專利名稱：用于治療腎細(xì)胞癌的化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療疾病的藥物。更具體地，本發(fā)明涉及用于治療腎細(xì)胞癌的組合物，所述組合物包括含光神霉素(mithramycin)的組合物,所述腎細(xì)胞癌包括透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、希佩爾-林道(Von Hippel-Lindau)病或Birt-Hogg_Dub6綜合癥。本發(fā)明還涉及光神霉素用于制備治療腎細(xì)胞癌的藥物的用途。
背景技術(shù)：
光神霉素(也稱為金霉酸、普卡霉素(plicamycin)或光輝霉素(mitramycin))是由鏈霉菌屬的各種土壤細(xì)菌產(chǎn)生的一種金霉酸型聚酮抗生素。光神霉素具有化學(xué)式 測(cè)
QB光神霉素已經(jīng)用于治療骨轉(zhuǎn)移患者的聞I丐血癥、佩吉特氏(Paget)癥、辜丸癌和白血病的靶向治療(Yuan等，Cancer 2007，110 :2682_2690)。光神霉素還顯示出具有作為用于緩和與P-地中海貧血和錸狀細(xì)胞貧血癥相關(guān)的癥狀的神經(jīng)保護(hù)藥物的潛力。光神霉素結(jié)合到DNA的小溝中富含GC的區(qū)域，并抑制了具有富含GC啟動(dòng)子的基因轉(zhuǎn)錄。因此光神霉素通過(guò)結(jié)合到這些位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子，例如Spl家族，的調(diào)節(jié)抑制的基因轉(zhuǎn)錄。已經(jīng)證明Spl參與調(diào)節(jié)血管生成刺激物血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，且已經(jīng)有報(bào)導(dǎo)光神霉素用于抑制動(dòng)物的血管增生。腎細(xì)胞癌(RCC)占所有癌癥的2 3%，且為成人中腎臟癌癥的最常見的類型。盡管常規(guī)的透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(ccRCC)占RCC病例的超過(guò)75%，但是RCC為具有多種組織病理亞型的異質(zhì)性障礙。RCC的非透明細(xì)胞形式包括乳突(或易染)RCC、難染細(xì)胞腫瘤、嗜酸粒細(xì)胞瘤、集尿管癌和罕見的髓樣癌。外科切除是目前首選的用于局部限制RCC的治療，且通常在RCC較早階段可以達(dá)到治愈。傳統(tǒng)上認(rèn)為RCC對(duì)放射療法具有很大耐藥性，并且體外研究已經(jīng)顯示腎臟癌細(xì)胞是人類細(xì)胞類型中最不放射敏感的細(xì)胞之一。并且，已經(jīng)證明多數(shù)晩期RCC腫瘤對(duì)細(xì)胞毒素試劑具有耐藥性，因此化療在轉(zhuǎn)移的腎臟癌癥治療中的作用非常有限。RCC的大多數(shù)病例為偶發(fā)的，且所有病例的僅約3%具有遺傳原因。然而，針對(duì)RCC的罕見遺傳形式的研究已經(jīng)提供了關(guān)于家族性和偶發(fā)性RCC的在分子發(fā)病機(jī)理的有重大影響的觀點(diǎn)。希佩爾-林道(VHL)病為顯性遺傳的多系統(tǒng)家族性癌癥綜合癥，表征為透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌(ccRCC)的生長(zhǎng)以及成血管細(xì)胞瘤、胰腺損害和嗜鉻細(xì)胞瘤。VHL為遺傳性RCC的最常見原因。對(duì)VHL病的基因鑒定已經(jīng)使人們認(rèn)識(shí)到在偶發(fā)性ccRCC的進(jìn)化中最頻發(fā)的遺傳事件是VHL腫瘤抑制基因(TSG)的體細(xì)胞失活。進(jìn)ー步的工作已經(jīng)使人們理解了 VHL TSG失活導(dǎo)致了 HIF-I和HIF-2轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)異常和缺氧-應(yīng)答基因通路的激活(Latif等，Science 1994,260 1317-20 ；Foster 等，Cancer 1994,69 :230-4 ；Gnarra 等，Nat Genet1994,7 :85-90 ；Clifford 等，Genes Chromosomes Cancer 1998,22 :200-9 ；Maxwell 等，Nature 399 :271-275,1999 ；Banks 等，Cancer Res 2006,66 :2000_7)。目前已知在含氧量正常的條件下，VHL腫瘤抑制基因產(chǎn)物，pVHL，在泛素連接酶復(fù) 合體中發(fā)揮作用，該泛素連接酶復(fù)合體靶向?yàn)樵诘鞍酌阁w中用于破壞的缺氧-應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子亞基(HIF-Ia和HIF-2a)。VHL失活導(dǎo)致了 HIF-I和HIF-2的水平提高，引起了關(guān)于生長(zhǎng)和血管增生的靶基因，例如VEGF和TOGF的過(guò)表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)已經(jīng)提供了如索拉非尼(sorafenib)和舒尼替尼(sunitinib) (HIF靶基因通路的抑制劑)等藥物在轉(zhuǎn)移的RCC治療中的用途的理論依據(jù)(Patel等，Br JCancer. 2006,94:614-9 ;Motzer 等，J Clin Oncol. 2009，27 :3584_90)。Birt-Hogg-Dube (BHD)綜合癥為與RCC敏感性有關(guān)的另一種顯性遺傳的家族性癌癥綜合癥。