用于檢測(cè)巴貝斯蟲的引物和實(shí)時(shí)熒光定量pcr試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及檢測(cè)一對(duì)用于檢測(cè)巴貝斯蟲的引物對(duì)，其中的上下游引物序列如如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。一種用于檢測(cè)巴貝斯蟲的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒，包括Taq?DNA聚合酶混合液，ROX染料，引物1：核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示，引物2：核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示，TaqMan探針：核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示，陰性對(duì)照，陽性對(duì)照。提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒使用方便，試劑盒所用的試劑少，大大簡(jiǎn)化了操作過程，減少了在操作過程的污染，檢測(cè)效果特異性強(qiáng)，靈敏度高。
【專利說明】用于檢測(cè)巴貝斯蟲的引物和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種用于檢測(cè)巴貝斯蟲的引物和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]巴貝斯蟲病(Babesiosis)，是由頂復(fù)門孢子蟲綱梨形蟲亞綱梨形蟲目巴貝斯屬的多種原蟲寄生于動(dòng)物和人體而導(dǎo)致的一類血液原蟲病的總稱。研究顯示，人巴貝斯蟲病的主要病原是雙芽巴貝斯蟲(Babesia divergens)和鼠源巴貝斯蟲(Babeisia microti)。人體感染后，可引起血紅蛋白尿、黃疸、高熱等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。
[0003]巴貝斯蟲病的傳染源是動(dòng)物宿主，蜱是傳播媒介。離開蜱和宿主，巴貝斯蟲不能存活。嚙齒類動(dòng)物的數(shù)量大，分布廣，活動(dòng)場(chǎng)所與蜱的生境一致，其常有蜱寄生。流行病學(xué)資料顯示，人群患者多是在野外旅游或作業(yè)時(shí)，因受到蜱叮咬而發(fā)病。因此，嚙齒類動(dòng)物作為人巴貝斯蟲病的傳染源意義十分重大。特別是隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高和戶外旅游業(yè)的發(fā)展，增加了人類患此類疾病的機(jī)會(huì)，特別是增高了從非流行區(qū)進(jìn)入流行區(qū)時(shí)被感染的風(fēng)險(xiǎn)。近年來，人感染巴貝斯蟲病例的報(bào)道不斷增多，因此，開展人巴貝斯蟲病的相關(guān)研究顯得尤為迫切。由于人巴貝斯蟲病沒有典型的臨床表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)成為人巴貝斯蟲病診斷的主要依據(jù)，尤其是對(duì)于非典型癥狀或無癥狀感染者，靈敏的檢測(cè)技術(shù)成為檢測(cè)人巴貝斯蟲的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的巴貝斯蟲的檢測(cè)方法是采用血涂片染色鏡檢的方式進(jìn)行，但圖片染色鏡檢結(jié)果收到很多因素的影響，準(zhǔn)確性較差。目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)用的方法是普通PCR，但普通PCR結(jié)果并不理想，并且對(duì)巴貝斯蟲檢測(cè)繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，本發(fā)明提供一組用于檢測(cè)巴貝斯蟲的核酸序列。
[0005]本發(fā)明還提供一種用于檢測(cè)巴貝斯蟲的實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒。
[0006]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
[0007]一種用于PCR檢測(cè)巴貝斯蟲的引物對(duì)，所述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID N0.1和 SEQ ID N0.2 所示。
[0008]一組用于檢測(cè)巴貝斯蟲的實(shí)時(shí)熒光定量PCR核酸，該組核酸包括引物對(duì)、探針和作為陽性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示，所述探針的核苷酸 序列如SEQ ID N0.3所示，所述作為陽性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如 SEQ ID N0.4 所示。
[0009]一種用于檢測(cè)巴貝斯蟲的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的試劑盒，該試劑盒包括:
[0010]Taq DNA聚合酶混合液(2 X );
[0011]ROX 染料；
[0012]引物1:核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示；
[0013]引物2:核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；[0014]TaqMan探針:核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，并且其5'標(biāo)記有FAM基團(tuán)、3 '端標(biāo)記NONE基團(tuán)；
[0015]陰性對(duì)照:滅菌超純水；
[0016]陽性對(duì)照:攜帶有擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)粒DNA，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQIDN0.4所示。
[0017]如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，所述Taq DNA聚合酶混合液(2 X )為PCR反應(yīng)用的DNA聚合酶、Buffer、dNTP混合液的2倍濃度的混合物；所述ROX染料為ROX ReferenceDye II (50X)。
[0018]如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，在應(yīng)用該試劑盒時(shí)，按照以下終濃度配置實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液:
[0019]
【權(quán)利要求】
1.一種用于PCR檢測(cè)巴貝斯蟲的引物對(duì)，其特征在于，所述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示。
2.一組用于檢測(cè)巴貝斯蟲的實(shí)時(shí)熒光定量PCR核酸，其特征在于，該組核酸包括引物對(duì)、探針和作為陽性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物，所述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，所述作為陽性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示。
3.一種用于檢測(cè)巴貝斯蟲的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括: Taq DNA聚合酶混合液(2 X ); ROX染料； 引物1:核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示； 引物2:核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示； TaqMan探針:核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示，并且其Y標(biāo)記有FAM基團(tuán)、3丨端標(biāo)記NONE基團(tuán)； 陰性對(duì)照:滅菌超純水； 陽性對(duì)照:攜帶有擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)粒DNA，所述擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQID N0.4所/Jn ο
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述TaqDNA聚合酶混合液(2X )為PCR反應(yīng)用的DNA聚合酶、B uffer、dNTP混合液的2倍濃度的混合物；所述ROX染料為ROXReference Dye II (50X)。
5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，在應(yīng)用該試劑盒時(shí)，按照以下終濃度配置實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液:
Taq DNA聚合酶混合液(2x)Ix'j!物 I0.5μΜ/μ?引物 20.5μΜ/μΙ^TaqMan 探針0.25μΜ/μ?
ROX Reference Dye Il (5()χ)Ix。
【文檔編號(hào)】C12R1/90GK103710433SQ201310566411
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月14日
【發(fā)明者】劉麗娟, 陳倩, 富英群 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院