專利名稱：腸道病毒ev71檢測(cè)特異性引物和探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種用于檢測(cè)腸道病毒EV71核苷酸序列的特異性引物和探針。
背景技術(shù)：
人腸道病毒71型(EV71)屬于腸道病毒(Enteroviruses，EVs)，微小核糖核酸病 毒科，其核酸為單股正旋RNA，其衣殼蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4四種結(jié)構(gòu)組成。EV71感染 常引起患者手足口病，并可造成嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，同時(shí)，有關(guān)于其引起神經(jīng)性肺水腫的 報(bào)道。自1969年首自從加利福尼亞一患者糞便中分離出后，如今，EV71已蔓延至全世界， 嚴(yán)重威脅人類，尤其是嬰幼兒的健康與生命，并引起了多次爆發(fā)與流行，導(dǎo)致社會(huì)恐慌。由 于目前尚無(wú)有效的針對(duì)EV71的疫苗，因此，及時(shí)診斷疾病、處理疫情十分重要，而這就需要 一種既能準(zhǔn)確又快速的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)方法來(lái)確定病原，這也是臨床診斷與流行病學(xué)研究的一 個(gè)必不可少的環(huán)節(jié)。腸道病毒EV71的檢測(cè)技術(shù)包括有病毒分離、血清免疫學(xué)、以PCR為基礎(chǔ)的分子生 物學(xué)和免疫組化等方法。病毒分離方法繁瑣，周期長(zhǎng)，而且，有可能會(huì)得不到合適的臨床標(biāo) 本或無(wú)法分離到病毒株。使用血清型特異性的中和抗血清進(jìn)行的中和實(shí)驗(yàn)可用于進(jìn)行腸道 病毒的鑒定，試驗(yàn)結(jié)果可靠性不是很高，并且由于腸道病毒包括若干個(gè)血清型，通常要使用 組合抗血清進(jìn)行鑒定。PCR檢測(cè)法簡(jiǎn)便、快速，近年來(lái)，在臨床檢測(cè)中備受青睞，但是，普通 PCR檢測(cè)易產(chǎn)生污染。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法因其特異、靈敏且準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在人類傳染病 和病原定量上的應(yīng)用日益廣泛。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法中，引物和探針的設(shè)計(jì)尤為 重要，決定了檢測(cè)結(jié)果的有效性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測(cè)腸道病毒EV71的特異性引物和探針?；谏鲜瞿康模景l(fā)明采用以下技術(shù)方案。用于檢測(cè)腸道病毒EV71的特異性引物和探針序列包括上游引物VPlF序列 為 5，CAYGTC AGR GCD TGG RTH CC 3，，下游引物 VPlR 序列為 5，KYR TAR TTY GGR TTG GYYTTRAACA 3，和探針 VPlP 序列為 5，F(xiàn)AM CGC CCGATG CGYAAC CAAAATAMRA 3，。本發(fā)明的具體原理是利用一對(duì)靶核酸序列的特異性引物和探針，采用一步法實(shí)時(shí) 熒光定量RT-PCR試劑盒，通過(guò)PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)靶核酸序列片斷的擴(kuò)增。所使用的探針為兩端分 別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)(R)和熒光淬滅基團(tuán)(Q)的寡核苷酸。在探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的 熒光被淬滅基團(tuán)吸收，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性將特異結(jié)合在靶核 苷酸片斷上的熒光探針酶切降解，使報(bào)告基團(tuán)的熒光信號(hào)可以被檢測(cè)，熒光信號(hào)量的變化與 擴(kuò)增產(chǎn)物量成正比，從而可以通過(guò)熒光強(qiáng)弱來(lái)判斷待測(cè)樣本中靶核苷酸序列的存在。


利用引物對(duì)VP1F/VP1R和探針VPIP檢測(cè)腸道病毒EV71陽(yáng)性樣本的熒光PCR擴(kuò)增圖。見(jiàn)附圖1。
具體實(shí)施例方式1.引物和探針的設(shè)計(jì)通過(guò)分別對(duì)所有已知的腸道病毒EV71型VPl基因序列進(jìn) 行比較分析，選擇高度保守的區(qū)段，設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針，引物長(zhǎng)度一般為20堿基左右。最 優(yōu)引物探針序列組合如下上游引物VPlF :5，CAY GTC AGR GCD TGG RTH CC 3，下游引物VPlR :5，KYRTARTTYGGRTTG GYYTTRAACA 3，
