專利名稱：鈉/鉀三磷酸腺苷酶及src相關(guān)的材料和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物學(xué)、化學(xué)及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及與心血管疾病相關(guān)的離子轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)、小的藥物活性分子、研究工具、診斷方法、試劑盒及處理方法。影響膽固醇介導(dǎo)的心血管疾病的強心類固醇拮抗劑及組合物在本發(fā)明領(lǐng)域內(nèi)。其他領(lǐng)域，如物理學(xué)及生物化學(xué)也為本發(fā)明提供了框架。
背景技術(shù)：
本發(fā)明部分基于鈉/鉀三磷酸腺苷合成酶(Na/K ATPase)的新結(jié)構(gòu)構(gòu)象及功能的確證，尤其是對新的結(jié)合位點及相互作用的確證。本發(fā)明提供了 Na/K ATPase及與Na/KATPase相互作用的化合物之間的驚人的結(jié)構(gòu)及功能關(guān)系的應(yīng)用。本發(fā)明提供了解決方案，其化學(xué)上影響了 Na/K ATPase相互作用以及已知的其上游和下游的調(diào)節(jié)子。鈉和鉀穿過細胞膜的轉(zhuǎn)運活性與許多細胞過程包括代謝、基因表達和細胞生長有內(nèi)在的聯(lián)系。Na/K-ATPase有高度的表達并代表了動物生理學(xué)中最基本、重要的蛋白質(zhì)之一。此外，Na/K-ATPase的表達和活性對于調(diào)節(jié)細胞的總體轉(zhuǎn)運活性非常重要。此種稱為泵動/滲漏偶聯(lián)的形式在幾乎每種哺乳動物細胞中存在。因為蛋白質(zhì)磷酸化構(gòu)成了一種關(guān)鍵的機制，細胞過程通過這種機制得到協(xié)調(diào)，本發(fā)明人假設(shè)存在有能夠?qū)a/K-ATPase的跨膜轉(zhuǎn)運活性與蛋白質(zhì)激酶的開/關(guān)相偶聯(lián)的受體機制。已知大量的Na/K-ATPase在培養(yǎng)的細胞及體內(nèi)與Src激酶直接相互作用。所述相互作用涉及至少兩對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。具體地，α I亞基的第二個胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(CD2)與SrcSH2相互作用，且核苷酸結(jié)合(N)結(jié)構(gòu)域與Src激酶結(jié)構(gòu)域相結(jié)合。后一種相互作用使得Src保持失活狀態(tài)并且強心類固醇如烏本苷對Na/K-ATPase/Src復(fù)合物的結(jié)合激活了相結(jié)合的Src，導(dǎo)致多種蛋白質(zhì)激酶級聯(lián)的激活。發(fā)明概述本發(fā)明提供了包含氨基酸化合物的實體組合物，所述氨基酸化合物包含序列STNCV EGTAR GIVVY TCD[SEQ ID NO: I]的至少十個連續(xù)氨基酸殘基，或所述至少十個連續(xù)氨基酸殘基的保守性置換，其中的化合物能夠結(jié)合Src的SH2結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選的是進一步包含治療可接受賦形劑的那些組合物。其中氨基酸化合物包含序列STNCV EGTAR GIVVY TCD[SEQ ID NO: I]的那些組合物為最優(yōu)選的。還優(yōu)選的是以選自以下的IC5tl結(jié)合于Src的那些低于大約90nM;低于大約75nM;50nM;低于大約40nM;低于大約30nM，低于大約20nM;低于大約IOnM;及低于7nM。還提供了編碼本文的組合物的核酸化合物，以及載體、細胞，具體而言為大腸桿菌和哺乳動物細胞，尤其是腫瘤細胞。還提供了針對本文組合物所選的單克隆抗體， 尤其是進一步包含選自以下的可檢測標(biāo)簽的那些抗體放射性標(biāo)簽；化學(xué)標(biāo)簽；熒光標(biāo)簽；抗體；及蛋白質(zhì)。優(yōu)選的是本文的那些組合物，其中組合物能夠影響選自以下的細胞過程拮抗CTS-誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)激酶級聯(lián)；上調(diào)CTS誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)激酶級聯(lián)；Src抑制；Src刺激；Na/K-ATPase模擬物；Na/K-ATPase競爭性抑制劑；Lyn抑制；Lyn刺激；烏本苷拮抗；烏本苷刺激；ERKl/2激活；ERKl/2抑制；鈉離子介導(dǎo)的細胞膜通透；鉀離子介導(dǎo)的細胞膜通透。還優(yōu)選的是本文的那些組合物，其進一步包含至少一種另外的可用于治療選自以下疾病的治療組合物癌癥；脈管疾??；心血管疾?。恍呐K疾?。磺傲邢侔?；乳腺癌；成神經(jīng)細胞瘤；心肌肥大；組織纖維化；充血性心力衰竭；缺血/再灌注損傷；以及Src相關(guān)疾病。還優(yōu)選的是本文的那些化合物，其進一步包含與所述氨基酸化合物在SEQ IDNO: I之外的位點相結(jié)合的第二種化合物，其中第二種化合物選自化療藥物；毒素；免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑；酶；以及放射性同位素。在其他廣泛的實施方式中，提供了在體外將化合物結(jié)合于SH2結(jié)構(gòu)域的方法，包括將本文的化合物與Src的至少一個SH2結(jié)構(gòu)域相接觸。優(yōu)選的方法是將化合物在表達Src的細胞中與Src的SH2結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，包括將本文的化合物與至少一種表達Src的細胞相接觸。更優(yōu)選的是那些方法，其中表達Src的細胞為哺乳動物細胞，尤其是單核細胞，心臟細胞，肝細胞，脈管細胞；乳腺細胞；前列腺細胞；腎細胞；肌細胞；血細胞；以及腦細胞。優(yōu)選的是體外和體內(nèi)方法，尤其是動物模型，具體而言是小鼠和人類。