(zhuǎn)速在的條件下培養(yǎng)Mh。
上述離心條件是常溫下以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心8分鐘。
上述生根培養(yǎng)用生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基包括吲哚乙酸0. 2mg/L,200mg/ L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素以及一半體積的MS培養(yǎng)基；
所述培養(yǎng)條件為光周期14h/10h、光照強度20001x以及溫度25士2°C。
上述組培苗葉片暗培養(yǎng)的溫度是20°C，時間是2天。
上述浸染后的葉片吸去表面附著的菌液是置于無菌濾紙上進行。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點
本發(fā)明建立蘋果矮化砧木“M26”農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系的方法，通過優(yōu)化農(nóng)桿 菌轉(zhuǎn)化時所涉及到的各項影響條件，包括菌液濃度、侵染時間、侵染條件、培養(yǎng)時間、抑菌素 濃度等，提供了一套適合蘋果矮化砧木“M26”的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系；本發(fā)明克服了現(xiàn)有 農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)遺傳轉(zhuǎn)化效率低的缺陷，建立起以葉片為受體材料的高效農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體 系；通過本發(fā)明獲得轉(zhuǎn)基因植株蘋果矮化砧木“iG6”植株的抗鹽性等的抗逆性明顯增強。


圖1為轉(zhuǎn)基因植株蘋果矮化砧木“M26”的抗性篩選。
圖2為轉(zhuǎn)基因植株的nhx目的基因的PCR檢測。
圖3為轉(zhuǎn)基因植株的nptll基因的PCR檢測。
圖4為為轉(zhuǎn)基因植株的nhx目的基因Southern雜交檢測。
圖5為為轉(zhuǎn)基因植株的nptll報告基因Southern雜交檢測。
圖6實時定量目的基因檢測。
圖7移栽生長狀況圖。
具體實施方式
下面結(jié)合發(fā)明人給的具體實施例和試驗例對本發(fā)明的方法和使用效果做進一步 闡明。
蘋果砧木“M26”外植體的培養(yǎng)，組培苗葉片通過以下步驟獲取
1)取蘋果芽，在超凈工作臺上用體積百分比為70%的酒精浸泡30或40s后，再用 體積百分比為0. 的升汞浸泡8min，再用無菌水沖洗5 6遍，最后浸沒于無菌水中；其 中升汞是一種組培苗建立外植體時的消毒殺菌劑；
2)無菌條件下將經(jīng)步驟1)處理后的蘋果芽接于包含30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、 0. 6mg/L 6-芐基氨基嘌呤、0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為 20 22°C，光照1 500 20001x，培養(yǎng)一個半月左右得組培苗葉片。
一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)蘋果幼苗的方法，包括以下步驟
1)選繼代培養(yǎng)3周的蘋果組培苗的葉片，用無菌手術(shù)刀在其葉背部劃幾道傷口接 種于4. Omg/L 6-芐基氨基嘌呤和0. 2mg/L3-吲哚乙酸的MS培養(yǎng)基的分化培養(yǎng)基暗培養(yǎng)2 天作為受體材料，培養(yǎng)條件為22°C ；
2)將供體菌株農(nóng)桿菌EHA105接種到加有100mg/L卡那霉素以及50mg/L鏈霉素 的LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)J8°C，180rpm恒溫?fù)u床上過夜，將菌液收集到IOml離心管中， 3000rpm常溫離心8分鐘，倒去上清，沉淀用液體MS溶解并稀釋，濃度0D600為0. 4 0. 6 時進行侵染轉(zhuǎn)化，其中LB液體培養(yǎng)基包括10g/L氯化鈉、5g/L酵母、10g/L胰蛋白胨以及瓊 脂 15g/L，其 pH 為 7. 2;
3)將預(yù)培養(yǎng)兩天的葉片放入盛放菌液系時候的液體MS中，浸泡并輕輕搖動4 5min,將侵染過的葉片放到濾紙上吸干，而后接種到分化培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)3d，而后接種到 的篩選分化培養(yǎng)基上，22°C暗培養(yǎng)兩周，其中分化培養(yǎng)基4. 0mg/L6-芐基氨基嘌呤、0. 2mg/ L3-吲哚乙酸以及MS培養(yǎng)基，篩選分化培養(yǎng)基包括200mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素、 0. 6mg/L 6-芐基氨基嘌呤、0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培養(yǎng)基；
4)將抗性芽移植到繼代培養(yǎng)基上進行進一步的篩選培養(yǎng)，2 3周后，進行生根 培養(yǎng)，而后進行移栽，其中繼代培養(yǎng)基包括200mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素、0. 6mg/L 6-芐基氨基嘌呤、0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培養(yǎng)基。
試驗例1轉(zhuǎn)基因蘋果砧木m26的抗性篩選
獲得再生芽后，轉(zhuǎn)移至含有卡那霉素的分化培養(yǎng)基上，若是轉(zhuǎn)基因植株在抗生素 培養(yǎng)基上生長良好，若為非轉(zhuǎn)基因植株，在抗生素培養(yǎng)基上黃化死亡，如圖1所示，圖中所反應(yīng)的內(nèi)容是再生芽的抗性篩選左邊為抗性植株右邊為非抗性植株。