探針VPlP :5，F(xiàn)AM CGC CCGATG CGYAAC CAAAATAMRA 3，。2.反應(yīng)體系的優(yōu)化利用滅活的腸道病毒EV71作為待檢樣品，用Trizol試劑抽 提病毒基因組RNA，分裝后貯存于-80°C。2. 1引物濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將EV71引物濃度分別 從0. 1 μ mol/1至1. 6 μ mol/1作倍比連續(xù)稀釋，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳引物 濃度是 0. 2μπιο1/1。2. 2探針濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其它條件相同的情況下，將EV71探針濃度分別 從0. 1 μ mol/1至0. 5 μ mol/1作倍比連續(xù)稀釋，通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，確定最佳探針 濃度是 0. 16 μ mol/1。利用上述引物和探針進(jìn)行反應(yīng)體系的建立，最后確定采用的EV71實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR反應(yīng)體系為25 μ 1。按照一步法熒光定量RT-PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反應(yīng)液的配置。3.儀器檢測(cè)通道的選擇選擇的熒光檢測(cè)通道應(yīng)與探針?biāo)鶚?biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)一致，具體按照儀器使用說(shuō) 明書(shū)進(jìn)行設(shè)置。4. PCR反應(yīng)條件如下420C 30min 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；95°C 3min, 1 個(gè)循環(huán)；94°C 10s, 55°C 40s, 40 個(gè)循環(huán)， 在55°C40s階段收集熒光。5.檢測(cè)結(jié)果分析如果待檢樣本中含有EV71，則顯示陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000拷 貝/ml，如果待檢樣本中沒(méi)有EV71，則顯示陰性擴(kuò)增曲線，即無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，提示上述引物對(duì) 和探針具有良好的特異性和靈敏度。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(1)本發(fā)明提供的引物和探針的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1000拷貝/ml，說(shuō)明其靈敏
度良好。(2)本發(fā)明提供的引物和探針對(duì)不含EV71的樣本沒(méi)有檢測(cè)信號(hào)，說(shuō)明其特異性強(qiáng)。(3)由于本發(fā)明是針對(duì)EV71VP1基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，選取高度保守部位進(jìn)行 引物和探針的設(shè)計(jì)，避免了假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。
權(quán)利要求
一種用于檢測(cè)和鑒定腸道病毒EV71的特異性引物序列，其特征在于所述的引物序列包括上游引物VP1F序列為5’CAY GTC AGR GCD TGG RTH CC 3’，下游引物VP1R序列為5’KYRTARTTYGGRTTG GYYTTRAACA 3’。
2.一種用于檢測(cè)和鑒定腸道病毒EV71的特異性探針序列，其特征在于所述的探針序 列為 5，F(xiàn)AM CGC CCG ATG CGYAAC CAAAATAMRA 3，。
全文摘要
一種用于檢測(cè)腸道病毒EV71核苷酸序列的特異性引物和探針。引物序列包括上游引物VP1F序列為5’CAY GTC AGR GCD TGG RTH CC 3’，下游引物VP1R序列為5’KYR TARTTY GGR TTG GYY TTR AAC A 3’和探針VP1P序列為5’FAM CGC CCG ATG CGY AACCAAAATAMRA3’。
文檔編號(hào)C12R1/93GK101812535SQ20091002442
公開(kāi)日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2009年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月24日
發(fā)明者李楊霞, 楊英, 符芳芳 申請(qǐng)人:江蘇默樂(lè)生物科技有限公司