還提供了在需要這種治療的哺乳動物中治療Src相關(guān)疾病的方法，包括施用本文的治療組合物。具體而言，優(yōu)選的是那些方法，其中Src相關(guān)疾病選自癌癥；脈管疾病；心血管疾病；心臟疾?。磺傲邢侔?；乳腺癌；成神經(jīng)細胞瘤；心肌肥大；組織纖維化；充血性心力衰竭；缺血/再灌注損傷。優(yōu)選的是用于治療哺乳動物的方法，尤其是其中哺乳動物為人類的那些方法。還提供了在需要這種治療的哺乳動物中治療癌癥的方法，包括施用本文的Src抑制性治療組合物。還提供了在需要這種治療的哺乳動物中治療脈管疾病的方法，包括施用本文的Src抑制性治療組合物。還提供在需要這種治療的哺乳動物中治療心血管疾病的方法，包括施用本文的Src抑制性治療組合物。還提供了在需要這種治療的哺乳動物中治療心臟疾病的方法，包括施用本文的Src抑制性治療組合物。還提供了在需要這種治療的哺乳動物中治療前列腺癌的方法，包括施用本文的Src抑制性治療組合物。還提供了在需要這種治療的哺乳動物中治療乳腺癌的方法，包括施用本文的Src抑制性治療組合物。還提供了在需要這種治療的哺乳動物中治療成神經(jīng)細胞瘤的方法，包括施用本文的Src抑制性治療組合物。還提供了在需要這種治療的哺乳動物中治療心肌肥大的方法，包括施用本文的Src抑制性治療組合物。還提供了在需要這種治療的哺乳動物中治療組織纖維化的方法，包括施用本文的Src抑制性治療組合物。還提供了在需要這種治療的哺乳動物中治療充血性心力衰竭的方法，包括施用本文的Src抑制性治療組合物。 還提供了在需要這種治療的哺乳動物中治療缺血/再灌注損傷的方法，包括施用本文的Src抑制性治療組合物。還提供了用于在腫瘤細胞中降低增加的基礎(chǔ)Src活性的方法，包括向表達Src的腫瘤細胞施用本文的Src抑制性組合物。還提供了用于在腫瘤細胞中影響FAK的方法，包括向表達Src的腫瘤細胞施用本文的Src抑制性組合物，尤其是其中的表達Src的細胞為TCN細胞。還提供了用于在腫瘤細胞測試模型中降低腫瘤細胞的遷移的方法，包括向表達Src的腫瘤細胞施用權(quán)利要求I的Src抑制性組合物。還提供了用于在Na/K ATPase表達降低時殺死癌細胞的方法，包括向具有降低的Na/K ATPase表達的表達Src的腫瘤細胞施用本文的Src抑制性組合物。還提供了用于抑制腫瘤細胞系的細胞生長的方法，包括向表達Src的腫瘤細胞系施用本文的Src抑制性組合物，尤其是進一步包括比較本文的組合物抑制腫瘤細胞系的細胞生長的能力與測試化合物抑制相同的腫瘤細胞系的細胞生長的能力。還提供了用于抑制前列腺腫瘤系的前列腺腫瘤細胞生長的方法，包括向表達Src的前列腺腫瘤細胞系施用本文的Src抑制性組合物，尤其是進一步包括比較權(quán)利要求I的組合物抑制前列腺腫瘤細胞系的前列腺腫瘤細胞生長的能力與測試化合物抑制相同的前列腺腫瘤細胞系的細胞生長能力。還提供了用于抑制乳腺腫瘤系的乳腺腫瘤細胞生長的方法，包括向表達Src的乳腺腫瘤細胞系施用本文的Src抑制性組合物，尤其是進一步包括比較權(quán)利要求I的組合物抑制乳腺腫瘤細胞系的乳腺腫瘤細胞生長的能力與測試化合物抑制相同的乳腺腫瘤細胞系的細胞生長能力。還提供了用于抑制成神經(jīng)細胞瘤腫瘤細胞系的神經(jīng)細胞瘤細胞生長的方法，包括向表達Src的成神經(jīng)細胞瘤腫瘤細胞系施用本文的Src抑制性組合物,尤其是進一步包括比較權(quán)利要求I的組合物抑制成神經(jīng)細胞瘤腫瘤細胞系的成神經(jīng)細胞瘤腫瘤細胞生長的能力與測試化合物抑制相同的成神經(jīng)細胞瘤腫瘤細胞系的細胞生長能力。還提供了用于篩選至少一種測試組合物以確定所述至少一種組合物是否影響Src的方法，包括向Src引入測試組合物，其包含具有STNCVEGTAR GIVVY TCD[SEQ ID NO: I]的修飾氨基酸化合物，其中的修飾為至少一種保守性氨基酸置換；以及確定測試組合物是否影響Src。優(yōu)選的是上文描述的方法,其中的影響選自Src結(jié)合；Src抑制；Src刺激；Src功能；Lyn結(jié)合；Lyn功能；Lyn抑制；烏本苷拮抗；Na/K-ATPase功能；ERKl/2功能；FAK抑制；通過鈉離子的膜通透；通過鉀離子的膜通透。還優(yōu)選的是如上文的那些方法，其中引入測試組合物是在體外完成的，在至少一種哺乳動物細胞和/或至少一種腫瘤細胞系中完成。還優(yōu)選的是如上文的那些方法，其中確定組合物是否影響Src是通過與對照比較細胞生長、與對照比較腫瘤生長、與對照比較細胞遷移而測量的，優(yōu)選地在動物模型中、最優(yōu)選的是在N0D/SCID小鼠和/或人類中進行。還提供的是篩選能夠抑制Na/K ATPase的⑶2結(jié)構(gòu)域與Src的SH2結(jié)構(gòu)域之間結(jié)合的測試組合物的方法，包括步驟a.將測試組合物與純化的Src在容器中孵育至少5至45分鐘；b.將Na/K ATPase加入容器，孵育至少5分鐘至45分鐘；c.將烏本苷加入容器，孵育至少I分鐘至45分鐘；d.將Mg2+/ATP加入容器，孵育至少O. 5分鐘至45分鐘；e.進行western印跡分析以確定Src激活是否受到烏本苷的誘導(dǎo)。優(yōu)選的方法是其中步驟a和b分別為12-17分鐘，步驟c為2-7分鐘，步驟d為至少一分鐘。 還提供了篩選能夠抑制Na/K ATPase的⑶2結(jié)構(gòu)域與Src的SH2結(jié)構(gòu)域之間結(jié)合的測試組合物的方法，包括步驟a.將測試組合物與CD2結(jié)構(gòu)域和SH2結(jié)構(gòu)域的FRET對相接觸；以及b.鑒定消除FRET能量的那些組合物，其能夠抑制CD2/SH2相互作用。優(yōu)選的方法是其中用Cy3標(biāo)記⑶2而用Cy5標(biāo)記SH2，特別是通過在96孔板中孵育，最具體地，F(xiàn)RET能量是使用分光計測量的。本領(lǐng)域技術(shù)人員在參考附隨的圖并閱讀以下優(yōu)選實施方式的詳細描述后，將清楚本發(fā)明的多個方面。附圖簡述本專利或申請文件可以包含一個或多個彩色圖片及/或一張或多張照片。帶有彩色圖片及/或照片的本專利或?qū)＠暾埑霭嫖锏母北緦⒂擅绹鴮＠虡?biāo)局在收到請求及必要的支付費用時進行提供。