BHD還與良性皮膚纖維毛囊瘤(毛囊的錯(cuò)構(gòu)瘤)、多發(fā)肺囊腫和自發(fā)氣胸相關(guān)(Toro等，J. Med. Genet. 2008,45 :321-331 )。BHD-相關(guān)的腎臟腫瘤具有各種的組織病理，但通常為難染RCC/嗜酸粒細(xì)胞腺瘤。BHD綜合癥由雌酮(FLCN)基因中失活突變引起(Nickerson等，Cancer Cell2002,2 :157-164 ;Schmidt 等，Am J Hum Genet. 2005,76 :1023-33 ;Lim等，Hum Mutat. 2010Jan 31(1) :E1043-51)，且來(lái)自BHD患者的腎臟腫瘤表明了體細(xì)胞FLCN的缺失。FLCN基因產(chǎn)物的精確功能仍然正在被闡明，但已經(jīng)將雌酮(和雌酮相互作用蛋白FNIPl和FNIP2)與 mTOR 和 AMPK 信號(hào)通路相聯(lián)系(Baba 等，Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 2006，103 15552-15557 ；Hasumi 等，Gene 2008，415 :60-7 ；Takagi 等，0ncogene2008, 27 :5339_47)。在具有腎臟-靶向的Flcn基因純合性失活的小鼠中，腎臟腫瘤和囊腫隨著mTOR的激活而發(fā)展，并且mTOR抑制劑鈉巴霉素(rapamycin)減少了腎臟病變，并提高了存活率(Baba等，J. Natl. Cancer Inst. 2008，100 :140-154 ;Chen 等，PloS ONE 2008，33 :e3581 )。mTOR 抑制劑藥物(例如Temsirolimus、Everolimus等)已經(jīng)顯示了治療轉(zhuǎn)移RCC的希望(Molina和Motzer Clin Genitourin Cancer 2008Dec,6Suppl I :S7_13)。通常提供BHD綜合癥的患者的腎臟影像以便進(jìn)行RCC的早期檢測(cè)。然而，ー些患者可能僅在患有晩期RCC之后才得到診斷。對(duì)于家族性的和偶發(fā)性的病例來(lái)說(shuō)轉(zhuǎn)移的RCC的治療都具有挑戰(zhàn)性。盡管偶有患者可以對(duì)用細(xì)胞因子干擾素和白細(xì)胞介素-2的免疫療法有反應(yīng)，但是最近以針對(duì)HIF下游祀點(diǎn)(例如舒尼替尼(Sunitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、貝伐珠單抗(Bevacizumab)等)，和mTOR通路(例如Temsirolimus、依維莫司(Eveix)Iimus))的靶向治療已經(jīng)成為最頻繁的處理對(duì)策。然而，這些制劑，盡管延長(zhǎng)了生命，但不是細(xì)胞毒性的，因此靶向細(xì)胞毒性制劑的鑒定將會(huì)是重大的進(jìn)展。色霉素A3(ChA3)(—種金霉酸化合物)已經(jīng)被鑒定為HIF-依賴的細(xì)胞毒素。ChA3顯示了區(qū)別地殺死ccRCC細(xì)胞系中的VHL-缺陷細(xì)胞(Sutphin等，Cancer Res2007，67 (12)，5896-5902)。已經(jīng)顯示在VHL-陽(yáng)性透明細(xì)胞RCC細(xì)胞系中HIF_2a的過(guò)表達(dá)表型模擬了VHL失活對(duì)于ChA3毒性敏感性的影響。然而，ChA3在FLCN-缺陷的和FLCN-野生型的細(xì)胞系中沒有顯示出差別生長(zhǎng)抑制活性，暗示了其不可能對(duì)BHD綜合癥的藥物治療有用。因此，有需要克服以上討論的缺陷的對(duì)腎細(xì)胞癌的治療。而且，有需要以FLCN基因缺陷的細(xì)胞和與該缺陷相關(guān)的缺陷為靶點(diǎn)的治療。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種用于治療腎細(xì)胞癌的組合物，所述組合物包括光神霉素 或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。具體地，所述組合物適于在治療透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中使用。所述組合物在與希佩爾-林道病或Birt-Hogg_Dub6綜合癥相關(guān)的腎細(xì)胞癌的治療中特別有用。 本發(fā)明還提供了ー種用作抗FLCN無(wú)效(FLCN-nulI)或VHL無(wú)效(VHL-nulI)的腎細(xì)胞癌的細(xì)胞的細(xì)胞毒劑的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。細(xì)胞毒劑為對(duì)細(xì)胞有毒，且可導(dǎo)致細(xì)胞各種結(jié)果的制劑。細(xì)胞可能會(huì)停止活性生長(zhǎng)和分裂，或可能經(jīng)歷壞死，或者細(xì)胞可能經(jīng)歷程序性細(xì)胞死亡(細(xì)胞凋亡)。經(jīng)歷壞死的細(xì)胞失去了細(xì)胞膜完整性，表現(xiàn)出快速膨脹，停止新陳代謝井向其周圍釋放細(xì)胞內(nèi)含物。細(xì)胞凋亡的過(guò)程為ー種有序的事件，表征為折射率的變化、細(xì)胞質(zhì)收縮、細(xì)胞核凝結(jié)和DNA裂解。凋亡的細(xì)胞停止新陳代謝，失去細(xì)胞膜完整性并裂解。本發(fā)明還提供了一種用于抑制FLCN無(wú)效的腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。本發(fā)明還提供了一種用于抑制VHL無(wú)效的腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。術(shù)語(yǔ)“抑制”意味著減少、減緩或阻止。