與仿生細胞化腎單位有關(guān)的系統(tǒng)、方法和裝置制造方法
【專利摘要】本文公開了用于在細胞化的腎單位的仿生環(huán)境中培養(yǎng)細胞的系統(tǒng)和裝置，以及用于制造和使用細胞化的腎單位的方法。
【專利說明】與仿生細胞化腎單位有關(guān)的系統(tǒng)、方法和裝置
[0001]相關(guān)專利和申請
[0002]本申請要求于2011年6月15日提交的第61/497，376號美國臨時申請和于2011年6月16日提交的第61/497，854號美國臨時申請的權(quán)益，將其全部內(nèi)容引入本文作為參考。
[0003]MM
[0004]一般地，本公開涉及用于在細胞化的腎單位的仿生環(huán)境中培養(yǎng)細胞的系統(tǒng)和裝置，以及用于制造和使用細胞化的腎單位的方法。
[0005]直量
[0006]在控制的體外條件下生長的腎細胞在腎功能性研究、醫(yī)療裝置制備和藥物測試中具有廣泛的潛在應(yīng)用。腎細胞培養(yǎng)允許生物學家研究與腎相關(guān)的細胞的功能并觀察細胞對各種條件的響應(yīng)。高度受控制的腎環(huán)境可以用于執(zhí)行腎的一些功能以幫助腎病患者，并且可以被組織工程使用以生成用于移植到腎病患者體內(nèi)的特異性腎組織。此外，腎細胞培養(yǎng)可以在用于腎治療和用于測試藥物的腎毒性的藥物開發(fā)中使用?？刂频捏w外環(huán)境也可以用于其它類型的細胞，如用于刺激干細胞的希望的細胞功能。
[0007]這些應(yīng)用中的 每一種得益于引起體外細胞在體內(nèi)準確復制細胞的條件。盡管存在用于培養(yǎng)腎細胞的裝置和方法，但傳統(tǒng)的體外腎細胞環(huán)境是靜態(tài)的，未能解釋腎單位中經(jīng)歷的剪切應(yīng)力。此外，以前的腎細胞培養(yǎng)的體外環(huán)境沒有提供仿生信號(cue)，如由胞外基質(zhì)(ECM)提供的那些，因此在以前的環(huán)境中生長的細胞不具有它們在體內(nèi)所具有的表型和形態(tài)，例如細胞形狀或排列。腎單位中腎細胞的適當排列，尤其是細胞之間的細胞間連接的形成對于腎細胞執(zhí)行其過濾和吸收功能是必要的。因此，在先前的裝置中生長的腎細胞未能模擬腎單位的條件。
[0008]概沭
[0009]因此，需要可以用于生長更好地復制腎單位的體內(nèi)條件的腎細胞培養(yǎng)物的仿生裝置。特別地，控制流動通道中細胞的幾何形狀和排列的裝置可以用于建立比先前的裝置更加接近地模擬體內(nèi)條件的體外環(huán)境。微制造和微成型技術(shù)可以用于制備人工細胞基底，所述人工細胞基底具有模擬細胞外基質(zhì)(ECM)對腎細胞的作用的微-、亞微-和納米-拓撲圖案(topographical pattern)。拓撲表面的設(shè)計允許緊密控制在基底上面生長的細胞。這種表面圖案(surface patterning)連同附加的流動通道參數(shù)如通道高度、通道橫截面積和流速一起可以用于建立緊密模擬特異性細胞類型的體內(nèi)環(huán)境的高度受控制的體外條件。
[0010]因此，在一些方面中，本文公開了用于構(gòu)建和利用人造器官(如生物人工腎)的裝置和方法。在一些實施方案中，本技術(shù)的生物人工腎包括:包括至少一個拓撲表面的微流體流動通道；與所述流動通道流體連通用于允許流體流入所述流動通道的入口 ；和接種在所述拓撲表面上的腎細胞，其中選擇所述流動通道的表面的拓撲圖，以使腎細胞形成置于所述表面以上的細胞層，以實現(xiàn)通過至少一個表面的拓撲圖至少部分地確定的排列、行為或形態(tài)。另外地或供選擇地，在一些實施方案中，選擇所述表面的拓撲圖以促進細胞層中的細胞與至少一個表面的粘附增加。另外地或供選擇地，在一些實施方案中，所述表面拓撲圖使得細胞層的排列、行為或形態(tài)復制腎中的細胞的排列、行為或形態(tài)。
[0011]在一些實施方案中，所述流動通道在生物人工腎中形成。在一些實施方案中，所述流動通道形成為一種或多種結(jié)構(gòu)的部分，所述結(jié)構(gòu)選自亨利袢(Loop of Henle)、集合小管和遠端小管。
[0012]在一些實施方案中，本技術(shù)的生物人工腎包括流體源，用于使流體經(jīng)由入口流動通過流動通道，其中所述流體誘導在細胞層上的剪切應(yīng)力。在一些實施方案中，所述流體源配置成使流體以一定流速流動，所述流速在生物人工腎的至少一個區(qū)域中產(chǎn)生在細胞層上的一定水平的剪切應(yīng)力，所述剪切應(yīng)力為約10.0達因/cm2。在一些實施方案中，在生物人工腎的至少一個區(qū)域中的所述剪切應(yīng)力的水平小于或等于約1.0達因/cm2 ;在其他實施方案中，在生物人工腎的至少一個區(qū)域中的所述剪切應(yīng)力的水平小于或等于約0.1達因/cm2 ；在再其他的實施方案中，在生物人工腎的至少一個區(qū)域中的所述剪切應(yīng)力的水平小于或等于約0.02達因/cm2。