圖1A-1B. Na/K-ATPase和Src之間的相互作用圖1A:GST下拉(pull-down)分析顯示Src和α I亞基的兩個結(jié)構(gòu)域之間的濃度依賴性相互作用。不同構(gòu)建體的純化及下拉分析如先前描述的進行。上圖顯示了代表性的western印跡結(jié)果。下圖顯示了對GST、GST-⑶2以及GST-NDl的考馬斯亮藍染色。n=3。
圖IB Na/K-ATPase/Src相互作用建模。El和E2Na/K_ATPase的建模是基于SERCAla結(jié)構(gòu)文件1SU4以及Na/K-ATPase結(jié)構(gòu)文件2zxe，使用SPDBView V3. 7程序生成。α I亞基中的A結(jié)構(gòu)域(N末端及⑶2)以天藍色標(biāo)記，P結(jié)構(gòu)域為綠色，N結(jié)構(gòu)域為紅色。Src的SH2結(jié)構(gòu)域標(biāo)記為紫色，激酶結(jié)構(gòu)域為藍色。圖2Α-2Β. Na/K-ATPase 對 Src 的 El 和 E2 依賴性調(diào)控圖2A和圖2B :化學(xué)修飾劑對Na/K-ATPase結(jié)合的Src的調(diào)控。從豬腎純化Na/K-ATPase,純化的Src購自Upstate。為穩(wěn)定以E2P構(gòu)象的Na/K-ATPase,按所描述的方法用兩種不同的氟化物(BeF和AIF)對純化的Na/K-ATPase進行處理、洗滌并然后與Src —同孵育。將烏本苷處理的及對照的Na/K-ATPase/Src復(fù)合物分別用作實驗的陽性和陰性對照。類似地，如所描述的方法用NEM/AMPPNP將Na/K-ATPase穩(wěn)定化在ElP狀態(tài)，然后進行分析。圖2C.胰凝乳蛋白酶及胰蛋白酶消化對Na/K-ATPase介導(dǎo)的Src調(diào)控的影響。按所描述的方法對純化的Na/K-ATPase進行胰凝乳蛋白酶及胰蛋白酶消化。洗滌經(jīng)消化的酶并測定Na/K-ATPase活性。將具有低于25%活性的酶制備物與Src在150mM Na+基質(zhì)中一同孵育，加入或不加10μ M烏本苷。未消化的酶用作對照。測量Src的活性，并顯示了各種實驗條件下的代表性western印跡結(jié)果。定量數(shù)據(jù)表示為至少3次獨立實驗的平均值土S. E.。*，ρ〈0· 05 ；**, ρ<0. 01。圖3A-3G.不同離子對Na/K-ATPase結(jié)合的Src的調(diào)控圖3A、圖3B和圖3C Na+和K+對Na/K-ATPase結(jié)合Src的影響。將純化的Na/K-ATPase在不同配體存在下與純化的Src孵育15min,并測定Tyr418磷酸化情況,如圖2。顯示了各種實驗條件下的代表性western印跡結(jié)果。定量數(shù)據(jù)表示為至少3次獨立實驗的 平均值土 S.E.。 圖3D :細胞外K+對LLC-PKl細胞中Src的影響。將細胞暴露于正?；|(zhì)(K+5mM)或低K+(K+ImM)基質(zhì)，然后按所描述的方法對Tyr(P)418Src進行染色。標(biāo)尺為20 μ m。圖3E、圖3F和圖3G:將細胞暴露于含有不同濃度K+或Na+的基質(zhì)，然后裂解。如所示的，對細胞裂解物進行Src和ERK的western印跡分析。定量數(shù)據(jù)表示為至少3次獨立實驗的平均值土 S. E.。*，ρ〈0· 05 ;**，ρ〈0· 01。圖4.⑶2C2肽作為潛在的烏本苷拮抗劑將CD2C2肽與純化的Src在PBS溶液中孵育15分鐘(所用量表示為Src/Cd2C2的摩爾比)。加入從豬腎純化的Na/K ATPase，15分鐘。此后，將烏本苷加入反應(yīng)體系，5分鐘，隨后加入2mM Mg2+/ATP。Src活性通過western印跡而確定,其中使用抗-磷酸化Tyr418。顯示了代表性的western印跡，定量數(shù)據(jù)表示為至少3次獨立實驗的平均值土S.E.。**，p〈0. Ol0圖5. YFP和YFP-⑶2穩(wěn)定細胞系的建立在克隆YFP Ctrl及⑶2_2細胞系中顯示YFP和YFP-⑶2的表達。⑶2來自豬的Na/K ATPase (Swiss Prot ID P05024)氨基酸-152-288 (細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域 2)。圖6.⑶2的表達對細胞生長的影響對照細胞系(LLCYFP 和 YFP Ctrl)以及 YFP-CD2 克隆(CD2-1、CD2-2 和 CD2-5)。將20，000個細胞鋪板于12孔板并在24、48、72和96小時進行臺盼藍染色，使用血球計數(shù)儀對細胞數(shù)量進行計數(shù)。對數(shù)據(jù)進行作圖，如上文所示(3次獨立實驗的組合，n=3)。圖7.⑶2C2肽作為新型的烏本苷拮抗劑圖7A，⑶2C2肽減弱了⑶2對Src的結(jié)合。以所示的濃度，將⑶2C2加入Src和GST-⑶2的混合物。對下拉產(chǎn)物中的Src以抗-Src抗體進行western印跡分析。圖7B，⑶2C2對烏本苷誘導(dǎo)的Src激活的拮抗。將Src與所示量的⑶2C2肽在PBS中預(yù)孵育15分鐘。然后加入從豬腎純化的Na/K-ATPase，15分鐘。向混合物加入I μ M烏本苷，5分鐘。然后在2mM ATP/Mg2+的存在下，檢測Src的自磷酸化情況。顯示了三次獨立實驗的代表性雜交結(jié)果。發(fā)明詳述Na/K-ATPase在離子泵循環(huán)中經(jīng)歷了 E1/E2構(gòu)象轉(zhuǎn)變。大量的細胞Na/K-ATPase也通過兩對結(jié)構(gòu)域與Src激酶相互作用。盡管Na/K-ATPase驅(qū)動子結(jié)構(gòu)域結(jié)合Src SH2結(jié)構(gòu)域的親和力高于核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域與Src激酶結(jié)構(gòu)域之間的親和力，后者的結(jié)合保持了Src處于失活狀態(tài)。ElNa/K-ATPase可同時結(jié)合SH2及激酶結(jié)構(gòu)域，并且El到E2的轉(zhuǎn)變會釋放激酶結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致Na/K-ATPase結(jié)合的Src的激活。