專利名稱：哇巴因在增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞敏感性中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鈉鉀ATP酶抑制 劑哇巴因在逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)靶向性抗腫瘤 藥物耐受的新用途。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是危害人類健康的重大疾病。江蘇省近幾年開(kāi)展了以惡性腫瘤為主的全 人口死因回顧性調(diào)查，結(jié)果顯示男女性第1位死因均為惡性腫瘤，其死亡率占全部死因的 27. 41 %。資料顯示，2003年江蘇省城市地區(qū)位于惡性腫瘤死亡前4位的分別是肺癌、胃癌、 肝癌、食管癌；而農(nóng)村地區(qū)為肝癌、肺癌、食管癌、胃癌。肺癌和胃癌死亡率城市明顯高于農(nóng) 村。尤其是通過(guò)分析1973至2004年幾種主要惡性腫瘤的死亡情況發(fā)現(xiàn)，肺癌死亡率大幅 上升，2004年肺癌死亡率是1973年的5. 65倍。由此可見(jiàn)，肺癌已經(jīng)成為我省惡性腫瘤數(shù)一 數(shù)二的“殺手”，嚴(yán)重威脅著我省人民的生存健康。為什么在短短的幾十年間，肺癌的發(fā)病率及死亡率有如此迅猛的發(fā)展趨勢(shì)？ 1 : 大樣品調(diào)查研究表明肺癌的主要危險(xiǎn)因素為吸煙和大氣污染，而近年來(lái)吸煙人數(shù)有增加的 趨勢(shì)，汽車尾氣和工業(yè)廢氣的大量排放，又加重了大氣環(huán)境污染的程度。因此，隨著我省經(jīng) 濟(jì)的發(fā)展，城市化、工業(yè)化進(jìn)程的加快，空氣污染將會(huì)越來(lái)越嚴(yán)重，這將不可避免地導(dǎo)致肺 癌死亡率進(jìn)一步增加。2:肺癌在早期時(shí)往往沒(méi)有明顯的癥狀，當(dāng)有癥狀被診斷出來(lái)時(shí)，常常 已經(jīng)是局部晚期或晚期無(wú)法手術(shù)切除的情形。一般而言，新診斷的肺癌僅約不到20%的病 人屬于早期可以有機(jī)會(huì)接受手術(shù)切除的病患。而另外80%的晚期肺癌病人則失去了外科手 術(shù)根治的最佳時(shí)機(jī)。3:到目前為止，對(duì)肺癌的治療，尤其是晚期肺癌病人缺乏非常有效的治 療干預(yù)手段。臨床上，肺癌通常分為小細(xì)胞與非小細(xì)胞肺癌兩種類型，總的肺癌病例中，非小細(xì) 胞肺癌(包括肺鱗癌，肺腺癌)約占80%。因此針對(duì)非小細(xì)胞肺癌的治療研究是攻克肺癌 的一項(xiàng)極其重要的課題，引起了全世界醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。如上所述，雖然手術(shù)治療是治療非小細(xì)胞肺癌的重要手段，但對(duì)絕大部分晚期肺 癌病人來(lái)說(shuō)手術(shù)治療并不能有效解決腫瘤轉(zhuǎn)移的問(wèn)題。因此對(duì)于這些晚期或已經(jīng)有遠(yuǎn)端轉(zhuǎn) 移的肺癌病人，全身性的化學(xué)治療是非小細(xì)胞肺癌多學(xué)科綜合治療的主要策略之一。尤其 是化療與手術(shù)、放射等療法綜合運(yùn)用能明顯防止癌腫轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)，提高長(zhǎng)期生存率?，F(xiàn)在，非 小細(xì)胞肺癌化療已經(jīng)初步形成共識(shí)，通常采用順鉬加泰索帝、紫杉醇、健擇、諾維本等中的 一種。根據(jù)患者的具體情況，選擇不同的組合，可以達(dá)到提高療效，降低毒性反應(yīng)的目的，特 別是出現(xiàn)了一些極具前景的新型靶向藥物，其作用機(jī)制與傳統(tǒng)化療藥物不同。傳統(tǒng)化療藥 物屬于細(xì)胞毒性藥物，是通過(guò)毒性殺死腫瘤細(xì)胞，但同時(shí)不可避免會(huì)傷害正常細(xì)胞。而靶向 藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，可以通過(guò)特異性作用于腫瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞信號(hào)途徑，抑制腫瘤細(xì)胞的 增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，不良反應(yīng)輕，患者可以很好耐受。在這些靶向藥物中，TRAIL(腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體)越來(lái)越受到人 們的關(guān)注。