[0013]另外地或供選擇地，在一些實施方案中，所述流體通道如此配置，使得流體在生物人工腎的第一區(qū)域以第一流速流動，并且在生物人工腎的第二區(qū)域以第二流速流動。在一些實施方案中，所述第一流速產(chǎn)生在第一區(qū)域中的細胞層上的第一水平的剪切應(yīng)力，并且所述第二流速產(chǎn)生在第二區(qū)域中的細胞層上的第二水平的剪切應(yīng)力。在一些實施方案中，所述第一和第二水平的剪切應(yīng)力是不同的。暴露于不同剪切應(yīng)力水平的生物人工腎的不同區(qū)域可以包括裝置的任何結(jié)構(gòu)，所述裝置包括細胞層。以舉例的方式而不是以限制的方式，在一些實施方案中，生物人工腎包括一個或多個集合管、遠端小管和亨利袢，所述亨利袢包括升支和降支。在一些實施方案中，所述第一區(qū)域是所述亨利袢的升支，而第二區(qū)域是所述亨利袢的降支。在一些實施方案中，所述第一區(qū)域是亨利袢，而所述第二區(qū)域是集合管和遠端小管中的一個或多個。
[0014]另外地或供選擇地，在一些實施方案中，所述通道如此成形，使得流體通過流動通道的流動沿著流動通道的長度產(chǎn)生多個剪切應(yīng)力值。在一些實施方案中，流動通道的至少一個表面具有至少兩種不同的拓撲圖。在一些實施方案中，流動通道的第一表面具有第一拓撲圖，并且流動通道的第二表面具有第二拓撲圖。顯示不同拓撲圖的生物人工腎的不同區(qū)域可以包括裝置的任意結(jié)構(gòu)，所述裝置將包括細胞層。以舉例的方式而不是以限制的方式，在一些實施方案中，生物人工腎包括集合管、遠端小管和亨利袢中的一個或多個，所述亨利袢包括升支和降支。在一些實施方案中，第一表面在亨利袢的升支中，并且第二表面在亨利袢的降支中。在一些實施方案中，第一表面在亨利袢中，而第二表面在集合管和遠端小管中的一個或多個中。在一些實施方案中，人工腎包括在第一和第二表面之間的過渡拓撲表面。
[0015]在一些實施方案中，第一表面的拓撲圖包括具有第一間距的嵴，并且第二表面的拓撲圖包括具有第二間距的嵴。在一些實施方案中，第一表面的拓撲圖包括在相對于流體流動的第一方向上的嵴，并且第二表面的拓撲圖包括在相對于流體流動的第二方向上的嵴。在一些實施方案中，第一拓撲圖包括嵴，而第二拓撲圖包括凹陷(pit)和柱(post)家族中的一種或多種拓撲圖。在一些實施方案中，表面的拓撲圖包括嵴，所述嵴的寬度為約5 μ m或更小。
[0016]在一些實施方案中，生物人工腎包括置于基底的一部分上的親細胞性物質(zhì)(如膠原)，用于在基底的所述部分中生長細胞層。在一些實施方案中，基底的所述部分形成流動通道的表面。
[0017]在一些實施方案中，生物人工腎包括至少第二流動通道，所述第二流動通道具有至少一個第二流動通道的表面，所述第二流動通道的表面具有在其中形成的拓撲圖。在一些實施方案中，第一流動通道與第二流動通道被膜隔開。在一些實施方案中，第一流動通道接種有腎上皮細胞；另外地或供選擇地，在一些實施方案中，第二流動通道接種有血管上皮細胞。在一些實施方案中，第一流動通道包括血液流動層，并且第二流動通道包括濾液層。
[0018]在一些實施方案中，第一通道的至少一個表面包括與第二通道中的相應(yīng)表面不同的表面拓撲圖。例如，在一些實施方案中，第一通道中的表面拓撲圖包括與第二通道的表面拓撲圖不同的間距或形狀。在一些實施方案中，生物人工腎包括用于使流體流動通過第一流動通道和第二流動通道的第一流體源，其中所述流體誘導第一通道中的細胞層上的第一剪切應(yīng)力和第二流動通道中的細胞層上的第二剪切應(yīng)力。在一些實施方案中，第一剪切應(yīng)力與第二剪切應(yīng)力不同。
[0019]在一些實施方案中，接種在人工腎中的腎細胞包括一種或多種細胞類型，所述細胞類型選自近端小管細胞、腎近端小管上皮細胞、Madin-Darby犬腎細胞、原代內(nèi)髓集合管細胞、原代近端小管細胞、胚胎干細胞、成體干細胞、誘導多能干細胞和內(nèi)皮細胞。
[0020]附圖的簡要i兌明
[0021]參照以下附圖，可以從以下說明性描述中更好地理解所述系統(tǒng)和方法，其中:
[0022]圖1A是在平坦表面上生長的腎細胞培養(yǎng)物的略圖；
[0023]圖1B是根據(jù)本發(fā)明的說明性的實施方案，在具有拓撲圖案的基底上生長的腎細胞培養(yǎng)物的略圖；
[0024]圖1C是在平坦表面上生長的腎`細胞培養(yǎng)物的照片；
[0025]圖1D是根據(jù)本發(fā)明的說明性的實施方案，在具有拓撲圖案的基底上生長的腎細胞培養(yǎng)物的照片；
[0026]圖2A是根據(jù)本發(fā)明的說明性的實施方案，具有仿生流動通道的裝置的分解實體模型；
[0027]圖2B是根據(jù)本發(fā)明的說明性的施方案，具有來自圖2A的仿生流動通道的組裝的裝置的實體模型；
[0028]圖2C是根據(jù)本發(fā)明的說明性的實施方案，用于與圖2B的仿生流動裝置一起使用的流動系統(tǒng)的框圖；
[0029]圖3是根據(jù)本發(fā)明的說明性的實施方案，用于生成和使用圖2的仿生流動通道之一的方法的流程圖；
[0030]圖4是根據(jù)本發(fā)明的說明性的實施方案，說明用于制備具有拓撲圖案的基底的方法的一系列略圖；
[0031]圖5是是根據(jù)本發(fā)明的說明性的實施方案，用于在表面上建立親細胞和疏細胞區(qū)域并在所述表面上生長細胞的方法的流程圖；
[0032]圖6A、6B、6C和6D是具有不同的拓撲特征的仿生流動通道的三個說明性的實施方案的橫截面的透視圖；
[0033]圖7A是其拓撲圖案具有漸變的基底的說明性實施方案的透視圖；[0034]圖7B、7C和7D是其拓撲圖案沿著通道具有變化的流動通道表面的三個說明性的實施方案的頂視圖；