事實上，本發(fā)明人使用純化的酶制備物證明了 Src的此種構(gòu)象依賴的調(diào)節(jié)。與此一致,增加E2Na/K-ATPase形成的細胞條件在活細胞中刺激了細胞的Src活性及下游的蛋白質(zhì)激酶級聯(lián)?？傊?，這些發(fā)現(xiàn)現(xiàn)在顯示了之前未認識到的信號傳導(dǎo)機制，其可將Na/K-ATPase構(gòu)象狀態(tài)的變化與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)激酶級聯(lián)的激活/抑制相偶聯(lián)?；贜a/K-ATPase的晶體結(jié)構(gòu)，⑶2組成了驅(qū)動子結(jié)構(gòu)域(A)的一部分。如圖IA中說明的，A和SH2結(jié)構(gòu)域之間的相互作用顯示的親和力比N結(jié)構(gòu)域/激酶結(jié)構(gòu)域相互作用更高。此外，本發(fā)明人的體外結(jié)合數(shù)據(jù)表明Na/K-ATPase在沒有烏本苷的存在下很可能與SH2以及激酶結(jié)構(gòu)域同時相互作用。在泵循環(huán)中，Na/K-ATPase經(jīng)歷了 El到E2的構(gòu)象轉(zhuǎn)變，其中N結(jié)構(gòu)域關(guān)閉，而A結(jié)構(gòu)域翻轉(zhuǎn)靠在N和P結(jié)構(gòu)域上。結(jié)構(gòu)模型表明A和N結(jié)構(gòu)域在E2狀態(tài)中的定位及它們之間的空間不大可能允許α亞基同時結(jié)合SH2及激酶結(jié)構(gòu)域 (圖 1Β)。因為Src的結(jié)合甚至在摩爾比I: I時都未對Na/K-ATPase活性顯示出顯著的影響(圖5)，本發(fā)明人如今相信Na/K-ATPase可能對Src發(fā)揮了構(gòu)象依賴性的調(diào)控。具體地，如圖IB中所說明的，當(dāng)ElNa/K-ATPase抑制Src時，E2Na/K_ATPase會釋放激酶結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致Na/K-ATPase結(jié)合的Src的激活。A結(jié)構(gòu)域的翻轉(zhuǎn)可能在Na/K-ATPase的El到E2的轉(zhuǎn)變過程中對將激酶結(jié)構(gòu)域推下移動的N結(jié)構(gòu)域是足夠并必要的，導(dǎo)致Src的激活。本發(fā)明人使用了不同的化學(xué)修飾劑來穩(wěn)定化不同構(gòu)象狀態(tài)的Na/K-ATPase，然后評估Na/K-ATPase對Src的構(gòu)象依賴性影響。氟化物如氟化鋁和氟化鈹能作為磷酸類似物與Na/K-ATPase相互作用，并穩(wěn)定化該酶以及其他P型ATPase的E2P構(gòu)象。因此，為了證明E2Na/K_ATPase對Src活性的刺激作用，本發(fā)明人制備了 AlF-和BeF-Na/K_ATPase并測量其對Src的影響。如圖2A中所描述的，與烏本苷一樣，用氟化鋁或氟化鈹對Na/K-ATPase的處理足以刺激Na/K-ATPase結(jié)合的Src。在另一方面，當(dāng)N-乙基順丁烯二酰亞胺(NEM)及可慢性水解的ATP類似物腺苷-5’ -基亞氨二磷酸鹽(AMP-PNP)將Na/K-ATPase穩(wěn)定化在ElP狀態(tài)時，Na/K-ATPase結(jié)合的Src受到完全的抑制(圖2B)。作為對照，本發(fā)明人還評估了這些化學(xué)修飾劑是否對Src有直接的影響。在相同實驗條件下未觀察到顯著的影響(數(shù)據(jù)未顯示)。在催化循環(huán)中Na/K-ATPase的El和E2構(gòu)象的存在首先被檢測為Na+或K+基質(zhì)中蛋白質(zhì)水解性裂解的不同形式。在Na+的存在下，胰凝乳蛋白酶在A結(jié)構(gòu)域的Leu-266處裂解ElNa/K-ATPase，產(chǎn)生83kDa的片段。而所述83kDa肽保留了形成磷酸酶中間物(EP)的能力，胰凝乳蛋白酶的裂解破壞了 A和N結(jié)構(gòu)域的協(xié)調(diào)運動，導(dǎo)致ATPase活性受到完全抑制。因此,如果A和N結(jié)構(gòu)域的協(xié)調(diào)運動對于Na/K-ATPase結(jié)合的Src的構(gòu)象依賴性激活是必須的，如圖IB所示，則A結(jié)構(gòu)域不能將Src激酶結(jié)構(gòu)域從N結(jié)構(gòu)域推下會導(dǎo)致Src的完全抑制。事實上，如圖2C中所描述的，盡管Na+ (I號泳道)和烏本苷(2號泳道)能夠刺激Na/K-ATPase結(jié)合的Src，但它們在Na/K-ATPase受到胰凝乳蛋白酶消化后在Na+的存在下不能如此。為進一步確定A和N結(jié)構(gòu)域的協(xié)調(diào)運動的重要性，E2Na/K-ATPase在K+存在下受到胰蛋白酶的消化，經(jīng)過洗滌，然后進行相同的測定。不像胰凝乳蛋白酶，胰蛋白酶在N結(jié)構(gòu)域的Arg-438處裂解E2Na/K-ATPase，產(chǎn)生48kDa的片段，其保留了形成EP的能力。然而，像膜凝乳蛋白酶一樣，膜蛋白酶造成的A和N結(jié)構(gòu)域協(xié)調(diào)運動的破壞在抑制Na和烏本苷誘導(dǎo)的Src激活上同等有效。以上的體外研究表明Na/K-ATPase能夠通過E2/E1構(gòu)象轉(zhuǎn)變中的A和N結(jié)構(gòu)域協(xié)調(diào)運動開啟/關(guān)閉Src。為確認上述發(fā)現(xiàn)并評估此種對Na/K-ATPase結(jié)合的Src的構(gòu)象依賴性調(diào)控的生理學(xué)相關(guān)性，本發(fā)明人將純化的Na/K-ATPase/Src復(fù)合物在已知能改變El/E2Na/K_ATPase形成的不同離子存在下進行孵育。與膽堿相比，Na+更能夠?qū)2構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)镋1。因此，向反應(yīng)緩沖液中加入150mM Na+引起了 Src的部分抑制(圖3A)。