因此，本發(fā)明的化合物可以減少、減緩或阻止腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。如此處所使用的，“生長(zhǎng)”意味著尺寸増加或増殖或兩者皆有。因此本發(fā)明的化合物可以抑制腫瘤細(xì)胞變得更大和/或可以防止腫瘤細(xì)胞分裂和復(fù)制，并防止腫瘤細(xì)胞的數(shù)量増加。細(xì)胞可以在體外?；蛘?，細(xì)胞可以在體內(nèi)并可以在受試者中發(fā)現(xiàn)。細(xì)胞可以來(lái)自于任何生物體，包括但不限于細(xì)菌。本發(fā)明還提供了ー種用于誘導(dǎo)FLCN無(wú)效的腎細(xì)胞癌的細(xì)胞死亡的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。本發(fā)明還提供了ー種用于誘導(dǎo)VHL無(wú)效的腎細(xì)胞癌的細(xì)胞死亡的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。本發(fā)明還提供了一種用于治療與FLCN失活相關(guān)的腎細(xì)胞癌的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。
本發(fā)明還提供了ー種用于治療FLCN失活相關(guān)的腎細(xì)胞癌的組合物，所述組合物包括長(zhǎng)春新堿或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。本發(fā)明還提供了一種用于治療與FLCN失活相關(guān)的腎細(xì)胞癌的組合物，所述組合物包括紫杉醇(taxol)或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。本發(fā)明還提供了一種用于治療與FLCN失活相關(guān)的腎細(xì)胞癌的組合物，所述組合物包括葉下珠甙或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。
基因可能由基因突變而失活。突變可包括點(diǎn)突變(變換或顛換)、插入或缺失。點(diǎn)突變可以為沉默突變(編碼相同的氨基酸)、錯(cuò)義突變(編碼不同的氨基酸)或無(wú)義突變(編碼終止子)。插入可以改變mRNA的剪切或引起改變基因產(chǎn)物的移碼。缺失也可以改變讀碼框從而影響基因產(chǎn)物。在更大范圍，染色體結(jié)構(gòu)中的突變可以包括擴(kuò)增或基因復(fù)制、染色體區(qū)域的缺失、染色體易位、中間缺失和染色體倒位。本發(fā)明還提供了一種用于治療與VHL失活相關(guān)的腎細(xì)胞癌的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。本發(fā)明還提供了ー種超過(guò)對(duì)FLCN-野生型細(xì)胞的對(duì)FLCN無(wú)效細(xì)胞的差別生長(zhǎng)抑制的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。優(yōu)選地，所述組合物包括光神霉素或其治療上有效的衍生物或代謝物。優(yōu)選地，所述組合進(jìn)ー步包括鈉巴霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。所述組合還可包括鈉巴霉素治療上有效的衍生物或代謝物。本發(fā)明還提供了光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物用于制備治療腎細(xì)胞癌的藥物的用途。具體地，本發(fā)明提供了光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物用于制備治療腎細(xì)胞癌的藥物的用途。本發(fā)明還提供了光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物用于制備治療VonHippel-Lindau病或Birt_Hogg-Dub6綜合癥的藥物的用途。本發(fā)明還提供了一種治療腎細(xì)胞癌的方法，所述方法包括向受試者給藥包含光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物的組合物。本發(fā)明還提供了一種治療腎細(xì)胞癌的方法，所述方法包括向受試者給藥包含紫杉醇(taxol )、葉下珠甙或長(zhǎng)春新堿的組合物。本發(fā)明還提供了一種治療腎細(xì)胞癌的方法，所述方法包括向受試者給藥組合物，所述組合物包含光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，并且所述組合物進(jìn)ー步包含鈉巴霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。所述“受試者”可以包括家養(yǎng)的動(dòng)物，例如貓、狗等，家畜類(例如牛、馬、豬、綿羊、山羊等)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠等)和禽類。優(yōu)選地，所述受試者為哺乳動(dòng)物，例如靈長(zhǎng)類，更優(yōu)選為人。所述組合物可以進(jìn)一歩包括藥學(xué)上可接受的載體。所述組合物以有效地治療受試者中腎細(xì)胞癌的量適當(dāng)?shù)亟o藥。通常，化合物的“有效量”為需要達(dá)到ー個(gè)或多個(gè)期望結(jié)果的量。包括本發(fā)明化合物的組合物可以通過(guò)數(shù)個(gè)給藥途徑的任何ー個(gè)向受試者給藥,包括，例如ロ服(例如以水性或非水性溶液或懸浮液，片劑、丸剤、粉劑、顆粒劑、糊劑的方式進(jìn)行灌服而應(yīng)用于口腔)，舌下給藥、肛門給藥、直腸給藥或陰道給藥(例如以陰道環(huán)、乳劑或泡沫劑方式)，胃腸外給藥(包括例如滅菌溶液或懸浮液的肌肉、靜脈、皮下或鞘內(nèi)給藥)，鼻部給藥，腹膜內(nèi)給藥，皮下給藥，經(jīng)皮給藥(例如以貼劑方式應(yīng)用于皮膚)，或局部地(例如以霜?jiǎng)?