TRAIL是由Wiley于1995年檢索EST時(shí)首次發(fā)現(xiàn)并克隆的，是一種II型糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子家族，與相應(yīng)受體結(jié)合后，可以快速誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。但與其它凋 亡誘導(dǎo)分子顯著不同的是，TRAIL主要?dú)D(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，而正常細(xì)胞可以逃逸它的 殺傷作用。體內(nèi)研究表明，TRAIL可以明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)，甚至徹底清除腫瘤。TRAIL的這 種腫瘤細(xì)胞選擇性殺傷作用使該蛋白在抗腫瘤方面具有很強(qiáng)的開(kāi)發(fā)價(jià)值與潛力。但是值得 注意的是，并非所有的腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL都具有很強(qiáng)的敏感性。體外研究表明，有些腫瘤 細(xì)胞株對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡作用具有很強(qiáng)的耐受性。這可能與腫瘤細(xì)胞表面缺乏TRAIL受 體(DR4，DR5)，或分布有假受體(DcRl，DcR2)，或過(guò)度表達(dá)一些抗凋亡蛋白如bcl_2，F(xiàn)LIIP， survivin有關(guān)。因此TRAIL的抗腫瘤作用因不同的腫瘤類型而異。
研究表明，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，如A549對(duì)TRAIL有明顯的耐受性，但具體的機(jī)理目 前并不清楚。為了充分發(fā)揮TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇殺傷作用，有必要尋找新的策略以逆 轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株對(duì)TRAIL的敏感性，從而達(dá)到運(yùn)用TRAIL有效治療非小細(xì)胞肺癌的 目的。而作為一個(gè)理想干預(yù)手段必須具備以下特點(diǎn)1 顯著性增強(qiáng)TRAIL對(duì)非小細(xì)胞肺癌 細(xì)胞的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用；2 對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有高度的選擇性；即不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞 及機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的非特異性的毒副作用。事實(shí)上，雖然有些化療藥物能明顯逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞 肺癌細(xì)胞株A549對(duì)TRAIL的敏感性，但這些化療藥物本身對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性不夠強(qiáng)，因 此常常以造成對(duì)正常組織與細(xì)胞的損傷為代價(jià)。鈉鉀ATP酶是分布于真核生物細(xì)胞膜重要的離子轉(zhuǎn)運(yùn)泵，通過(guò)消耗ATP能量將鈉 離子與鉀離子逆濃度梯度進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而維持細(xì)胞膜內(nèi)外穩(wěn)定的鈉鉀離子濃度梯度、 細(xì)胞膜靜息電位與細(xì)胞滲透壓平衡。在興奮性細(xì)胞如神經(jīng)元細(xì)胞或心肌細(xì)胞中，鈉鉀ATP 酶與動(dòng)作電位產(chǎn)生、興奮信號(hào)傳遞密切相關(guān)。在非興奮性細(xì)胞如腎小管上皮細(xì)胞中，鈉鉀 ATP酶是腎小管對(duì)水分、鈉離子進(jìn)行重吸收、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取的關(guān)鍵蛋白，對(duì)維持機(jī)體電解質(zhì) 平衡、酸堿平衡、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)正常利用發(fā)揮至關(guān)重要的作用，鑒于此，機(jī)體平均1/3ATP能量用 于維持該泵的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。