專利名稱：乙肝病毒hbv熒光定量pcr檢測引物與探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種用于檢測乙肝病毒HBV核苷酸序列的的引物和探針。
背景技術(shù)：
乙型肝炎病毒(HBV)，嗜肝DNA病毒科。全世界有3. 5億人攜帶乙肝病毒，每年有近100萬人死于乙肝相關(guān)并發(fā)癥，包括肝硬化、肝細(xì)胞癌。我國是乙型肝炎高發(fā)區(qū)，約57. 6% 的人口過去或現(xiàn)在受到過乙型肝炎病毒的感染，他們中仍有約1.2億人攜帶乙肝病毒，現(xiàn) 癥患者已超過2000萬人。乙肝病毒攜帶者中，50%-75%的人有活動性病毒復(fù)制的慢性乙 肝，估計5年中從慢性乙肝進(jìn)展為肝硬化的發(fā)生率為2% -20% ；從代償性肝硬化到肝臟失 代償為20% -23%;從代償肝硬化到肝癌為6% -15%。慢性乙肝是進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭和 肝細(xì)胞癌的首要危險因素乙肝病毒攜帶者中，50%-75%的人有活動性病毒復(fù)制的慢性乙 肝，估計5年中從慢性乙肝進(jìn)展為肝硬化的發(fā)生率為2% -20% ；從代償性肝硬化到肝臟失 代償為20% -23%;從代償肝硬化到肝癌為6% -15%。HBV的傳染性很強(qiáng)，接種0. 00004ml 含病毒血液足以使人發(fā)生感染。而乙肝病毒又常常產(chǎn)生突變，這給乙肝的確診和治療帶來 極大的麻煩，所以迫切需要一種既準(zhǔn)確又快速的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法來檢測乙肝病毒。乙肝病毒的檢測技術(shù)包括免疫學(xué)檢測方法，包括酶聯(lián)免疫分析法，膠體金免疫層 析測定法，免疫熒光法和固相放射免疫法；分子生物學(xué)檢測方法，包括核酸探針法，PCR法 和基因芯片法。其中，PCR檢測法簡便、快速，近年來，在臨床檢測中備受青睞，但是，普通 PCR檢測易產(chǎn)生污染。，實(shí)時熒光定量PCR法檢測HBV-DNA較傳統(tǒng)定性PCR技術(shù)操作簡便，檢 測時不需打開反應(yīng)管便可測出定量結(jié)果，從而減少污染機(jī)會，同時提高了檢測靈敏度、特異 性及整個操作的自動化程度。其特異、靈敏且準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在人類傳染病和病原定量上的應(yīng) 用日益廣泛。在實(shí)時熒光定量PCR檢測方法中，引物和探針的設(shè)計尤為重要，決定了檢測結(jié) 果的有效性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種檢測HBV DNA的引物和探針?；谏鲜瞿康模景l(fā)明采用以下技術(shù)方案用于檢測HBV DNA的弓丨物和探針序列包括上游引物HBVF 的序列為5 ‘ TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3 ‘，下游引物HBVR 的序列為5 ‘ GCACAGCTTGGAGGCTTGA3，，探針HBVP 的序列為5 ‘ FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3，本發(fā)明的原理為在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增體系中加入一個與靶序列特異互補(bǔ)的雙熒光 標(biāo)記寡核苷酸探針，探針的5 ’端設(shè)計了 一個報告熒光基團(tuán)，3 ’端設(shè)計了 一個淬滅熒光基團(tuán)。 在探針完整的情況下，報告熒光基團(tuán)發(fā)出熒光被淬滅熒光基團(tuán)吸收，此時檢測不到熒光信 號。當(dāng)有特異PCR產(chǎn)物時，復(fù)性時，標(biāo)記探針與靶序列結(jié)合互補(bǔ)，形成局部雙鏈產(chǎn)生適合于 5’ -3’核酸外切酶外切活性的底物，激活Tag聚合酶的5’外切酶活性，將5’的熒光分子切除，這樣，報告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)分離，淬滅作用被解除，產(chǎn)生熒光信號，通過熒光定 量PCR儀檢測熒光度，即可測得最終的定量結(jié)果。


利用弓I物對HBVF/HBVR和探針HBVP檢測HBV DNA陽性樣品的熒光定量PCR圖。見附圖一。
具體實(shí)施例方式1，引物和探針的設(shè)計通過分別對所有已知的乙肝病毒基因序列比較分析，選擇 高保守的區(qū)段，設(shè)計多對引物和探針，最優(yōu)的引物和探針如下上游弓丨物HBVF 5 ‘ TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3 ‘下游弓丨物HBVR 5 ‘ GCACAGCTTGGAGGCTTGA3，探針HBVP:5' FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3，2，反應(yīng)體系的優(yōu)化利用病人血清作為待檢樣品，分裝后儲存于_20°C2. 1引物濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其他組分相同的情況下，將HBV引物濃度分 別從0. 1 μ M到2. 0 μ M作倍比連續(xù)稀釋，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最優(yōu)引物濃度為 0. 5μΜ。2. 2探針濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其他組分相同的情況下，將HBV探針濃度分 別從0. 01 μ M到1. (MM作倍比連續(xù)稀釋，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析比較，去頂最優(yōu)探針濃度為 0. 05 μ Mo利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定，HBV DNA熒光定量PCR的最 優(yōu)體系為40 μ L。3.儀器檢測通道的選擇選擇的熒光檢測通道應(yīng)與探針?biāo)鶚?biāo)記的報告熒光基團(tuán)一致，具體按照儀器使用說 明書進(jìn)行設(shè)置。4，PCR反應(yīng)條件如下370C 5min, 1 個循環(huán)；95°C 2min, 1 個循環(huán)；95°C 10sec,59°C 40sec，40 個循環(huán)。在 59°C40sec階段收集熒光。5，檢測結(jié)果分析如果待檢樣品中HBV DNA，則顯示陽性擴(kuò)增曲線，檢測靈敏度為100拷貝/mL。如 果待檢樣品中沒有HBV DNA，則沒有信號。顯示上述引物和探針有良好的特異性和檢測靈敏度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)由于我國乙肝病毒多為B和C型，故市場上同類產(chǎn)品基本只針對這兩型。而本 發(fā)明提供的引物和探針，是選取了乙肝病毒已知的所有亞型的高保守區(qū)域，可以達(dá)到所有 亞型都能檢出的效果。并能避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。(2)本發(fā)明提供的引物和探針的檢測靈敏度達(dá)到300拷貝/mL，顯示了其將具有很 好的檢出率。(3)本發(fā)明提供的引物和探針檢測陰性樣品沒有信號，顯示了其很好的特異性。
權(quán)利要求
一種用于檢測乙肝病毒基因(HBV DNA)的引物，其特征在于所述的引物序列包括上游引物HBVF5′TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3′，下游引物HBVR5′GCACAGCTTGGAGGCTTGA3’。
2.一種用于檢測乙肝病毒基因(HBV DNA)的探針，其特征在于所述的探針HBVP序列 為5 ‘ FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3’。
全文摘要
一種用于檢測HBV DNA的引物與探針，引物序列包括上游引物HBVF5′TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG3′下游引物HBVR5′GCACAGCTTGGAGGCTTGA3’探針序列HBVP5′FAM-TCACCTCTGCCTAATC-MGB3’。
文檔編號C12Q1/70GK101812533SQ20091002442
公開日2010年8月25日 申請日期2009年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月24日
發(fā)明者于秀菊, 李楊霞, 符芳芳 申請人:江蘇默樂生物科技有限公司