此外，在Na+和K+ 二者的存在下，加入ATP-Mg2+會有助于ElNa/K-ATPase的形成并產(chǎn)生Src的進一步抑制(圖3B)。然而，從此反應(yīng)緩沖液中移除Na+會增加E2Na/K_ATPase的形成。與此一致，其刺激了 Na/K-ATPase結(jié)合的Src (圖3B)。生理學(xué)上，將細胞Na/K-ATPase與大約15mM Na+細胞內(nèi)地和5mM K+細胞外地接觸。在這些離子條件下，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Na/K-ATPase結(jié)合的 Src中大部分是失活的。將K+從5mM降低至ImM產(chǎn)生了對Na/K-ATPase結(jié)合的Src的強烈刺激(圖3C)。總而言之，這些發(fā)現(xiàn)如今顯示了 Na/K-ATPase結(jié)合的Src可受到底物誘導(dǎo)的構(gòu)象變化的調(diào)控。上文顯示了 Na/K-ATPase可通過底物誘導(dǎo)的E1/E2轉(zhuǎn)變控制Src活性。因為El/E2Na/K-ATPase在活細胞中的平衡可受到細胞外K+和細胞內(nèi)Na+的調(diào)控，為進一步發(fā)現(xiàn)該E1/E2介導(dǎo)的Src調(diào)控的生理學(xué)重要性，本發(fā)明人在細胞與不同濃度細胞外K+接觸后測量LLC-PKl細胞中Src活性。降低細胞外K+會在活細胞減慢E2P的去磷酸化并累積E2Na/K-ATPase0如圖3D中所描述的，共聚焦成像分析顯示了將細胞外K+從5mM降低至ImM顯著增加了 LLC-PKl細胞中活性Src的細胞含量，這與圖3C中描述的發(fā)現(xiàn)相一致。為確認這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人還于正常或低K+基質(zhì)中孵育細胞后對細胞裂解物進行western印跡分析。如圖3E所示，將K+從5mM降低至ImM如加入烏本苷一樣，不僅刺激細胞的Src活性，還刺激了 ERK的下游激酶信號通路。為確認Na/K-ATPase/Src復(fù)合物是LLC-PK1細胞中低K+誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體，本發(fā)明人在Na/K-ATPase敲除的PY-17細胞中重復(fù)了上述實驗。PY-17細胞來自轉(zhuǎn)染了表達α I特異性siRNA的質(zhì)粒的LLC-PKl細胞。與P-Il細胞相比，PY-17細胞表達大約10%的α I并具有降低數(shù)量的Na/K-ATPase/Src復(fù)合物。如圖3F所示，將細胞外K+從5mM降低至ImM不能增加PY-17細胞中的細胞Src活性，說明Na/K-ATPase/Src復(fù)合物的形成對低K+刺激細胞Src活性是必須的。此觀念進一步得到如下事實的支持通過敲入大鼠α I來修復(fù)ΡΥ-17細胞足以重建低K+誘導(dǎo)的Src激活。為進一步確認對Na/K-ATPase/Src復(fù)合物的離子誘導(dǎo)調(diào)控，本發(fā)明人還將細胞暴露于低的細胞外Na+。降低細胞外Na+有助于活細胞中ElNa/K-ATPase的形成。與此一致，本發(fā)明人觀察到將Na+從150mM降低至15mM引起細胞Src活性的進一步抑制，如圖3G中所描述的。這些發(fā)現(xiàn)如今顯示了 Na/K-ATPase/Src復(fù)合物的形成不僅使細胞外烏本苷,還使得泵底物調(diào)控Src和Src效應(yīng)子。值得注意的是此新型細胞信號傳導(dǎo)機制的數(shù)種獨特的特性。此受體復(fù)合物的形成涉及一對獨特的結(jié)構(gòu)域相互作用。具體地，Na/K-ATPase的A和N結(jié)構(gòu)域都參與與Src激酶的相互作用使得E2/ElNa/K-ATPase可能開啟/關(guān)閉Src的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。而且，E1/E2構(gòu)象介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)機制表明Na/K-ATPase/Src復(fù)合物可起到Na/K-ATPase的細胞外和細胞內(nèi)配體的受體功能。 此外，受體Na/K-ATPase/Src復(fù)合物的離子介導(dǎo)調(diào)控還可以作為細胞以此協(xié)調(diào)穿過質(zhì)膜的泵動及滲漏活性的主要機制，因為蛋白質(zhì)激酶的激活/抑制對于調(diào)控許多膜運輸子的活性和轉(zhuǎn)運都至關(guān)重要。例如，低血鉀在完好的動物中激活Src。此外，這種激活似乎造成了腎上皮細胞中ROMK的表面表達減少，有助于在K+限制條件下腎對K+的保留。最后，除了其底物之外，許多膜及結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)以及脂類與Na/K-ATPase相互作用并調(diào)控El/E2Na/K_ATPase的形成。例如，Y亞基增加El-Na/K-ATPase的形成。此外，數(shù)種天然發(fā)生的突變體將泵穩(wěn)定化在El狀態(tài)。因此，Na/K-ATPase/Src受體復(fù)合物的正常運作可為細胞提供感受細胞外和細胞內(nèi)信號的重要機制，因此協(xié)調(diào)多種細胞過程。這些研究顯示了 Na/K ATPase和Src的結(jié)合涉及兩對相互作用一對是ATPase第二細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(⑶2)和Src SH2結(jié)構(gòu)域之間。另一對是在ATPase核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(N結(jié)構(gòu)域)和Src激酶結(jié)構(gòu)域之間。兩個結(jié)合對的同時結(jié)合保持Src失活，而烏本苷刺激可破壞后面的結(jié)合對并將Src激酶從N結(jié)構(gòu)域釋放，觸發(fā)Src激活。衍生自N結(jié)構(gòu)域的NaKtide顯示了對Src活性的強烈抑制，其通過干擾激酶結(jié)構(gòu)域構(gòu)象進行所述抑制。