、藥膏或噴霧應(yīng)用于皮膚)。所述化合物還可以配制為吸入劑。具體地，本發(fā)明提供了一種治療透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的方法，所述方法包括向受試者給藥包括光神霉素的組合物。本發(fā)明還提供了一種治療透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的方法，所述方法包括向受試者給藥組合物，所述組合物包含光神霉素，并進(jìn)一歩包括鈉巴霉素。本發(fā)明還提供了一種治療與希佩爾-林道病或Birt-Hogg_Dub6綜合癥相關(guān)的腎細(xì)胞癌的方法，所述方法包括向受試者給藥包含光神霉素的組合物。本發(fā)明還提供了ー種治療與希佩爾-林道病或Birt-Hogg-Dub6綜合癥相關(guān)的腎細(xì)胞癌的方法，所述方法包括向受試者給藥組合物，所述組合物包含光神霉素，所述組合物進(jìn)ー步包含鈉巴霉素。
本發(fā)明還提供了ー種抑制FLCN無(wú)效的腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法，所述方法包括向受試者給藥包含光神霉素的組合物。本發(fā)明還提供了ー種抑制VHL無(wú)效的腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法，所述方法包括向受試者給藥包含光神霉素和鈉巴霉素的組合物。本發(fā)明還提供了ー種抑制VHL無(wú)效的腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法，所述方法包括向受試者給藥包含光神霉素的組合物。本發(fā)明還提供了ー種抑制VHL無(wú)效的腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的方法，所述方法包括向受試者給藥包含光神霉素和鈉巴霉素的組合物。本發(fā)明還提供了ー種超過(guò)對(duì)FLCN-野生型細(xì)胞的對(duì)FLCN無(wú)效細(xì)胞生長(zhǎng)的差別抑制的方法，所述方法包括給藥包含光神霉素的組合物。本發(fā)明還提供了ー種超過(guò)對(duì)FLCN-野生型細(xì)胞的對(duì)FLCN無(wú)效細(xì)胞生長(zhǎng)的差別抑制的方法，所述方法包括給藥包含光神霉素和鈉巴霉素的組合物。盡管ChA3顯示了有區(qū)別地殺死ccRCC細(xì)胞系中的VHL-缺乏細(xì)胞，但是我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ChA3在FLCN-缺乏的和FLCN-野生型的細(xì)胞系中沒有顯示出差別生長(zhǎng)抑制活性。我們沒有發(fā)現(xiàn)色霉素A3 (ChA3)對(duì)于FLCN缺乏的細(xì)胞和FLCN陽(yáng)性的細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性的任何差別。然而，已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)光神霉素證明了其對(duì)超過(guò)對(duì)FLCN-野生型細(xì)胞的對(duì)FLCN無(wú)效的細(xì)胞的選擇敏感性。光神霉素顯示了在FLCN無(wú)效的細(xì)胞和FLCN-野生型細(xì)胞之間GI5tl值大約10倍的差別(即，用于FLCN-野生型細(xì)胞的光神霉素的GI5tl是用于FLCN無(wú)效的細(xì)胞的光神霉素的GI5tl的大約10倍)，優(yōu)選地，光神霉素以劑量依賴方式誘導(dǎo)了 FLCN無(wú)效的細(xì)胞中的細(xì)胞凋亡蛋白酶3/7 (caSpaSe3/7)的活性。光神霉素對(duì)于FLCN無(wú)效的細(xì)胞的毒性是對(duì)野生型FLCN表達(dá)細(xì)胞的毒性的約10倍。還令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，根據(jù)等基因(isogenic)的VHL無(wú)效和VHL-表達(dá)RCC細(xì)胞系中的VHL狀態(tài)，光神霉素顯示出差別生長(zhǎng)抑制活性。光神霉素的活性與ChA3相反，我們沒有發(fā)現(xiàn)在FLCN缺乏的細(xì)胞系和FLCN陽(yáng)性的細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制活性之間ChA3的活性的任何差別。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)光神霉素顯示其超過(guò)對(duì)FLCN-野生型細(xì)胞的對(duì)于FLCN無(wú)效的細(xì)胞的選擇細(xì)胞毒素活性。因此，光神霉素展現(xiàn)出對(duì)RCC的治療，特別是作為對(duì)于FLCN-缺乏的RCC和VHL-缺乏的RCC的基因型選擇治療。此外，還令人驚奇地發(fā)現(xiàn)紫杉醇(taxol)顯示了在U0K257VHL無(wú)效的細(xì)胞和U0K257FLCN-野生型細(xì)胞之間GI5tl值有幾乎7倍的差別。葉下珠甙和長(zhǎng)春新堿都顯示了在U0K257VHL無(wú)效的細(xì)胞和U0K257FLCN-野生型細(xì)胞之間GI5tl值有大約2倍的差別(見表I)。這說(shuō)明紫杉醇、葉下珠甙和長(zhǎng)春新堿都展現(xiàn)出對(duì)與FLCN失活相關(guān)的腎細(xì)胞癌的治療。