試驗例2轉(zhuǎn)基因植株NHX目的基因的PCR檢測
用于遺傳轉(zhuǎn)化的基因含有NHX目的基因，采用CTAB法提取葉片的DNA進行檢測， 擴增片斷長度為2000bp，如圖2所示，圖中M代表marker，14代表陽性對照，13代表空白對 照，12代表陰性對照，1 11代表轉(zhuǎn)基因植株。
25μ L 的反應(yīng)體系包括2. 5μ LlOXPCR Bufer, 1. 5μ L 25mmol/L MgCl2,2y L 2. 5mmol/L dN TPs, 1 μ LlOmmol/L DHARs 引物，1 μ LlOmmol/L DHAfci 引物，0. 25 μ L5U/μ L 的Taq DNA聚合酶，2 μ L模板DNA，用滅菌雙蒸水補齊至25 μ L。
PCR擴增程序為94°C變性5min，然后依次在94°C變性50s、55°C退火50s、72°C延 伸aiiin的條件下循環(huán)35次，最后在72°C延伸7min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取樣8 μ L在1 %瓊 脂糖凝膠上進行電泳檢測。 目的基因檢測引物根據(jù)蘋果NHX基因設(shè)計合成特異引物， 上游引物(5' -ATG GCG GTT CCA CAT TTG AG-3')和下游引物(5' -TCA TTG CCA CTG AAC GTT GT-3‘)。
試驗例3轉(zhuǎn)基因植株報告基因PCR檢測
用于遺傳轉(zhuǎn)化的基因含有報告目的基因，采用CTAB法提取葉片的DNA進行檢測， 擴增片斷長度為750bp，如圖3所示，圖中M代表marker，14代表陽性對照，13代表空白對 照，12代表陰性對照，1-11代表轉(zhuǎn)基因植株。
25μ L 的反應(yīng)體系包括2. 5μ LlOXPCR Bufer, 1. 5μ L 25mmol/L MgCl2,2y L 2. 5mmol/L dN TPs, 1 μ LlOmmol/L DHARs 引物，1 μ LlOmmol/L DHAfci 引物，0. 25 μ L5U/μ L 的Taq DNA聚合酶，2 μ L模板DNA，用滅菌雙蒸水補齊至25 μ L。
PCR擴增程序為94°C變性5min，然后依次在94°C變性50s、55°C退火50s、72°C延 伸aiiin的條件下循環(huán)35次，最后在72°C延伸7min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取樣8 μ L在1 %瓊 脂糖凝膠上進行電泳檢測。
根據(jù)蘋果報告基因設(shè)計合成特異引物，上游引物(5' -AGA CAA TCG GCT GCT CTG ΑΤ-3')和下游引物(5‘ -TCA TTT CGA ACC CCA GAG TC-3')。
試驗例4轉(zhuǎn)基因植株的nhx目的基因Southern-blot檢測
PCR檢測陽性的植株進行Southern印跡雜交，以非轉(zhuǎn)化植株為對照。用上、下游 引物對質(zhì)粒進行擴增，用擴增產(chǎn)物制備雜交探針。蘋果砧木葉片總DNA經(jīng)HindIII單酶切 后，在8g/L瓊脂糖凝膠上電泳分離，將DNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上。Southern雜交使 用 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 雜交試劑盒，具體操作 按照說明書進行。
如圖4所示，抗性植株的southern雜交檢測9.陽性對照；8.未轉(zhuǎn)化植株；1 7.轉(zhuǎn)化植株。
試驗例5轉(zhuǎn)基因植株的報告目的基因Southern-blot檢測
PCR檢測陽性的植株進行Southern印跡雜交，以非轉(zhuǎn)化植株為對照。用上、下游 引物對質(zhì)粒進行擴增，用擴增產(chǎn)物制備雜交探針。蘋果砧木葉片總DNA經(jīng)HindIII單酶切 后，在8g/L瓊脂糖凝膠上電泳分離，將DNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上。Southern雜交使 用 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I 雜交試劑盒，具體操作 按照說明書進行。
如圖4所示，抗性植株的southern雜交檢測1.未轉(zhuǎn)化植株；2.陽性對照；3 9.轉(zhuǎn)化植株。
試驗例5實時定量檢測結(jié)果目的基因
22-48為轉(zhuǎn)化植株，ck為未轉(zhuǎn)化植株
試驗例6移栽生長狀況圖
22，39，47為轉(zhuǎn)化植株，ck為未轉(zhuǎn)化植株。
權(quán)利要求
1.一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)蘋果轉(zhuǎn)基因幼苗的方法，其特征在于，該方 法包括以下步驟1)切取組培苗葉片置于包括4.0mg/L6-芐基氨基嘌呤和0. aiig/L3-吲哚乙酸的MS培 養(yǎng)基的分化培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)作為受體材料；2)將供體菌株接種到加有100mg/L卡那霉素以及50mg/L鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基上培 養(yǎng)，收集菌液，離心，倒去上清，沉淀用液體MS溶解并稀釋至濃度0D600為0. 4 0. 6 ；3)將步驟幻收集的菌液加入稀釋后的液體MS中，放入步驟1)培養(yǎng)好的受體材料進行 浸染；取出浸染后的葉片吸去表面附著的菌液，并接種到所述分化培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2-4天， 再接種到篩選分化培養(yǎng)基上，24 27°C暗培養(yǎng)直至長出抗性芽，尤其溫度在^TC生長較 好；所述篩選分化培養(yǎng)基包括200mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素、0. 