然而，來自CD2結(jié)構(gòu)域的新肽(氨基酸序列STNCV EGTAR GIVVY TCD[SEQ IDNO: I])破壞了 ATPase⑶2/Src SH2結(jié)構(gòu)域的相互作用并消除了烏本苷誘導(dǎo)的Src刺激。因此，這些肽作為特異性的烏本苷拮抗劑更具有優(yōu)勢，其自身較少干擾細胞Src激酶活性。然而,這些組合物的組合也同樣有益。本發(fā)明還提供了測定法，用于篩選競爭性抑制CD2和SH2之間結(jié)合并拮抗烏本苷刺激的新化學(xué)物。實施例實施例I. CD2方法本發(fā)明人顯示Na/K-ATPase通過兩個結(jié)構(gòu)域結(jié)合Src。Na/K-ATPase的核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域與Src激酶結(jié)構(gòu)域之間的相互作用抑制了 Src活性，而Na/K-ATPase的α亞基的第二細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(CD2)和Src SH2SH3結(jié)構(gòu)域之間的相互作用對受體Na/K-ATPase/Src復(fù)合物的形成起重要作用。為進一步測試后者相互作用的重要性，本發(fā)明人產(chǎn)生了表達YFP融合的CD2的穩(wěn)定細胞系。圖5顯示了 YFP和YFP-CD2在本發(fā)明人建立的兩種穩(wěn)定細胞系的表達。⑶2的序列列于圖例中。如圖6中描述的，YFP-⑶2的表達在功能上引起細胞生長的顯著抑制，表明⑶2在受體Na/K-ATPase形成中并因此也在細胞生長的調(diào)控中起重要作用。結(jié)構(gòu)建模表明結(jié)合基序很可能在CD2的C末端。為支持這種觀點，本發(fā)明人檢查了衍生自⑶2的C末端的肽是否能夠減弱⑶2和Src之間的結(jié)合。將純化的GST-⑶2與Src在加入或不加肽時孵育15min。對下拉的沉淀用針對Src的抗體進行western印跡。如圖7A所示，肽⑶2C2能夠競爭并阻斷GST-⑶2對Src SH2結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，而⑶2C1不能。如果⑶2C2肽破壞了 SH2/⑶2相互作用，本發(fā)明人預(yù)期⑶2C2可能消除CTS誘導(dǎo)的Src激活。為對此進行測試，本發(fā)明人將Src與所示量的CD2肽在PBS中預(yù)孵育15min。然后加入純化的豬腎Na/K-ATPase，15min。將I μ M烏本苷加入混合物，5min。然后在2mM ATP/Mg2+存在下，檢測Src自身磷酸化情況。如圖7B所示，向純化的Na/K-ATPase和Src的混合物中添加CD2C2以劑量依賴的形式消除了烏本苷誘導(dǎo)的Src激活，而不是CD2C1。因此，為尋找新的拮抗劑，本發(fā)明人進行以下四組實驗。首先，本發(fā)明人會采用基于結(jié)構(gòu)的方法尋找CD2C2模擬物。本發(fā)明人合成更小的肽并評估其作為CTS拮抗劑的潛能。CD2C2衍生物的結(jié)構(gòu)信息將根據(jù)可得的Na/K-ATPase3D結(jié)構(gòu)(PDB ID:2ZXE)而產(chǎn)生。然后，使用DOCK程序搜索超過400，000種小分子的NCI 3D結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫。從NCI申請候選化合物。評估其作為CTS拮抗劑的活性。第二，本發(fā)明人開發(fā)使用ELISA的形式高通量測定法，搜索化學(xué)物庫以尋找阻斷烏本苷誘導(dǎo)的Src激活的化合物。第三，建立基于FRET測定法以確認拮抗劑(上述研究中的陽性命中)是否靶向CD2/ SH2。簡言之，表達并純化⑶2和His-SH2SH3。通過靶向存在于⑶2和SH2中的可及的半胱氨酸殘基，用FRET熒光素對純化的蛋白質(zhì)進行化學(xué)標(biāo)記。為確認FRET測定，本發(fā)明人測試?yán)?88-CD2和568-SH2SH3之間的FRET效率，并評估所述CD2C2肽能否降低FRED效率。CD2C1用作陰性對照。不用說，如果陽性命中的數(shù)量有限，本發(fā)明人簡單地使用如圖7A中的下拉測定法測試這些化合物對CD2/SH2相互作用的影響。第四，因為陽性命中還可以為Src抑制劑或祀向Src激酶結(jié)構(gòu)域/N結(jié)構(gòu)域相互作用或阻止烏本苷對受體Na/k-ATPase的結(jié)合，本發(fā)明人測試這些化合物不影響CD2和SH2結(jié)構(gòu)域之間相互作用的可能性。實施例2.本發(fā)明人將測試化學(xué)物與商業(yè)可得的純化的Src在PBS溶液中孵育15分鐘。然后，加入純化的豬腎Na/KATPase，15分鐘。此后，將烏本苷加入反應(yīng)體系，5分鐘，隨后加入2mM Mg2+/ATP。通過使用抗-磷酸化的Tyr418雜交的western印跡確定Src活性。將烏本苷處理的Na/KATPase/Src復(fù)合物用作陽性對照。如果能在烏本苷誘導(dǎo)的條件下抑制Src激活，則鑒定為潛在的烏本苷拮抗劑。為進一步確定對CD2/SH2之間的結(jié)合的特異性抑制，設(shè)計了 CD2和SH2的FRET對。用Cy3標(biāo)記CD2，而用Cy5標(biāo)記SH2。兩種肽都在96孔板中孵育，使用分光計測量FRET能量轉(zhuǎn)移。將消除了 FRET能量轉(zhuǎn)移的化學(xué)物鑒定為烏本苷拮抗劑/⑶2/SH2相互作用的抑制劑。這些一般為強心類固醇拮抗劑。雖然本發(fā)明的描述中參考了多種的及優(yōu)選的實施方式，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是可以做出多種變化，而且等價物可以置換其中的成分而不偏離本發(fā)明的本質(zhì)范圍。此外，可作出許多修飾以使具體的情況或材料能適合于本發(fā)明的教導(dǎo)，而不偏離其本質(zhì)范圍。因此，不旨在將本發(fā)明限制在本文公開的用于實行本發(fā)明的具體實施方式