[0035]圖8A、8B、8C、8D、8E和8F是具有不同的拓撲圖案的三個基底的說明性的實施方案的透視圖；
[0036]圖9A和9B是根據(jù)本發(fā)明的說明性的實施方案，用于使用圖2的仿生流動通道之一的方法的流程圖；
[0037]圖10是根據(jù)本發(fā)明的說明性的實施方案的包括微制造的生物人工亨利袢、遠端小管和集合管的組裝的集成裝置的示意圖，所述裝置包括用于刺激圖案化的細胞生長的拓撲結(jié)構(gòu)；
[0038]圖11是根據(jù)本發(fā)明的說明性的實施方案的微制造的生物人工亨利袢的未組裝的層的示意圖，所述亨利袢包括用于刺激圖案化的細胞生長的拓撲結(jié)構(gòu)；
[0039]圖12是根據(jù)本發(fā)明的說明性的實施方案的微制造的生物人工亨利袢中的流動行為的示意圖，所述亨利袢包括用于刺激圖案化的細胞生長的拓撲結(jié)構(gòu)；
[0040]圖13是根據(jù)本發(fā)明的說明性的實施方案的微制造的生物人工亨利袢的組裝的層的示意圖，所述亨利袢包括用于刺激圖案化的細胞生長的拓撲結(jié)構(gòu)；
[0041]圖14是根據(jù)本發(fā)明的說明性的實施方案的接種在圖10的微制造的生物人工亨利袢的過濾層的細胞的示意圖，所述亨利袢包括用于刺激圖案化的細胞生長的拓撲結(jié)構(gòu)；
[0042]圖15A、15B、15C和15D是本發(fā)明的仿生流動裝置的說明性的實施方案的照片；
[0043]圖15E是粘附到ECM包被區(qū)域的通道內(nèi)的細胞的相襯圖像。
`[0044]圖16A是在本發(fā)明的說明性實施方案中的用于制造嵴/溝圖案表面的鎳合金模具的照片；
[0045]圖16B是在本發(fā)明的說明性實施方案中的聚苯乙烯基底的照片；
[0046]圖16C是在圖16B中顯示的聚苯乙烯基底的邊緣輪廓的照片；
[0047]圖17A顯示了在空白基底(上排)或暴露于0、0.02或1.0達因/cm2FSS2小時的拓撲基底(下排)上生長的HK-2細胞的匯合層的熒光標記的細胞核。箭頭指示在拓撲基底上的溝的方向；
[0048]圖17B是顯示細胞對齊到溝的百分比的條形圖。前三個條代表在空白基底(無拓撲圖)上生長并分別暴露于0、0.02或1.0達因/Cm2FSS的細胞，后三個條代表在拓撲基底上生長并分別暴露于0、0.02或1.0達因/cm2FSS的細胞；
[0049]圖18A和18B顯示在空白基底或拓撲基底上培養(yǎng)并暴露于0、0.02或1.0達因/Cm2FSS的細胞的ZO-1表達的代表性的圖像；
[0050]圖19A是顯示沿細胞周長整合并通過細胞周長均一化的ZO-1強度的條形圖。前三個條代表在空白基底(無拓撲圖)上生長并分別暴露于0、0.02或1.0達因/Cm2FSS的細胞。后三個條代表在拓撲基底上生長并分別暴露于0、0.02或1.0達因/Cm2FSS的細胞；
[0051]圖19B是顯示沿細胞周長測量的ZO-1強度的標準偏差的條形圖。前三個條代表在空白基底(無拓撲圖)上生長并分別暴露于0、0.02或1.0達因/Cm2FSS的細胞。后三個條代表在拓撲基底上生長并分別暴露于0、0.02或1.0達因/Cm2FSS的細胞。
[0052]詳細描沭
[0053]為了提供對本發(fā)明的整體理解，現(xiàn)在將描述某些說明性的實施方案，包括用于在仿生環(huán)境中培養(yǎng)細胞的裝置和方法。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解，本文描述的系統(tǒng)和方法可以改變和修改為適用于待解決的應(yīng)用，并且本文描述的系統(tǒng)和方法可以在其他合適的應(yīng)用中采用，并且這樣的其他添加和修改不會偏離其范圍。
[0054]仿生流動裝置包括具有流體入口和流體出口的流動通道。為了建立復制器官結(jié)構(gòu)如腎單位的流動通道，將器官的細胞的培養(yǎng)物在流動通道的至少一側(cè)上生長。在體內(nèi)，細胞外基質(zhì)(ECM)在結(jié)構(gòu)上支持腎單位的細胞，并導致內(nèi)襯腎單位的細胞以特定排列彼此對齊。在仿生流動通道中，細胞生長在其上的表面的拓撲圖的適當選擇導致細胞具有將由ECM建立的對齊和/或排列。具有拓撲圖的仿生流動通道不僅可以用于復制腎結(jié)構(gòu)，還可以復制膀胱、消化系統(tǒng)、心臟、靜脈、動脈、毛細血管、淋巴系統(tǒng)或經(jīng)歷流體流動的任意其他結(jié)構(gòu)的部分。
[0055]示例性的表面拓撲圖對腎細胞的影響顯示于圖1中。圖1A和IB顯示了腎細胞培養(yǎng)物的兩個略圖。圖1C和ID顯示了拍攝自腎細胞培養(yǎng)物的兩張照片。圖1A是在平坦表面104上生長的腎細胞102的培養(yǎng)物的略圖，所述平坦表面如典型的培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿或燒瓶。傳統(tǒng)地，腎細胞在流體靜止狀態(tài)下培養(yǎng)，不經(jīng)歷剪切應(yīng)力或拓撲圖。即使腎細胞經(jīng)歷流體流動和剪切應(yīng)力，細胞也不會對齊并且其形態(tài)不會被影響。如圖1A中所示，通常培養(yǎng)的腎細胞102不具有特征形狀或?qū)R，而似乎是隨機對齊的。此外，細胞102不形成超結(jié)構(gòu)并且通常不彼此接合。圖1C是在平坦表面104上生長的腎細胞的培養(yǎng)物的照片。圖1C說明了細胞102是如何缺乏特征形狀并隨機對齊的。