從天然植物洋地黃中提取的強(qiáng)心苷成分是鈉鉀ATP酶抑制劑與細(xì)胞膜鈉鉀ATP酶 α亞基有很強(qiáng)的親合力，結(jié)合后通過(guò)構(gòu)象改變抑制鈉鉀ATP酶對(duì)Na+，K+離子的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，具 有多種生物活性。自1785年W. Withering使用紫花洋地黃葉(Digitalis purpurea)治療 水腫以來(lái)，至今已經(jīng)在夾竹桃科、玄參科、十字花科、衛(wèi)矛科等10幾個(gè)科的100多種植物中 發(fā)現(xiàn)強(qiáng)心苷，常見(jiàn)的較重要的有洋地黃毒苷(Digitoxin)，異羥基洋地黃毒苷(Digoxin)， 夾竹桃苷(Oleandrin)，烏本苷(ouabain)等。中藥洋地黃類成分長(zhǎng)期以來(lái)一直用于治療充 血性心力衰竭及節(jié)律性障礙等心臟疾病，但同時(shí)該類成分也具有明顯的抗腫瘤效果。研究 表明，強(qiáng)心苷如digoxin，oleandrin以及ouabain能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞，如淋巴瘤細(xì)胞、前 列腺癌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡或壞死，從而具有明顯的抗腫瘤效果。強(qiáng)心苷的這種抗腫瘤作用通常認(rèn)為是由強(qiáng)心苷的細(xì)胞毒性引起的，因此人們對(duì)鈉 鉀ATP酶物質(zhì)是否能用于腫瘤治療產(chǎn)生懷疑。但是越來(lái)越多的研究表明，強(qiáng)心苷，如哇巴因 在非毒性劑量下也能顯著性抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。遵循這樣的思路，我們?cè)谇捌诘?工作中發(fā)現(xiàn)鈉鉀ATP酶抑制劑哇巴因能在非毒性劑量(20-150nM)下很顯著性地增強(qiáng)非小 細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性，從而逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的耐受性。因此本 研究發(fā)明鈉鉀ATP酶抑制劑在抗腫瘤藥物制備中的新用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鈉鉀ATP酶抑制劑在抗腫瘤藥物制備中的新用途，即作為抗腫瘤增敏劑，該增敏劑能能顯著逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL耐受性。本發(fā)明公開(kāi)了哇巴因在增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo) 配體(TRAIL)敏感性中的應(yīng)用?；谏鲜鰬?yīng)用，哇巴因可作為治療非小細(xì)胞肺癌的增敏劑，與TRAIL聯(lián)合使用用 于非小細(xì)胞肺癌的治療。哇巴因也可以與TRAIL —起制成藥物組合物，從而在制備治療非小細(xì)胞肺癌的藥 物中應(yīng)用。上述所說(shuō)的應(yīng)用中，哇巴因的劑量為(20-150nM)。本發(fā)明中經(jīng)實(shí)驗(yàn)顯示，哇巴因能顯著性提高非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞膜DR4與DR5mRNA 的表達(dá)量，上調(diào)DR4與DR5可能是哇巴因增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡的重要手段。在 毒性實(shí)驗(yàn)中顯示，在明顯誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的情況下，TRAIL+哇巴因?qū)φ＜?xì)胞無(wú)明顯的毒性。通過(guò)細(xì)胞水平與裸鼠實(shí)驗(yàn)，表明TRAIL與哇巴因的藥物組合能使非小細(xì)胞肺癌細(xì) 胞凋亡率接近90%，體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這兩種藥的組合使肺癌抑制率達(dá)到70%以 上。因此哇巴因除了具有強(qiáng)心利尿的傳統(tǒng)藥理作用外，尚能作為效果很好的抗腫瘤增敏劑。