6mg/L6_芐基氨基嘌 呤、0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培養(yǎng)基；4)將步驟幻得到的抗性芽移植到繼代培養(yǎng)基上進行進一步的篩選培養(yǎng)，3 5周后， 進行生根培養(yǎng)，而后進行移栽，培養(yǎng)蘋果幼苗完成；所述繼代培養(yǎng)基包括200mg/L頭孢霉素、50mg/L卡那霉素、0. 6mg/L 6-芐基氨基嘌呤、 0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)蘋果幼苗的方法，其特征在 于，所述步驟1)的組培苗葉片通過以下步驟獲取1)取蘋果芽，用體積百分比為70%的酒精浸泡30 40s后，再用體積百分比為0.1% 的升汞浸泡7 8min，再用無菌水沖洗5 6遍，最后浸沒于無菌水中；2)無菌條件下將經(jīng)步驟1)處理后的蘋果芽接于包含30g/L蔗糖、7g/L瓊脂、0.6mg/L 6-芐基氨基嘌呤、0. 01mg/L3-吲哚乙酸以及MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為20 22°C， 光照1 500 20001x，培養(yǎng)一個半月左右得組培苗葉片。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)蘋果幼苗的方法，其特征在 于所述步驟幻先將培養(yǎng)好的受體材料進行浸染前，在其背部橫切數(shù)刀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)蘋果轉(zhuǎn)基因幼苗的方 法，其特征在于所述供體菌株是農(nóng)桿菌EHA105。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)蘋果幼苗的方法，其特征在 于所述LB液體培養(yǎng)基包括10g/L氯化鈉、5g/L酵母以及10g/L胰蛋白胨或10g/L氯化鈉、 5g/L酵母、10g/L胰蛋白胨以及瓊脂158/1，其？!1為7.2。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)蘋果幼苗的方法，其特征在 于，所述供體菌株接種到LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的條件是置于恒溫?fù)u床，以ISOrpm的轉(zhuǎn)速 在的條件下培養(yǎng)Mh。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)蘋果幼苗的方法，其特征在 于，所述離心條件是常溫下以3000rpm的轉(zhuǎn)速離心8分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)蘋果幼苗的方法，其特征在 于所述生根培養(yǎng)用生根培養(yǎng)基培養(yǎng)，所述生根培養(yǎng)基包括吲哚乙酸0. 2mg/L,200mg/L頭 孢霉素、50mg/L卡那霉素以及一半體積的MS培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)條件為光周期14h/10h、光照強度20001x以及溫度25士2°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)蘋果幼苗的方法，其特征在 于所述組培苗葉片暗培養(yǎng)的溫度是20°C，時間是2天。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)蘋果幼苗的方法，其特征 在于所述浸染后的葉片吸去表面附著的菌液是置于無菌濾紙上進行。
全文摘要
一種利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)高效轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)蘋果轉(zhuǎn)基因幼苗的方法，包括以下步驟該方法包括主要包括以植株葉片為受體材料、供體菌株的培養(yǎng)、抑菌素濃度的確定、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化幾個步驟，提供了一種適用于蘋果砧木品種“M26”農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系。本發(fā)明通過優(yōu)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時所涉及到的各項影響條件，提供了一套適合蘋果矮化砧木“M26”的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系，本發(fā)明克服了現(xiàn)有農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)遺傳轉(zhuǎn)化效率低的缺陷，建立起以葉片為受體材料的高效農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系。通過本發(fā)明獲得轉(zhuǎn)基因植株蘋果矮化砧木“M26”植株的抗鹽性等的抗逆性明顯增強。
文檔編號C12N15/84GK102031270SQ20091002419
公開日2011年4月27日 申請日期2009年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日
發(fā)明者馮鳳娟, 師守國, 張燕子, 李永紅, 馬鋒旺 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)