[0056]圖1B是在具有示例性的拓撲圖案的表面154上生長的腎細胞152的培養(yǎng)物的略圖。表面具有比細胞152更窄的溝156和嵴158。每個細胞152跨越數(shù)個溝156和嵴158。與細胞外基質(zhì)(ECM)類似，該溝和嵴的圖案導致腎細胞152延長并自身與嵴平行對齊，促進細胞間連接，并促進細 胞152粘附到表面154。左側(cè)給出的比例尺給出了一些腎上皮細胞的近似尺寸，然而，腎細胞的實際尺寸在整個腎單位中變化很大。細胞152的形態(tài)也是示例性的；一些類型的腎細胞，特別是柱狀細胞，更多是矩形的。在圖1B中，溝156和嵴158大致具有相同的寬度，但他們不是必須這樣的。對于具有約IOmm的延長的寬度的腎細胞，如細胞152，溝156和嵴158的寬度應(yīng)為約5mm或更小，以使延長的細胞與一個以上的嵴接觸。在圖1B中，溝156和嵴158的寬度為約800nm。溝156和嵴158可以比這個更窄，但是如果他們窄于20nm，結(jié)構(gòu)將對腎細胞具有有限的作用。然而，拓撲圖案的尺寸取決于細胞的大小。此外，對于某些應(yīng)用，理想的是具有與細胞寬度相關(guān)的更寬的溝，以使細胞靜止在溝中。在這樣的實施方案中，嵴可以比溝更窄。在其他實施方案中，嵴可以比溝更寬。
[0057]除了控制細胞的方向和形狀外，與在非結(jié)構(gòu)或“空白”基底上生長相同時間段的細胞相比，溝和嵴還導致腎細胞152接合在一起并形成更確定的和發(fā)育良好的連接。在體內(nèi)觀察到的緊密的細胞連接對于腎單位適當?shù)剡^濾血液和重吸收水分是必要的。緊密連接防止流體(包括液體和溶解的溶質(zhì))在細胞之間通過，因此離開腎單位壁的流體必須通過上皮細胞，其可以控制何種流體和/或溶質(zhì)通過。當表面拓撲圖，如溝156和嵴158，導致匯合細胞對齊以使其膜可以結(jié)合以形成該流體不可滲透的屏障時，這些細胞連接也將在體外環(huán)境中形成。流動通道可以在與表面154相關(guān)的任何方向上排列，以導致流體在任何方向上流過細胞152。在圖6顯示的實施方案中，流體平行或垂直于溝156和嵴158流動。
[0058]圖1D為說明本發(fā)明的一個可能的實施方案的結(jié)果的照片。圖1D顯示在具有拓撲結(jié)構(gòu)154的基底上生長的腎細胞培養(yǎng)物。如在圖1B中說明的，細胞152似乎以更加對齊和緊密連接的方式生長。
[0059]圖2A為顯示用于在仿生環(huán)境中培養(yǎng)細胞的裝置200的示例性的實施方案的分解實體模型。圖2B顯示組裝的裝置。裝置200包括基底202和具有三個流動通道212的流動池204。基底202的頂端具有圖2中未顯示的拓撲圖案，如圖1B的圖案。流動通道212的壁也可以或供選擇地具有拓撲圖，如圖1B的圖案。在基底202的刨光側(cè)的頂部是細胞層，細胞優(yōu)選地限制于在流動池202中的流動通道212底部的基底區(qū)域?；?02可以由熱塑性塑料制成，所述熱塑性塑料如聚苯乙烯或聚酰亞胺、生物可降解的聚酯(如聚己內(nèi)酯(PCL)),或軟彈性體(如聚癸二酸甘油酯(PGS))?；?02可以供選擇地由聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚(N-異丙基丙烯酰胺)、或由例如碳或氧化鋅形成的納米管或納米線制成?；?02可以由任何材料制成，在所述材料上可以形成微米級拓撲圖并且可以生長細胞。拓撲圖案的實例顯示于圖7A-7D和圖8A-8F，并且用于化學圖案化基底202的方法如圖4所述。用于生長細胞層的方法如圖5所述。
[0060]流動池204具有從底部切入流動池204的三個流動通道212。在一些實施方案中，流動池由透明材料如PDMS制成。供選擇地，流動池可以由其他材料制成，如以上列出的任意可能的基底材料。3D實體打印機或光刻可以用于產(chǎn)生流動池204中的流動通道212。如圖2B所示，當組裝時，基底202形成流動通道的底壁，并且流動池中的流動通道212包括頂壁和兩個側(cè)壁。頂壁、底壁和側(cè)壁在本文中共同稱為“壁”。流動池204和基底202可以可逆地連接，以使在實驗進行后，可以移除流動池204以能夠檢查細胞層。入口 214和出口216允許管道進入流動通道212。入口 214提供用于將流體引入流動通道212的通路,而出口 216提供用于將穿過流動通道212的流體移除的通路。進入入口 214的管道連接于控制注入流動通道212中的體積 和速度的工具(means)，如具有注射泵的注射器。流體注入系統(tǒng)可以是仿生流動系統(tǒng)的一部分，裝置200安裝在所述系統(tǒng)中。示例性的流動系統(tǒng)240的框圖顯示于圖2C中。流動系統(tǒng)可以包括另外的特征，如溫度控制系統(tǒng)和觀察設(shè)備。通過入口端口 214引入的流體流沿著流動通道212的壁和在沿著通道底部的培養(yǎng)的細胞上產(chǎn)生均勻的層流。
[0061]穿過培養(yǎng)的細胞的層流模擬在腎單位內(nèi)的流體的流動，并在流體和培養(yǎng)的細胞之間引入剪切應(yīng)力。調(diào)節(jié)流體的流速導致沿著細胞的剪切應(yīng)力改變。在腎近端小管中，細胞經(jīng)歷約I達因/Cm2的剪切應(yīng)力(流體剪切應(yīng)力或“FSS”);然而，所經(jīng)歷的剪切應(yīng)力沿著腎單位的長度變化。觀察到剪切應(yīng)力低至0.015達因/cm2，因此能夠通過控制流速改變剪切應(yīng)力允許使用單一的裝置設(shè)計產(chǎn)生一系列仿生條件。對于具有寬度w和高度h的矩形通道，和具有粘度m的流體，壁到切應(yīng)力t和流速Q(mào)具有以下關(guān)系:
[0062]T =-
hhl
[0063]除了通過改變流速來改變通道的剪切應(yīng)力外，如果通道的幾何形狀沿著通道的長度變化，在單一通道中的剪切應(yīng)力可以沿著通道的長度變化。例如，在沿著流動方向的通道的第一區(qū)域中具有第一高度和在通道的第二區(qū)域具有第二、更低的高度的流動通道中，在通道的更低的第二區(qū)域中的流體流動比在更高的第一區(qū)域中具有更高的流速。因此，在第二區(qū)域中的細胞比第一區(qū)域經(jīng)歷更高的剪切應(yīng)力。通過平穩(wěn)地改變通道高度，細胞層經(jīng)歷漸變的剪切應(yīng)力。變化的剪切應(yīng)力可以用于復制腎單位的不同部分，所述腎單位的不同部分可以具有不同的功能。此外，細胞的不同類型和排列與經(jīng)歷不同水平的剪切應(yīng)力的腎單位的區(qū)域相關(guān)，因此沿著具有不同的細胞類型或排列的基底的區(qū)域可以與不同高度的流動通道對齊以使細胞經(jīng)歷適當?shù)募羟袘?yīng)力。
[0064]圖2中的流通通道212具有矩形的橫截面，但是流動通道對于不同的流體動力學可以具有非矩形的橫截面。例如，流動通道可以具有半圓形的、三角形的或梯形的橫截面。剪切應(yīng)力可以使用橫截面幾何結(jié)構(gòu)的剪切應(yīng)力方程來確定。流動通道可以沿其長度具有兩種或多種不同的橫截面形狀。
[0065]組裝的流動裝置200可以放置在圖2C的框圖中顯示的流動系統(tǒng)240中，以容納組件并控制流動通道環(huán)境。流動系統(tǒng)包括固定裝置242、觀察設(shè)備244、流體注入系統(tǒng)250和溫度控制系統(tǒng)260。
[0066]固定裝置242包括使用例如3D實體打印機制成的塑料蓋和塑料底。流動通道裝置200位于固定裝置242的蓋和底之間，所述蓋和底通過例如螺絲或夾具保持在一起。因此，固定裝置242使裝置的基底202和流動池204保持在一起，優(yōu)選地形成可逆的密封，以使流體不能滲漏出流動通道212。
[0067]觀察設(shè)備244用于在實驗過程中和/或之后觀察細胞，而流動通道裝置200容納在固定裝置242中。如果通道壁是透明的，光學顯微鏡可以用于在實驗過程中觀察樣品。在一些實施方案中，觀察設(shè)備包括指向流動通道中的光源和在流動通道下方的用于檢測超常光傳輸(“EOT”)信號的光學傳感器。在這樣的實施方案中，流動池204和基底202兩者應(yīng)由允許光傳輸?shù)牟牧现瞥伞Ｔ谄渌麑嵤┓桨钢?，電極置于用于檢測細胞的匯合、形狀和代謝的流動通道中。在一些實施方案中，在固定裝置的外部進行成像，可能地在流動通道裝置200被拆卸后，并且流動系統(tǒng)240不具有觀察設(shè)備244。
[0068]流體注入系統(tǒng)250包括注射器252和注射泵254。注射器252含有待流過流動通道212的流體，且注射泵254控制注射器2`52，以控制所流動的流體的量、流速和所述流體流動的時間長度。流體注入系統(tǒng)250可以用于注入兩種或多種不同的流體，包括但不限于，緩沖流體、反應(yīng)物流體、固定液和染色劑。流體注入系統(tǒng)250還可以包括用于合并流體的裝置；例如，注射泵254可以包括閥，用于將反應(yīng)物引入緩沖液中，或用于將染色劑引入緩沖液中。注射泵254可以由處理器(如通用處理器)控制。
[0069]基底202和/或流動池204可以由絕緣材料制成以保持在流動通道212中的溫度穩(wěn)定性。流動系統(tǒng)240可以包括溫度控制系統(tǒng)260或孵育器。溫度控制系統(tǒng)包括溫度傳感器262、溫度控制器264和加熱元件266以將流動通道212保持在仿生溫度下，即98.6 T?？梢赃x擇更高或更低的溫度以模擬不同的條件，例如發(fā)燒或損傷。溫度262傳感器檢測系統(tǒng)溫度并將其發(fā)送至溫度控制器264。根據(jù)當前的系統(tǒng)溫度，溫度控制器264確定是否應(yīng)當向系統(tǒng)增加熱量。溫度控制器264向加熱元件266 (如熱敏電阻)發(fā)送指令，以在必要時向系統(tǒng)增加熱量。在一些實施方案中，溫度系統(tǒng)還可以冷卻裝置200。溫度控制器或第二溫度控制器還保持待流入流體通道212中的流體溫度。流動系統(tǒng)240還可以包括二氧化碳控制器270，以調(diào)節(jié)流動通道內(nèi)的二氧化碳水平。二氧化碳控制器270可以包括二氧化碳傳感器、處理器和用于在必要時升高或降低二氧化碳水平的工具。在一些實施方案中，二氧化碳控制器整合至溫度控制系統(tǒng)260中。[0070]在一些實施方案中，流動系統(tǒng)240連接到具有通用處理器的計算機。計算機可以充當溫度控制器264，并且來自溫度傳感器262的溫度發(fā)送到計算機并保存到存儲器中。類似地，計算機可以充當二氧化碳控制器，并且來自二氧化碳傳感器的二氧化碳水平可以發(fā)送到計算機并保存到存儲器中。計算機還可以控制注射泵254使流體流動自動化并保存與流體流動有關(guān)的數(shù)據(jù)。計算機還可以控制觀察設(shè)備，保存獲得自觀察設(shè)備的圖像或其他數(shù)據(jù)，以及對數(shù)據(jù)進行分析。