圖1 哇巴因增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549對(duì)TRAIL的敏感性圖2 哇巴因劑量依 賴性地增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549對(duì)TRAIL的敏感性圖3 哇巴因聯(lián)用TRAIL對(duì)非小細(xì)胞 肺癌細(xì)胞A549核碎裂圖4 哇巴因聯(lián)用TRAIL對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549caSpaSe3活性激 活圖5 哇巴因選擇性增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性圖6 哇巴因上調(diào)A549細(xì) 胞表面死亡受體DR4與DR5mRNA表達(dá)水平圖7 哇巴因上調(diào)A549細(xì)胞表面死亡受體DR4與 DR5分布圖8 哇巴因與TRAIL聯(lián)用抑制裸鼠接種A549腫瘤生長(zhǎng)曲線圖9 哇巴因與TRAIL 聯(lián)合應(yīng)用抑制裸鼠接種A549腫瘤生長(zhǎng)圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料哇巴因、DAPI、PI、DEPC、Trizol購(gòu)自Sigma公司，A549非小細(xì)胞肺癌細(xì) 胞株購(gòu)自ATCC公司。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胰酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。caSpaSe3檢測(cè)試劑盒 購(gòu)自Biovision公司。EGFP-Armexin V為南京大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室表達(dá)。流 式細(xì)胞儀FACS Calibur (美國(guó)Becton Dickson公司)，DR4與DR5抗體購(gòu)自美國(guó)Milipore 公司，半干半濕法蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Biorad公司)，DNA凝膠電泳儀(南京大學(xué)電子設(shè)備 廠)。逆轉(zhuǎn)錄體系dNTP、oligo(dT)18、RNase inhibitor、逆轉(zhuǎn)錄酶、PCR試劑盒均購(gòu)自Takara 公司。瓊脂糖凝膠、EB購(gòu)自南京大治生物公司。LipOfectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。實(shí)施例一 Armexin V/PI流式細(xì)胞儀法檢測(cè)TRAIL與哇巴因聯(lián)用致A549細(xì)胞凋 亡非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549于DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2 的濕潤(rùn)無(wú)菌環(huán)境。細(xì)胞長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，用PBS洗滌2次，0.25%胰酶消化。按細(xì)胞量6X IO4/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)完全后，加入藥物分別為 TRAIL10ng/ml, TRAIL 10ng/ml+哇巴因 ΙΟΟηΜ，TRAIL 20ng/ml, TRAIL 20ng/ml+哇巴因 IOOnM, TRAIL 50ng/ml, TRAIL 50ng/ml+哇巴因 ΙΟΟηΜ，TRAIL lOOng/ml, TRAIL100ng/ml+ 哇巴因 ΙΟΟηΜ，TRAIL 200ng/ml, TRAIL 200ng/ml+哇巴因 ΙΟΟηΜ，TRAIL400ng/ml, TRAIL 400ng/ml+哇巴因ΙΟΟηΜ，每組3個(gè)孑L (圖1)，或分別為T(mén)RAIL100ng/ml+哇巴因ΙΟηΜ，哇巴 因 10nM，TRAIL 100ng/ml+哇巴因 20nM，哇巴因 20nM，TRAIL100ng/ml+哇巴因 30nM，哇巴因 30nM, TRAIL 100ng/ml+ 哇巴因 50nM，哇巴因 50nM，TRAIL100ng/ml+ 哇巴因 ΙΟΟηΜ，哇巴因 ΙΟΟηΜ，每組3個(gè)孔(圖2)。