現(xiàn)將通過(guò)結(jié)合附圖的實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，其中圖IA顯示了由SRB檢測(cè)測(cè)定的6種化合物對(duì)于U0K257-FLCN-陰性細(xì)胞和U0K257-FLCN-陽(yáng)性細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。圖IB顯示了 U0K257-FLCN陰性細(xì)胞和U0K257-FLCN陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)于15種化合物的GI50的比例。圖2A顯示了 U0K257-FLCN陰性細(xì)胞和U0K257-FLCN陽(yáng)性細(xì)胞對(duì)于6種化合物的 細(xì)胞凋亡蛋白酶3/7活性的比例。圖2B顯示了 U0K257-FLCN-陰性細(xì)胞和U0K257-FLCN-陽(yáng)性細(xì)胞在響應(yīng)于藥物暴露時(shí)的細(xì)胞存活比例。圖2C顯示了具有和不具有FLCN表達(dá)的UOK細(xì)胞響應(yīng)于光神霉素暴露時(shí)細(xì)胞蛋白表達(dá)。圖3顯示了在U0K257-FLCN-陰性細(xì)胞和U0K257-FLCN-陽(yáng)性細(xì)胞中由克隆形成檢驗(yàn)測(cè)量的光神霉素的細(xì)胞毒性。圖4顯示了由光神霉素對(duì)786-0細(xì)胞和FTC-133細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的GI5tl值。圖5顯示了通過(guò)SRB檢驗(yàn)測(cè)定的在對(duì)單獨(dú)的光神霉素暴露和光神霉素結(jié)合鈉巴霉素暴露的響應(yīng)中U0K257-FLCN-和U0K257-FLCN+細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。圖6顯示了具有和不具有FLCN表達(dá)的UOK細(xì)胞和FTC細(xì)胞中細(xì)胞蛋白表達(dá)的基礎(chǔ)水平。圖7顯示了在單獨(dú)的光神霉素和在光神霉素結(jié)合鈉巴霉素中培養(yǎng)的U0K-257細(xì)胞和UOK-FLCN細(xì)胞比較的不成對(duì)t-檢驗(yàn)。
具體實(shí)施例方式我們進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)以證明在FLCN失活和VHL失活的RCC細(xì)胞系中光神霉素的基因型選擇細(xì)胞毒性，并將其與其他可能的抗癌試劑做了比較。材料由 Developmental Therapeutics Program of the National Cancer Institute(NCI) / NIH (http://dtp. nci. nih. gov)提供嗎啉代-ADR (NSC 354646)、氰基嗎啉代-ADR(NSC 357704)、棘霉素(NSC 13502)、色霉素 A3 (NSC 58514)、鴉膽丁(NSC67574)、長(zhǎng)春新堿硫酸鹽(NSC 165563)、代代寧 B (NSC 325319)、紫杉醇(Taxol，NSC 125973)、光神霉素(NSC24559)、葉下珠甙(NSC 266492)、鹽酸比生群(NSC 337766)、多柔比星(亞德里亞霉素、NSC123127)、VM-26 (替尼泊苷，NSC 122819)、美諾立爾(NSC 269148)、N，N-ニ苯基道諾霉素(NSC 268242)、和鈉巴霉素(NSC 226080)。細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)由 Marston Linehan 博士 和 Laura S Schmidt 博士(Urologic OncologyBranch,Centre for Cancer Research,National Cancer Institute,NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD 20892, USA)提供源于 BHD 的人類腎癌細(xì)胞UOK-257 (U0K-FLCNつ和 FLCN 感染的 U0K-257 細(xì)胞 UOK-FLCN+ (Yang 等，Cancer GenetCytogenet. 2008Jan 15,180(2) :100_9)。U0K-257 是源自 BHD 患者的唯一的 RCC 細(xì)胞系，并具有種系FLCN移碼突變(c. 1285dupC)(在沒有無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解下，預(yù)料導(dǎo)致了過(guò)早的蛋白截?cái)?P. His429ProfsX27) (Yang 等，Cancer Genet Cytogenet. 2008Jan 15,180(2) 100-9)0我們沒有察覺到任何具有純合FLCN失活的偶發(fā)RCC細(xì)胞系。FTC-133細(xì)胞購(gòu)自ECACC (Salisbury, United Kingdom)。這些細(xì)胞是源自人類甲狀腺癌的非RCC細(xì)胞系。786-0 細(xì)胞來(lái)自作者的實(shí)驗(yàn)室(Clifford 等，Hum Mol Genet. 200 IMay 1,10(10)1029-38)。786-0為具有失活的VHL基因突變的腎臟癌細(xì)胞系(c. 311delG p. G104fs*55)。除了 FTC-133細(xì)胞在有DMEM和Henson (1:1)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)以外，所有細(xì)胞系都是在添加10%的胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)。