[0071]裝置200可以包括多于或少于三個流動通道212?？梢灾苽浒ㄒ话賯€或更多個流動通道212的高通量裝置。在一些實施方案中，高通量裝置包括九十六個流動通道。兩個或多個流動通道212的入口 214可以流體連接以使流體同時通過多個流動通道212流動，并且如果流動通道212的幾何形狀是相同的，以相同的流速流動。流動系統(tǒng)240可以配置成同時自動運行多個實驗，或一次進行一個實驗。在裝置200中的一個流動通道中進行的實驗在流體、流速、流動通道幾何形狀和溫度中的至少一項可以與在不同的流動通道中進行的實驗不同。裝置200可以是一次性的，或在使用后，全部或部分裝置(例如，基底202或流動池204)可以拆卸并清潔以重復使用。 [0072]圖3是建立和使用圖1所示的仿生流動通道之一的方法300的流程圖。方法300包括以下步驟:獲得刨光的基底(302 )，化學圖案化基底(304)、生長細胞層(306 )，組裝流動通道(308 )，使流體流過流動通道(310 )，和固定細胞用于分析(312 )。
[0073]第一步302用于制備或獲得具有拓撲圖案的表面，所述拓撲圖案如圖1B的表面152上的溝156和嵴158。表面可以使用例如直接光刻、可光圖案化的抗蝕劑、注塑成型、直接微加工、深RIE蝕刻或熱壓印或其任意組合生成。用于通過熱壓印產(chǎn)生刨光的基底以用于裝置200中的示例性的方法如圖4所述。在一些實施方案中，金屬(如金)的薄層被蒸發(fā)到拓撲表面上來幫助光學成像以用于分析樣品。在一些實施方案中，金屬層允許使用用于檢測表面等離子體共振(SPR)的光學傳感器分析細胞培養(yǎng)物。在一些實施方案中，由于分子頭基對金屬的強的親和力，金屬層還用于化學圖案化在基底上的某些親細胞和疏細胞分子。金屬層足夠薄以維持表面的拓撲圖。金屬層可以具有納米孔以用于SPR檢測。納米孔可以為約IOOnm寬并使用例如光刻技術(shù)、電子束光刻技術(shù)、聚焦離子束(FIB)或其他方法碾磨在金屬中。金屬層可以供選擇地由銀、鋁、鈹、錸、鋨、鉀、銣、銫、氧化錸、氧化鎢、銅、鈦或另一種適用于成像或其他分析的材料制備。在一些實施方案中，鉻或其他金屬粘合劑的薄層在金或其他金屬層之前首先蒸發(fā)到表面上。
[0074]接下來，化學圖案化結(jié)構(gòu)化的表面(步驟304)以制備疏細胞和/或親細胞區(qū)域，用于分離細胞生長與流動通道區(qū)域。如果腎細胞在整個表面上(如基底202)生長，那么將流動池204密封到基底202將壓碎流動通道212外部的區(qū)域內(nèi)的細胞。這造成內(nèi)容物從壓碎的細胞滲漏到流動通道212中，可以提供由存活細胞接收的生化信號。這樣的滲漏可以對實驗步驟具有不希望的影響。因此，細胞應(yīng)限制在形成組裝的流動池壁(即，頂部、底部和/或側(cè)面)的表面區(qū)域。對于裝置200，細胞層限制在不接觸流動池204的基底202的區(qū)域，即，在流動通道212以下的區(qū)域。為了產(chǎn)生這些區(qū)域，親細胞材料可以放置在流動通道表面上以促進流動通道內(nèi)的區(qū)域的細胞生長。另外地或供選擇地，疏細胞材料可以放置在不形成流動通道壁的表面上，以防止在流動通道表面外部的細胞生長。一旦產(chǎn)生拓撲表面并進行化學圖案化，將ECM蛋白施加到表面并將細胞懸液置于蛋白層以上以生長含有一種或多種類型細胞的細胞培養(yǎng)物(步驟306)。用于產(chǎn)生表面的親細胞和疏細胞區(qū)域(如基底202)和在表面上生長細胞的一種方法如圖5所述。
[0075]一旦細胞長大(步驟306)，組裝流動通道(步驟308)。在一些實施方案中，流動池可逆地組裝以使至少一個壁可以移除用于觀察。在一些實施方案中，流動池204放置在基底200之上并使用例如螺絲或夾具連接。供選擇地，裝置200可以如圖2C所述組裝在固定組件242中。然后使流體流過組裝的流動通道(步驟310)。選擇流速以產(chǎn)生如圖2所述的希望的剪切應(yīng)力，并且流速通過流體注入系統(tǒng)控制。流體可以含有試劑和緩沖流體。試劑是根據(jù)所進行的實驗選擇的；例如，流體可以包括藥劑或潛在的毒素，以測試物質(zhì)的功效或毒性。流體可以在任意持續(xù)時間內(nèi)流過流動通道，所述持續(xù)時間例如為約數(shù)秒、數(shù)分鐘、數(shù)小時或數(shù)日。流體流動的持續(xù)時間取決于所進行的實驗類型。例如，用于成像經(jīng)歷特定剪切應(yīng)力的細胞的實驗僅可以持續(xù)短時間，約數(shù)十秒至數(shù)分鐘。另一方面，用于測定潛在的毒素或潛在的治療劑對細胞的影響的實驗可以需要更長的暴露時間，約數(shù)小時、數(shù)日或更長。流速可以隨時間變化，并且在一些實施方案中，細胞可以經(jīng)歷間斷的流體流動。
[0076]接下來,如果要進行流動后分析(post-flow analysis),則固定細胞以用于分析(步驟312)。首先，通過使第二溶液(如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))流動通過流動通道來漂洗細胞，隨后，使含有固定劑(如甲醛或其他醛)的第三溶液流動通過通道，以使通道可以被拆卸而不損傷細胞。固定劑在溶液中的百分比和選擇的固定劑類型取決于分析方法和在流動通道中的細胞類型。使用流體注入系統(tǒng)將漂洗溶液和固定劑通過入口 214注入?？梢允褂孟嗤淖⑷霗C構(gòu)(例如注射泵)和管道并用注射器替換，或固定裝置可以包括通過管道連接到相同入口的至少兩個或三個注射泵。染色劑還可以在拆卸流動通道之前或之后施加到細胞，以增加成像對比度。