中，而是本發(fā)明包括所有符合權(quán)利要求范圍的實施方式。本文用來闡明本發(fā)明或提供關(guān)于本發(fā)明時間的其他細節(jié)的出版物和其他材料通過引用并入本文，簡便起見，將其在下文的參考目錄中提供。本文提到的任何文檔的引用不旨在認可前述的任何項 為相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)。關(guān)于這些文檔日期的所有陳述或?qū)ζ鋬?nèi)容的表示都是基于申請人可得的信息，不包含任何對這些文檔的日期或內(nèi)容正 確性的認可。
權(quán)利要求
1.包含氨基酸化合物的實體組合物，所述氨基酸化合物包含序列STNCVEGTAR GIVVYTGD[SEQ ID NO: I]的至少十個連續(xù)氨基酸殘基，或所述至少十個連續(xù)氨基酸殘基的保守性置換，其中所述化合物能夠結(jié)合Src的SH2結(jié)構(gòu)域。
2.權(quán)利要求I的組合物，其進一步包含治療可接受的賦形劑。
3.權(quán)利要求I的實體組合物，其中所述氨基酸化合物包含序列STNCVEGTAR GIVVYTGD[SEQ ID NO:I]ο
4.權(quán)利要求I的組合物，其以選自以下的IC5tl結(jié)合于Src:低于大約90nM ;低于大約75nM ;低于大約50nM ;低于大約40nM ;低于大約30nM、低于大約20nM ;低于大約IOnM ;以及低于7nM。
5.編碼權(quán)利要求I的組合物的核酸化合物。
6.包含權(quán)利要求5的核酸化合物的載體。
7.包含權(quán)利要求6的載體的細胞。
8.權(quán)利要求11的細胞，其為大腸桿菌。
9.權(quán)利要求11的細胞，其為哺乳動物細胞。
10.權(quán)利要求11的細胞,其為腫瘤細胞。
11.對權(quán)利要求I的組合物具有選擇性的單克隆抗體。
12.權(quán)利要求10的單克隆抗體，其進一步包含選自以下的可檢測標(biāo)簽放射性標(biāo)簽；化學(xué)標(biāo)簽；滅光標(biāo)簽；抗體；及蛋白質(zhì)。
13.權(quán)利要求I的組合物，其中所述組合物能夠影響選自以下的細胞過程拮抗CTS-誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)激酶級聯(lián)；上調(diào)CTS誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)激酶級聯(lián)；Src抑制；Src刺激；Na/K-ATPase模擬；Na/K-ATPase競爭性抑制劑；Lyn抑制；Lyn刺激；烏本苷拮抗；烏本苷刺激；ERKI/2激活；ERKl/2抑制；通過鈉離子的膜通透；通過鉀離子的膜通透。
14.權(quán)利要求2的組合物，其進一步包含至少一種另外的可用于治療選自以下疾病的治療組合物癌癥；脈管疾病；心血管疾病；心臟疾?。磺傲邢侔?；乳腺癌；成神經(jīng)細胞瘤；心肌肥大；組織纖維化；充血性心力衰竭；缺血/再灌注損傷；以及Src相關(guān)疾病。
15.權(quán)利要求3的組合物，其進一步包含與所述氨基酸化合物在SEQIDΝΟ:1之外的位置相結(jié)合的第二種化合物，其中所述第二種化合物選自化療藥物；毒素；免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)齊IJ;酶；以及放射性同位素。
16.在體外將化合物結(jié)合于SH2結(jié)構(gòu)域的方法，包括將權(quán)利要求I的化合物與Src的至少一個SH2結(jié)構(gòu)域相接觸。
17.在表達Src的細胞中將化合物結(jié)合于Src的SH2結(jié)構(gòu)域的方法，包括將權(quán)利要求I的化合物與至少一種表達Src的細胞相接觸。
18.權(quán)利要求17的方法，其中表達Src的細胞為哺乳動物細胞。
19.權(quán)利要求18的方法，其中哺乳動物細胞為單核細胞。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述至少一種哺乳動物細胞為選自以下的細胞心臟細胞、肝細胞、脈管細胞、乳腺細胞；前列腺細胞；腎細胞；肌細胞；血細胞；以及腦細胞。
21.權(quán)利要求18的方法，其中所述至少一種哺乳動物細胞在體外進行培養(yǎng)。
22.權(quán)利要求18的方法，其中所述至少一種哺乳動物細胞為動物模型的。
23.權(quán)利要求18的方法，其中所述至少一種哺乳動物細胞為人類的。
24.在需要這種治療的哺乳動物中治療Src相關(guān)疾病的方法，包括施用權(quán)利要求2的治療組合物。
25.權(quán)利要求34的方法，其中Src相關(guān)疾病選自癌癥；脈管疾??；心血管疾??；心臟疾病；前列腺癌；乳腺癌；成神經(jīng)細胞瘤；心肌肥大；組織纖維化；充血性心力衰竭；缺血/再灌注損傷。
26.權(quán)利要求34的方法，其中哺乳動物是人類。
27.在需要這種治療的哺乳動物中治療癌癥的方法，包括施用權(quán)利要求2的Src抑制性治療組合物。
28.在需要這種治療的哺乳動物中治療脈管疾病的方法，包括施用權(quán)利要求2的Src抑制性治療組合物。
29.在需要這種治療的哺乳動物中治療心血管疾病的方法，包括施用權(quán)利要求2的Src抑制性治療組合物。
30.在需要這種治療的哺乳動物中治療心臟疾病的方法，包括施用權(quán)利要求2的Src抑制性治療組合物。
31.在需要這種治療的哺乳動物中治療前列腺癌的方法，包括施用權(quán)利要求2的Src抑制性治療組合物。
32.在需要這種治療的哺乳動物中治療乳腺癌的方法，包括施用權(quán)利要求2的Src抑制性治療組合物。
33.在需要這種治療的哺乳動物中治療成神經(jīng)細胞瘤的方法，包括施用權(quán)利要求2的Src抑制性治療組合物。
34.在需要這種治療的哺乳動物中治療心肌肥大的方法，包括施用權(quán)利要求2的Src抑制性治療組合物。
35.在需要這種治療的哺乳動物中治療組織纖維化的方法，包括施用權(quán)利要求2的Src抑制性治療組合物。
36.在需要這種治療的哺乳動物中治療充血性心力衰竭的方法，包括施用權(quán)利要求2的Src抑制性治療組合物。
37.在需要這種治療的哺乳動物中治療缺血/再灌注損傷的方法，包括施用權(quán)利要求2的Src抑制性治療組合物。