細(xì)胞經(jīng)藥物處理12h后收集，用預(yù)冷PBS洗2遍，加入EGFP標(biāo)記的Armexin V(2 μ L)，冰上孵育20min，迅速加入PI (1 μ g/mL)，于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況， Annexin V(+)/PI(_)為早期凋亡細(xì)胞。結(jié)果采用Armexin V/PI雙染法考察A549細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性，發(fā)現(xiàn)只有在使 用TRAIL達(dá)到400ng/ml時(shí)，才使得A549細(xì)胞有輕微的細(xì)胞凋亡發(fā)生，表明該細(xì)胞對(duì)TRAIL 并不敏感(圖1)。同樣，哇巴因在使用濃度到IOOnM時(shí)，本身對(duì)腫瘤細(xì)胞具有輕微的細(xì)胞 凋亡作用(圖2)，但是兩藥的聯(lián)用能極顯著性地增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡的敏感性，從 圖1中可知，在哇巴因使用濃度為IOOnM時(shí)，TRAIL能劑量依賴性地增強(qiáng)A549細(xì)胞凋亡，在 TRAIL使用濃度達(dá)到lOOng/ml時(shí)，已經(jīng)能使細(xì)胞凋亡達(dá)到75%以上，表明TRAIL與哇巴因 組合是很有前景的藥物組合。同樣地，從圖2中可知，當(dāng)TRAIL使用濃度為lOOng/ml時(shí)，哇 巴因也能劑量性地增強(qiáng)A549細(xì)胞凋亡。實(shí)施例二熒光顯微鏡法檢測(cè)TRAIL與哇巴因聯(lián)用致A549細(xì)胞核碎裂非小細(xì)胞肺 癌細(xì)胞A549于DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2的濕潤(rùn)無(wú)菌環(huán) 境。細(xì)胞長(zhǎng)至80%-90%融合時(shí)，用PBS洗滌2次，0.25%胰酶消化。按細(xì)胞量IX IO5/孔 接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)板中預(yù)先放置滅菌過(guò)的蓋玻片面，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至60% 時(shí)，加入藥物處理，分別為對(duì)照組、TRAIL 100ng/ml, TRAIL 100ng/ml+哇巴因50nM，TRAIL lOOng/ml,TRAIL 100ng/ml+哇巴因50nM，每組重復(fù)3個(gè)孔(圖3)。處理12h后，將載玻片 取出，冷PBS洗滌2次，滴加DAPI (1 μ g/ml)數(shù)滴后于熒光顯微鏡上觀察，拍片。結(jié)果DAPI是一種常見(jiàn)的細(xì)胞核染料，能摻入到核DNA中，在激發(fā)光作用下，呈現(xiàn) 藍(lán)色核，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)(圖3)，單用哇巴因50nM與TRAILlOOng/ml時(shí)，細(xì)胞核相對(duì)完整，沒(méi) 有明顯的細(xì)胞凋亡核碎裂，但是當(dāng)TRAIL與哇巴因聯(lián)用時(shí)，細(xì)胞核破碎明顯，進(jìn)一步表明哇 巴因能增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性。實(shí)施例三TRAIL與哇巴因?qū)aspasd水解酶活性的影響非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 于DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2的濕潤(rùn)無(wú)菌環(huán)境。細(xì)胞長(zhǎng) 至80% -90%融合時(shí)，用PBS洗滌2次，0. 25%胰酶消化。按細(xì)胞量6 X IO4/孔接種于24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。加入藥物處理，分別為對(duì)照組、TRAIL100ng/ml，TRAIL 100ng/ml+哇巴因 50nM, TRAIL lOOng/ml, TRAIL 100ng/ml+ 哇巴因 50nM，每組重復(fù) 3 個(gè)孔(圖 4)。處理 12h 后，將細(xì)胞用胰酶消化后，加入FITC標(biāo)記的DEVD. fmk 1_2 μ 1，于冰上孵育30min后，PBS洗 2遍，流式細(xì)胞儀分析FITC熒光強(qiáng)度。結(jié)果當(dāng)細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)時(shí)，會(huì)引起CaSpaSe3的激活，從而使細(xì)胞中諸多蛋白 質(zhì)發(fā)生非選擇性切割，最終使細(xì)胞走向凋亡。