[0077]圖4是說明用于制備具有拓撲圖案的表面(如圖1的表面102)的方法的一系列略圖。方法涉及蝕刻氧化硅母模(步驟A-E)，電成形鎳陰模(步驟F)，和使用熱壓印由鎳模具制備拓撲表面(步驟G-1)。氧化硅母模是使用光刻技術(shù)產(chǎn)生的。步驟A說明將光致抗蝕劑溶液404涂覆在氧化硅晶片402上。光致抗蝕劑404可以使用旋涂施加。在旋涂后,氧化硅晶片402可以被烘烤以蒸發(fā)殘留溶劑。隨后將光掩模406層疊在光致抗蝕劑404的頂部(步驟B)以光刻地圖案化抗蝕劑404。在圖4中，光掩模406具有嵴圖案的橫截面。拓撲圖的圖案由選擇的光掩模確定。供選擇的拓撲圖案可以由不同的光掩模制成，其顯示于圖6中。通過將頂面暴露于光408來顯影光致抗蝕劑404，以產(chǎn)生蝕刻掩模410 (步驟C)。在圖4中，使用了負性光致抗蝕劑404，因此當顯影時，暴露于光408的部分光致抗蝕劑層404變得不溶于顯影劑，而未暴露部分是可溶的并溶解。供選擇地，可以使用正性光致抗蝕劑。一旦在光致抗蝕劑404中生成圖案以制備蝕刻掩模410，硅晶片可以再次被烘烤，并且晶片402被顯影以將光致抗蝕劑410從暴露于光的區(qū)域去除。最后，使用化學劑蝕刻氧化硅晶片402，所述化學劑去除晶片的未被蝕刻掩模410保護的最上層(步驟D)。在一些應(yīng)用中，去除的氧化硅的深度約為1微米。為了制備如圖4所示的具有直角邊緣的圖案，使用各向異性的蝕刻劑；如果需要圓形的孔，可以使用各向同性的蝕刻劑。最后，剝離蝕刻掩模410以產(chǎn)生母模412 (步驟E)。
[0078]其他方法可以用于產(chǎn)生母模412。例如，電子束光刻或其他納米光刻技術(shù)可以用于將特征蝕刻到抗蝕劑中，特別是如果希望的拓撲圖包括寬度約為數(shù)納米或數(shù)十納米的非常小型的特征。
[0079]一旦產(chǎn)生了母模412，將鎳414電成形到硅晶片(步驟F)。鎳源414和母模412放置在電解池中。電源416在鎳源414和氧化硅母模412之間產(chǎn)生電壓差，其導致鎳電鍍在母模412上以形成鎳模418，所述鎳模418是母模412的陰模。鎳模418從母模分離并朝下放置并壓在熱塑性塑料420上。將熱塑性塑料通過熱壓印擠壓到鎳模418中的溝中(步驟G)。升高的熱量和壓力導致熱塑性塑料420填充到鎳模中。隨后，壓印的熱塑性塑料422在恒壓下冷卻(步驟H)，然后從鎳模418中移除(步驟I)。在模塑的熱塑性塑料422中的拓撲表面隨后可以用作流動通道的壁。
[0080]圖5是根據(jù)本發(fā)明的一個說明性的實施方案的產(chǎn)生表面的親細胞和疏細胞區(qū)域并在表面上生長細胞的方法的流程圖。該方法涉及在將形成流動通道壁的區(qū)域的表面上產(chǎn)生疏水區(qū)域(步驟502和504)，使用親水性物質(zhì)填充表面的其余部分(步驟506)，使用蛋白涂覆疏水區(qū)域(步驟508)，并在蛋白上方(即親細胞區(qū)域)生長細胞層(步驟510和512)。一般地，細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白粘附于疏水分子。細胞在類似于體內(nèi)條件的條件下旺盛地成長，因此細胞傾向于在含有ECM蛋白的區(qū)域中生長，而在不含ECM蛋白的區(qū)域中不生長。
[0081]首先，將疏水性溶液施加到PDMS壓模(步驟502)并壓模在具有拓撲圖的表面上(步驟504)。壓模使用壓力保持并釋放以使分子的疏水性自組裝單層(SAM)保留在表面上。用于疏水性SAM的分子通常具有結(jié)合于基底的頭基和結(jié)合于ECM蛋白的疏水性尾基(如CH3)。在一些實施方案中，十六烷硫醇用于SAM?？梢杂糜赟AM的其他分子包括烷基硫醇、官能化的硫醇、二硫醇和硅烷。
[0082]PDMS壓模的涂飾表面可以是所壓模的流動通道的側(cè)面的大小，或所涂飾的表面可以僅覆蓋待使用細胞填充 的流動通道的區(qū)域。例如，如果不希望使細胞生長在靠近流體入口和出口的通道末端，則使用僅覆蓋流動通道的中央部分的矩形壓模。對于具有多個流動池的裝置，單一 PDMS壓?？梢跃哂杏糜趬耗６鄠€流動通道的壁的圖案。
[0083]表面的其余部分回浸親水性溶液，如聚乙二醇(PEG)，以在不是流動通道壁的表面的部分上形成妨礙細胞生長的SAM (步驟506)。如圖1所描述的，這防止細胞在希望的區(qū)域外生長，以防止從當拆卸裝置時壓碎的細胞中滲漏以及有害的邊緣效應(yīng)，如壓碎的細胞和在通道內(nèi)的細胞之間的負通訊。