38.用于在腫瘤細胞中降低增加的基礎(chǔ)Src活性的方法，包括向表達Src的腫瘤細胞施用權(quán)利要求I的Src抑制性組合物。
39.用于在腫瘤細胞中抑制FAK的方法，包括向表達Src的腫瘤細胞施用權(quán)利要求I的Src抑制性組合物。
40.權(quán)利要求50的方法，其中表達Src的細胞為TCN細胞。
41.用于在腫瘤細胞測試模型中降低腫瘤細胞遷移的方法，包括向表達Src的腫瘤細胞施用權(quán)利要求I的Src抑制性組合物。
42.用于在Na/KATPase表達降低時殺死癌細胞的方法，包括向具有降低的Na/KATPase表達的表達Src的腫瘤細胞施用權(quán)利要求I的Src抑制性組合物。
43.用于抑制腫瘤細胞系的細胞生長的方法，包括向表達Src的腫瘤細胞系施用權(quán)利要求I的Src抑制性組合物。
44.權(quán)利要求54的方法，其進一步包括比較權(quán)利要求I的組合物抑制腫瘤細胞系的細胞生長的能力與測試化合物抑制相同腫瘤細胞系的細胞生長的能力。
45.用于抑制前列腺腫瘤細胞系的前列腺腫瘤細胞生長的方法，包括向表達Src的前列腺腫瘤細胞系施用權(quán)利要求I的Src抑制性組合物。
46.權(quán)利要求45的方法，其進一步包括比較權(quán)利要求I的組合物抑制前列腺腫瘤細胞系的前列腺腫瘤細胞生長的能力與測試化合物抑制相同前列腺腫瘤細胞系的細胞生長的能力。
47.用于抑制乳腺腫瘤細胞系的乳腺腫瘤細胞生長的方法，包括向表達Src的乳腺腫瘤細胞系施用權(quán)利要求I的Src抑制性組合物。
48.權(quán)利要求47的方法，其進一步包括比較權(quán)利要求I的組合物抑制乳腺腫瘤細胞系的前列腺腫瘤細胞生長的能力與測試化合物抑制相同乳腺腫瘤細胞系的細胞生長的能力進行比較。
49.用于抑制成神經(jīng)細胞瘤腫瘤細胞系的成神經(jīng)細胞瘤細胞生長的方法，包括向表達Src的成神經(jīng)細胞瘤腫瘤細胞系施用權(quán)利要求I的Src抑制性組合物。
50.權(quán)利要求49的方法，其進一步包括比較權(quán)利要求I的組合物抑制成神經(jīng)細胞瘤腫瘤細胞系的成神經(jīng)細胞瘤腫瘤細胞生長的能力與測試化合物抑制相同成神經(jīng)細胞瘤腫瘤細胞系的細胞生長的能力。
51.用于篩選至少一種測試組合物以確定所述至少一種組合物是否影響Src的方法，包括 a.向Src引入測試組合物，其包含STNCVEGTAR GIVVY TGD [SEQ ID NO: I]的修飾的氨基酸化合物，其中修飾為至少一種保守性氨基酸置換；以及 b.確定測試組合物是否影響Src。
52.權(quán)利要求51的方法,其中所述影響選自Src結(jié)合；Src抑制；Src刺激；Src功能；Lyn結(jié)合；Lyn功能；Lyn抑制；烏本苷拮抗；Na/K-ATPase功能；ERKl/2功能；FAK抑制；通過鈉離子的膜通透；通過鉀離子的膜通透。
53.權(quán)利要求51的方法，其中引入測試組合物是在體外完成的。
54.權(quán)利要求51的方法，其中引入測試組合物是在至少一種哺乳動物細胞中完成的。
55.權(quán)利要求51的方法，其中引入測試組合物是在至少一種腫瘤細胞系中完成的。
56.權(quán)利要求51的方法，其中確定組合物是否影響Src是通過與對照比較細胞生長而測量的。
57.權(quán)利要求51的方法，其中確定組合物是否影響Src是通過與對照比較細胞遷移而測量的。
58.權(quán)利要求51的方法，其中所述至少一種哺乳動物細胞為動物模型的。
59.權(quán)利要求58的方法，其中所述動物模型為NOD/SCID小鼠。
60.權(quán)利要求59的方法，其中確定組合物是否影響Src是通過與對照比較腫瘤生長而測量的。
61.權(quán)利要求51的方法，其中所述至少一種哺乳動物細胞為人類的。
62.權(quán)利要求61的方法，其中確定組合物是否影響Src是通過與對照比較腫瘤生長而測量的。
63.篩選能夠抑制Na/KATPase的⑶2結(jié)構(gòu)域與Src的SH2結(jié)構(gòu)域之間結(jié)合的測試組合物的方法，包括步驟 a.將測試組合物與純化的Src在容器中孵育至少5至45分鐘； b.將Na/KATPase加入容器，孵育至少5分鐘至45分鐘； c.將烏本苷加入容器，孵育至少I分鐘至45分鐘； d.將Mg2+/ATP加入容器，孵育至少O.5分鐘至45分鐘； e.進行western印跡分析確定Src激活是否受到烏本苷的誘導(dǎo)。
64.權(quán)利要求63的方法，其中的步驟a和b為各12-17分鐘，步驟c為2_7分鐘，步驟d為至少一分鐘。
65.篩選能夠抑制Na/KATPase的⑶2結(jié)構(gòu)域與Src的SH2結(jié)構(gòu)域之間結(jié)合的測試組合物的方法，包括步驟 a.將測試組合物與CD2結(jié)構(gòu)域和SH2結(jié)構(gòu)域的FRET對相接觸；以及 b.鑒定消除FRET能量的那些組合物，認為其能夠抑制⑶2/SH2相互作用。
66.權(quán)利要求65的方法，其中用Cy3標(biāo)記⑶2，而用Cy5標(biāo)記SH2。
67.權(quán)利要求65的方法,其是在96孔板中孵育的。
68.權(quán)利要求65的方法，其中FRET能量是使用分光計測量的。
全文摘要
本發(fā)明部分基于鈉/鉀三磷酸腺苷合成酶(Na/K ATPase)的新結(jié)構(gòu)構(gòu)象及功能的確證,尤其是對新的結(jié)合位點及相互作用的確證。本發(fā)明提供了Na/K ATPase及與Na/K ATPase相互作用的化合物之間的數(shù)種驚人的結(jié)構(gòu)及功能關(guān)系的應(yīng)用。這些結(jié)構(gòu)和關(guān)系的公開提供了對在化學(xué)上影響Na/K ATPase相互作用以及已知的其上游和下游的調(diào)節(jié)子的理解及解決方案。
文檔編號A61K38/10GK102811729SQ201180010298
公開日2012年12月5日 申請日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月13日
發(fā)明者謝子建, 葉琪琪, 李治川 申請人:托萊多大學(xué)