采用流式細(xì)胞儀方法考察TRAIL與哇巴因?qū)aspase3水解酶活性的影響，底物為FITC-DEVE. fmk。其基本原理在于當(dāng)細(xì)胞內(nèi)caspase3 酶激活時(shí)，會(huì)切割FITC-DEVD. fmk，從而使細(xì)胞內(nèi)熒光能在488nm激發(fā)光激發(fā)下被檢測(cè)到 (圖4)。結(jié)果與免疫熒光相符，在單用TRAIL或哇巴因情況下，細(xì)胞內(nèi)caSpaSe3酶激活不 明顯，但是兩藥的聯(lián)用，細(xì)胞內(nèi)caspasd被激活。實(shí)施例四毒性實(shí)驗(yàn)HEK293與A549細(xì)胞分別于DMEM+10 %胎牛血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2的濕潤(rùn)無(wú)菌環(huán)境。細(xì)胞長(zhǎng)至80% -90%融合時(shí)，用PBS洗滌2次， 0.25%胰酶消化。按細(xì)胞量5X IO3/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。加入藥物TRAIL IOOng/ ml+哇巴因IOOnM處理0，8，12，24，48h，每組重復(fù)3個(gè)孔(圖5)，處 理12h后，收集細(xì)胞，按 實(shí)施例一檢測(cè)A549與HEK293細(xì)胞凋亡。結(jié)果為考察TRAIL與哇巴因的聯(lián)用增效作用是否對(duì)正常細(xì)胞具有毒性副作用。 本研究比較TRAIL100ng/ml+哇巴因(IOOnM)在正常細(xì)胞株(HEK293)及腫瘤細(xì)胞株(A549) 上的細(xì)胞毒性差異。結(jié)果見(jiàn)圖5，在明顯誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡的情況下，TRAIL+哇巴因?qū)φ?常細(xì)胞無(wú)明顯的毒性，這些數(shù)據(jù)說(shuō)明TRAIL+哇巴因?qū)δ[瘤具有明顯的選擇性，是具有開(kāi)發(fā) 前景的治療方案。實(shí)施例五哇巴因?qū)549細(xì)胞DR4與DR5mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)的影響1、細(xì)胞mRNA的 提取所有物品均提前用DEPC處理并滅菌。非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549于DMEM+10%胎牛血清 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2的濕潤(rùn)無(wú)菌環(huán)境。細(xì)胞長(zhǎng)至80% -90%融合時(shí)，用 PBS洗滌2次，0.25%胰酶消化。按細(xì)胞量1X105/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。鋪細(xì)胞 于6孔板，等細(xì)胞長(zhǎng)到80% -90%后，加藥(分別為哇巴因0，50，100，200nM)，處理12h后 收集細(xì)胞，PBS洗滌一次。加入ImL TRIZ0L，用槍吹打至細(xì)胞完全溶解，室溫放置5min。加 入200 μ L的氯仿，振蕩15s后放置2-3min，2-8°C 12000g離心15min。吸取上層，轉(zhuǎn)移到干 凈印pendorf管中，加入500μ L異丙醇，放置10min，2_8°C下12000g離心lOmin，可見(jiàn)RNA 沉淀。棄上清，加入lmL75%乙醇洗滌沉淀，7500g離心5min，在空氣中晾干RNA沉淀，加入 30 μ L DEPC處理的DDW溶解。2.、逆轉(zhuǎn)錄PCR采用20 μ L逆轉(zhuǎn)錄體系，將提取的模板RNA約1 μ g與 5Xbuffer4μ L, dNTP(IOmM)2 μ L, oligo(dT) 18(10 μ mol/L)1 μ L,RNase Inhibitorl μ L，逆 轉(zhuǎn)錄酶1 μ L混勻后30°C水浴lOmin，42°C水浴30min，98°C水浴lOmin。取等量的cDNA做模 板做 PCR 擴(kuò)增，采用 20 μ L PCR 反應(yīng)體系:DDW15. 2 μ L, IOXTaq buffer2. 5 μ L, dNTP2 μ L, Mg2+2 μ L，上游引物 1 μ L，下游引物 1 μ L，cDNA 模板 1 μ L，Taq polymeraseO. 3 μ L。