生長(zhǎng)抑制檢測(cè)如Lu 等(Clin Cancer Res. 2001:7:2114-23)描述，利用磺酰羅丹明 B 檢驗(yàn)(SRB) 測(cè)定了細(xì)胞系對(duì)于藥物-誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的敏感性。簡(jiǎn)而言之，將附著的指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞以3-5 X IO3細(xì)胞數(shù)/100 u L/孔接種于96-孔板中。在37°C下20 24h后，如結(jié)果部分所示，將藥物以合適的藥物濃度加入到孔中(最終DMSO濃度1%)。藥物處理72小時(shí)后，通過(guò)加入等體積的卡諾依固定液(甲醇こ酸=3:1)將細(xì)胞原位固定，洗滌，風(fēng)干并用磺酰羅丹明 B (0. 4%, Sigma-Aldrich, Poole, United Kingdom)染色。在 Victor X3 多標(biāo)記板讀數(shù)器上(Multilabel Plate Reader) (PerkinElmor, Beaconsfield, United Kingdom)在 570nm處測(cè)量每孔的吸光度。細(xì)胞凋亡蛋白酶ーGIo 3/7檢驗(yàn)和細(xì)胞存活檢驗(yàn)按照生產(chǎn)者的說(shuō)明書，由細(xì)胞凋亡蛋白酶一 GIo 3/7檢驗(yàn)(Promega, Southampton, United Kingdom)測(cè)定了暴露于化合物后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡蛋白酶3/7活化的能力。如在生長(zhǎng)抑制檢驗(yàn)中說(shuō)明，接種細(xì)胞井向細(xì)胞給藥。在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，去除了 70 ii L培養(yǎng)基，并向剩余的培養(yǎng)基加入30 ii L檢驗(yàn)試劑。在室溫下又進(jìn)行了另外ー小時(shí)培養(yǎng)并同時(shí)震蕩。在Victor X3多標(biāo)記板讀數(shù)器中(PerkinElmer, Beaconsfield, UnitedKingdom)測(cè)定合成發(fā)光。按照生產(chǎn)者的說(shuō)明書，由CellTiter-藍(lán)細(xì)胞活力檢驗(yàn)(Blue CellViability Assay) (Promega, Southampton, the United Kingdom)測(cè)定了暴露于化合物后的細(xì)胞活力。在藥物處理最后，20 u L試劑加入到96孔的培養(yǎng)基中，并另外培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)。在 Victor X3 多標(biāo)記板讀數(shù)器中(PerkinElmer, Beaconsfield, United Kingdom)設(shè)定570nm激發(fā)和590nm發(fā)射的熒光測(cè)量了細(xì)胞活力?？寺⌒纬杉?xì)胞生存檢驗(yàn)在具有/不具有FLCN表達(dá)的U0K-257細(xì)胞中測(cè)定了光神霉素的細(xì)胞毒性。將指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞以250至IX IO5個(gè)細(xì)胞/皿的密度接種于IOOmm培養(yǎng)皿中，藥物暴露后，將細(xì)胞接種密度調(diào)整為估計(jì)的10 300菌落/皿。使細(xì)胞附著24h，并將新制的光神霉素以合適的濃度加入到培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基中DMSO的最終濃度為1%。對(duì)每個(gè)藥物濃度使用四個(gè)具有兩個(gè)接種密度的培養(yǎng)皿，且在每個(gè)設(shè)定條件下進(jìn)行了至少三個(gè)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞暴露于光神霉素72小時(shí)，此后將培養(yǎng)基吸出，用溫的PBS洗滌培養(yǎng)皿一次，然后加入新鮮的無(wú)藥物的培養(yǎng)基。將細(xì)胞另外培養(yǎng)1(T16天，直到明顯的菌落出現(xiàn)，用卡諾依固定液(甲醇こ酸=3:1)固定該菌落，并通過(guò)在磺酰羅丹明B (0.4%)中將細(xì)胞染色而使該菌落可見。計(jì)算大于30個(gè)細(xì)胞的菌落。未經(jīng)處理的細(xì)胞的克隆效率為UOK257-FLCN-26%，和UOK257-FLCN+34%。藥物暴露后的細(xì)胞活力表示為％控制克隆效率或存活。蛋白質(zhì)印跡分析按照標(biāo)準(zhǔn)程序，利用處理后48h的全細(xì)胞提取物測(cè)定響應(yīng)于藥物暴露時(shí)具有/不具有FLCN表達(dá)的UOK細(xì)胞中的細(xì)胞蛋白表達(dá)。按照生產(chǎn)者的說(shuō)明(Bio-RadLaboratories Ltd, Hertfordshire, United Kingdom),利用 DC 蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。每個(gè)樣品的20 ii g的蛋白在12. 