PCR 條 件94°C熱變性4min后；94°C變性40s，55°C退火40s，72°C延伸40s (循環(huán)數(shù)為20-45個(gè))； 最后72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，EB顯色。3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜DR4與DR5分布非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549于DMEM+10%胎 牛血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C，5% CO2的濕潤(rùn)無(wú)菌環(huán)境。細(xì)胞長(zhǎng)至80% -90%融 合時(shí)，用PBS洗滌2次，0. 25%胰酶消化。按細(xì)胞量IX 105/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。 收集藥物處理后細(xì)胞，PBS洗滌2遍后，加入含2% BSA的PBS預(yù)包被30min后，洗滌，加入 4μ 1 DR4或DR5抗體，孵育Ih后，洗滌，加入FITC標(biāo)記二抗孵育lh，PBS洗滌2次后，加入 1 μ g/ml PI后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞FITC的熒光強(qiáng)度。結(jié)果TRAIL死亡受體是決定腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL是否有敏感性的重要因素，本研究 發(fā)現(xiàn)哇巴因能顯著性提高A549細(xì)胞內(nèi)DR4與DR5mRNA的表達(dá)量(圖6)。對(duì)細(xì)胞膜DR4與DR5包被特異性抗體及FITC標(biāo)記的二抗后，流式細(xì)胞儀技術(shù)分析細(xì)胞膜DR4與DR5的表達(dá)情況(圖7)，結(jié)果顯示哇巴因能顯著性增加細(xì)胞膜表面DR4與DR5的分布。
實(shí)施例六哇巴因聯(lián)用TRAIL用藥的體內(nèi)抗腫瘤作用取指數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞，經(jīng) 胰酶消化后，用PBS洗2遍。將每只100 μ LlO7個(gè)Α549細(xì)胞皮下注射到7周齡的裸鼠右側(cè) 背部皮下，一周后形成原位腫瘤，將小鼠分成4組，每組8只。然后開(kāi)始治療，分別用PBS、 哇巴因2 μ g/只、TRAILlOOyg/只、哇巴因/TRAIL聯(lián)合治療組進(jìn)行裸鼠腹腔注射，每天注 射一次，共治療15次。從開(kāi)始治療后每三天測(cè)量腫瘤大小，并按下列公式計(jì)算腫瘤體積 0. 5236 X Ll X (L2)2，其中Ll為腫瘤長(zhǎng)軸，L2為腫瘤短軸。開(kāi)始治療后第25天，處死小鼠， 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果接種A549細(xì)胞于裸鼠形成人源肺癌實(shí)體瘤，由于正常情況下，A549 低表達(dá)TRAIL受體DR4與DR5，對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡作用具有很強(qiáng)的抵抗性，所以單用TRAIL 抗腫瘤效果并不顯著。而通過(guò)TRAIL與哇巴因聯(lián)合治療異體接種A549負(fù)瘤裸鼠，顯示出明 顯的治療效果，腫瘤體積顯著小于其他三組(圖8，9)。
權(quán)利要求
哇巴因在增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體敏感性中的應(yīng)用。
2.哇巴因作為治療非小細(xì)胞肺癌的增敏劑。
3.哇巴因在制備治療非小細(xì)胞肺癌的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及鈉鉀ATP酶抑制劑哇巴因在逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)靶向性抗腫瘤藥物耐受的新用途。具體是哇巴因可作為治療非小細(xì)胞肺癌的增敏劑，與TRAIL聯(lián)合使用用于非小細(xì)胞肺癌的治療。
文檔編號(hào)A61K38/17GK101869574SQ201010235528
公開(kāi)日2010年10月27日 申請(qǐng)日期2010年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月24日
發(fā)明者馮速, 華子春, 殷武 申請(qǐng)人:南京大學(xué)