5% (w / v) SDS-PAGE凝膠中電泳，并電轉(zhuǎn)移至1J硝酸纖維素膜上(Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd. , Buckinghamshire, UnitedKingdom) o 使用抗 FLCN 的抗體(Arnim Pause 教授的贈(zèng)品，Rosalind and MorrisGoodman Cancer Centre Montreal, Canada)、細(xì)胞凋亡蛋白酶 3 (Cell SignallingTechnology, Hertfordshire, United Kingdom)ネロ 肌胡蛋白(Sigma-Aldrich Company Ltd. , Dorset, United Kingdom)。カロ入鼠抗 IgG-HRP 偶聯(lián)物(DAK0, Ely, United Kingdom)后，利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL+Plus，Amersham)系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)。細(xì)胞周期分析將具有/不具有FLCN表達(dá)的U0K-257細(xì)胞按每孔2，000個(gè)細(xì)胞接種于具有0. 1%的DMSO或lnmol/L的鈉巴霉素的96-孔板中，并在37°C /5%的C02培養(yǎng)過(guò)夜以使其附著。如結(jié)果部分表明，將藥物以合適的濃度加入到8個(gè)復(fù)制的孔中。在最后期間，小心移除培養(yǎng)基，并在85%的冰-預(yù)冷こ醇中固定細(xì)胞。去除こ醇后，在37°C的暗室中，在含0. 1%的Triton X-IOOUOOmg / mL的RNase A和IOmg / mL的碘化丙啶(PI)的PBS緩沖液中培養(yǎng)細(xì)胞20分鐘。隨后利用Acumen eX3細(xì)胞計(jì)數(shù)器(TTP LabTech)掃描96-孔板。結(jié)果基于在NCI-60板上的FLCN表達(dá)模式用COMPARE算法鑒定候選藥物NCI在1990年創(chuàng)造了組織引導(dǎo)的抗癌藥物篩選，以評(píng)估化合物的抗腫瘤活性的。建立了由來(lái)自9種不同組織型的60個(gè)腫瘤細(xì)胞系組成的細(xì)胞系板NCI60。重要地是，考慮到與具體分子改變相關(guān)的藥物活性分析，這60個(gè)細(xì)胞系包括分子缺陷譜。這些細(xì)胞系的一系列屬性得到了深入地表征，包括微列基因表達(dá)譜和體外藥物敏感性(例如已經(jīng)用>14，000種化合物對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行了細(xì)胞毒性敏感性篩選)(參見NCI Developmental TherapeuticProgram, http: / / dtp.nci.nih.gov)。為了鑒別可能以不同水平的FLCN表達(dá)差別地影響癌細(xì)胞系的候選抗癌試劑，根據(jù)公布的微陣列數(shù)據(jù)將細(xì)胞系分類為高、中或低FLCN表達(dá)子，并用COMPARE算法(Ross等，Nat Genet 2000，24 :227-35)分析。這些FLCN表達(dá)類型被用于構(gòu)建理論藥物活性模式或種子模式，能反應(yīng)以FLCN缺乏的細(xì)胞為靶點(diǎn)的藥物，或更具體地是以FLCN低表達(dá)子為靶點(diǎn)的藥物。目的是鑒別藥物，具有低FLCN表達(dá)的細(xì)胞系對(duì)所述藥物最敏感，且具有高FLCN表達(dá)的細(xì)胞系對(duì)所述藥物最有耐藥性(設(shè)定具有中等的或未確定的FLCN表達(dá)的細(xì)胞為中性靈敏度)。用COMPARE算法比較Developmental TherapeuticsProgram(DTP)數(shù)據(jù)庫(kù)(http: / / dtp. nci. nih. gov)中的單獨(dú)的化合物的FLCN種子模式，選擇對(duì)FLCN種子具有相似敏感度模式的15種化合物(所選化合物列于下表I中)。在具有/不具有FLCN表達(dá)的U0K-257細(xì)胞中篩選化合物敏感度
U0K-257是源自BHD患者并具有種系FLCN移碼突變(c. 1285dupC)的唯一的RCC細(xì)胞系(在沒有無(wú)義介導(dǎo)的mRNA裂解存在下，預(yù)料導(dǎo)致了過(guò)早的蛋白切斷)(p. His429ProfsX27) (Yang 等，Cancer Genet Cytogenet. 2008Jan 15,180(2) :100_9)。檢查U0K257-FLCf細(xì)胞和U0K257-FLCN+細(xì)胞對(duì)由選自COMPARE分析的15種化合物誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制的敏感度。接種細(xì)胞24h后，將各種濃度的化合物引入到細(xì)胞中，培養(yǎng)持續(xù)了 72小時(shí)，利用磺酰羅丹明B (SRB)檢驗(yàn)評(píng)定生長(zhǎng)抑制。然后計(jì)算GI5tl值，GI50定義為抑制50%生長(zhǎng)所需的化合物濃度。計(jì)算得到U0K257-FLCN—和U0K257-FLCN+的GI5tl值的比例，并將其作對(duì)于FLCN突變體細(xì)胞敏感度的指示。
圖I (A)顯示了用SRB測(cè)驗(yàn)測(cè)定的由氰基嗎啉代-ADR、鴉膽丁、甲基嗎啉-ADR、長(zhǎng)春新堿、紫杉醇和光神霉素對(duì)U0K257-FLCN_ (實(shí)線)和U0K257-FLCN+ (虛線)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。細(xì)胞持續(xù)暴露于藥物的所示濃度下72小吋。點(diǎn)值和GI5tl值為來(lái)自于至少三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值土SD。圖I (B)顯示了在所有15種化合物中U0K257-FLCf和U0K257-FLCN+的GI5tl的比例。計(jì)算所述比例，并將其用作對(duì)于突變FLCN細(xì)胞敏感度的指示。 如圖I和表I所示，七種化合物相對(duì)更抑制U0K257_FLCN_細(xì)胞(比例>1 )，并且最具有選擇性的生長(zhǎng)抑制敏感度是由光神霉素誘導(dǎo)的，其在U0K257-FLCN_細(xì)胞(64. 2±7. 9nM ；n=3)和U0K257-FLCN+細(xì)胞(3. 79±0. 39nM ；n=3)之間的GI5tl值具有幾乎10倍的差別。但是，U0K257_FLCN_細(xì)胞對(duì)其他八種化合物較不敏感(比例〈I)，且氰基嗎啉代-ADR誘導(dǎo)了最少的生長(zhǎng)抑制敏感性，氰基嗎啉代-ADR在U0K257-FLCN"細(xì)胞(0. 62±0. 16nM ；n=3)和 U0K257-FLCK 細(xì)胞(3. 79±0. 39nM ;n=3)之間的 GI5tl 值具有 6 倍的差另1J。以上數(shù)據(jù)顯示盡管這些化合物以相同標(biāo)準(zhǔn)選自COMPARE算法，但是不同的藥物對(duì)具有/不具有FLCN表達(dá)的細(xì)胞的差別敏感度之間存在很大變化。表I在具有/不具有FLCNa的UOK細(xì)胞中化合物-誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制
權(quán)利要求
1.一種用于治療腎細(xì)胞癌的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。
2.如權(quán)利要求I所述的組合物，所述組合物用于治療透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌。
3.如權(quán)利要求I或2所述的組合物，所述組合物用于治療與希佩爾-林道病或Birt-Hogg-Dub 6綜合征相關(guān)的腎細(xì)胞癌。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物,所述組合物用于治療與Birt-Hogg-Dub6綜合征相關(guān)的腎細(xì)胞癌。
5.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物用于抑制FLCN無(wú)效的腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
6.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物用于抑制VHL無(wú)效的腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
7.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物用于超過(guò)對(duì)FLCN-野生型細(xì)胞的對(duì)VHL無(wú)效的細(xì)胞的差別生長(zhǎng)抑制。
8.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物用于治療與FLCN失活相關(guān)的腎細(xì)胞癌。
9.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物用于治療與VHL失活相關(guān)的腎細(xì)胞癌。
10.一種用于抑制FLCN無(wú)效的腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。
11.一種用于抑制VHL無(wú)效的腎細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。
12.—種用于對(duì)超過(guò)FLCN-野生型細(xì)胞的FLCN無(wú)效的細(xì)胞的差別生長(zhǎng)抑制的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。
13.如前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物進(jìn)ー步包括鈉巴霉素或或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。
14.一種實(shí)質(zhì)上如這里描述或說(shuō)明的組合物或用途。
全文摘要
用于治療腎細(xì)胞癌的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。具體地，所述化合物適用于治療透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌。所述化合物對(duì)治療與希佩爾-林道病或Birt-Hogg-Dubé綜合征相關(guān)的腎細(xì)胞癌尤其有用。用作抗FLCN無(wú)效和VHL無(wú)效的透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的細(xì)胞毒素試劑的組合物，所述組合物包括光神霉素或其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物。
文檔編號(hào)A61K31/195GK102791261SQ201180010216
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2011年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月18日
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