[0084]使用細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白涂覆具有兩種SAM的拓撲表面(步驟508)。蛋白粘附于疏水SAM，但是親水SAM抑制蛋白吸附。這導致蛋白集中在親水區(qū)域，當組裝裝置時，所述親水區(qū)域?qū)⑿纬闪鲃油ǖ赖谋凇Ｔ谝恍嵤┓桨钢?，不同類型的細胞可以生長在流動通道的不同區(qū)域中或在具有在相同表面上形成的壁的不同流動通道上。為了將細胞類型分離到表面的某些區(qū)域，表面可以使用不同的蛋白和/或SAM分子處理，以促進某種細胞類型在某區(qū)域生長。其他方法可以用于產(chǎn)生親細胞區(qū)域。例如，熱聚物(thermopolymer)基底可以使用氧等離子體來處理以增強親細胞性，并且任意未處理的區(qū)域?qū)⑹鞘杓毎摹?br> [0085]然后將處理表面放置在陪替氏培養(yǎng)皿中以生長細胞(步驟510)。陪替氏培養(yǎng)皿充滿細胞懸液，并在一些實施方案中置于設(shè)置在5%C02和37° C的孵育器中(步驟512)。細胞僅粘附于蛋白涂覆的親細胞區(qū)域。將細胞培養(yǎng)至高匯合，以使當組裝時流動通道壁將覆蓋一層細胞。通常生長的用于體外腎模型的細胞包括人近端小管細胞，如來自HK-2細胞系的細胞；腎近端小管上皮細胞(RPTEC) ;Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞；和通常從小鼠或大鼠收集的原代內(nèi)髓集合管aMCD)細胞或原代近端小管細胞。在各種實施方案中，生長了干細胞衍生的細胞、腎祖細胞或由腎組織收獲的細胞。另外地或供選擇地，在一些實施方案中，用于本技術(shù)的細胞包括干細胞(例如，胚胎干細胞、成體干細胞、誘導多能干細胞)和/或內(nèi)皮細胞。可以生長來自人類、其他哺乳動物生物體或其他生物體的細胞。
[0086]一旦細胞長成，將生長細胞的培養(yǎng)基移除(步驟514)。通常地，從細胞層外的區(qū)域移除培養(yǎng)基。因此，一些水分留在具有細胞層的區(qū)域內(nèi)，但是基底的其余部分是干燥的。然后，將流動微通道在拓撲表面上方組裝(步驟516)。一旦流動微通道在拓撲表面上方，微通道可以充滿細胞培養(yǎng)基。
[0087]圖6A顯示了仿生流動通道的一個說明性實施方案的橫截面的透視圖，所述流動通道具有平行于流動通道的方向的嵴和溝。嵴和溝可以不是等比例的。如圖1所述，嵴和溝的寬度可以在20nm至5微米。例如，嵴和/或溝的寬度可以獨立地為20-40nm、30_50nm、50-100nm、100-200nm、200-400nm、400-600nm、600-800nm、800nm-l 微米。以另外的實例的方式，嵴和/或溝的寬度可以獨立地為1-2微米、2-3微米、3-4微米或4-5微米。流動通道的高度可以在100至200微米?？梢允褂酶蠡蚋〉母叨?，但是如果流動通道比100微米高窄得多時，流體通過通道的流動可能不是層流。在圖6A顯示的實施方案中，細胞層可以在流動通道的底層602以上生長，并且嵴和溝將導致細胞與通過通道的流動平行地對齊。
[0088]在圖6B顯示的實施方案中，底面和頂面兩者是結(jié)構(gòu)化的并且細胞在兩者上培養(yǎng)，這可以更好地復制體內(nèi)腎單位或另外的器官。圖6A中的底層602和圖6B中的頂層612和底層616和圖6D中的層632、636和640可以是拓撲基底，如圖2的基底202。在一些實施方案中，圖6B中的層616具有至少兩個穿過其的孔，以使流體可以通過一個孔流入流動通道，并通過另一個移除。在圖6B中，具有穿過其形成的細長的孔的中層614夾在頂層616和底層612之間。當置于頂層616和底層612之間時，細長的孔的側(cè)壁形成流動通道的側(cè)壁。
[0089]圖6C顯示了仿生流動通道的另一個說明性的實施方案的橫截面的透視圖，所述流動通道具有垂直于流動通道的方向的嵴和溝。嵴和溝可以不是等比例的。圖6C的拓撲圖和流動通道的尺寸范圍與圖6A中給出的范圍相同。細胞層將在該流動通道的底層622以上生長，并且嵴和溝將導致細胞與通過通道的流動方向垂直地對齊。通道的頂面和/或側(cè)面還可以是結(jié)構(gòu)化的并具有生長在其上的細胞(未顯示)。
[0090]如在圖6C的右側(cè)可以觀察到的，底層622的整個頂面是結(jié)構(gòu)化的，具有嵴和溝。由于流動通道的側(cè)面可以不密封，流過流動通道的流體可以通過由溝產(chǎn)生的孔628從流動通道的側(cè)面滲出。因此，在一些實施方案中，拓撲表面僅在將形成流動通道的壁的部分表面上形成；表面的其余部分是光滑的。這可以通過使用光掩模來實現(xiàn)，所述光掩模完全覆蓋基底表面，除了將成為流動通道壁的區(qū)域。當組裝流動通道時，結(jié)合到流動池或側(cè)壁的光滑表面將在流動通道的側(cè)面沿其長度形成密封，防止流體從側(cè)面流出嵴和溝。
[0091]圖6D說明了仿生流動通道的另一個說明性的實施方案的透視圖。在該實施方案中，底壁、頂壁和兩個側(cè)壁均為結(jié)構(gòu)化的，并且細胞在其每個上培養(yǎng)，這可以更好地復制體內(nèi)腎單位或另外的器官。在該說明性的實施方案中，結(jié)構(gòu)由平行于流動通道的方向的嵴和溝組成。在一些實施方案中，圖6D中的層632具有穿過其的至少兩個孔，以使流體可以通過一個孔流入流動通道，并通過另一個移除。當壁636夾在頂層632和底層640之間時，形成細長的孔。細長的孔的側(cè)壁形成流動通道的側(cè)壁。
[0092]圖7顯示嵴和/或溝寬度具有變化的拓撲圖案的數(shù)個實施方案。圖7A是在其拓撲圖案中具有漸變的基底的透視圖。嵴和溝的寬度穿過表面從左到右變窄。流動通道可以在基底上方組裝，以導致流體與溝平行地或垂直地流動。在一些實施方案中，嵴的寬度保持恒定而溝的寬度改變；在其他實施方案中，溝的寬度保持恒定而嵴的寬度變化。拓撲圖案具有變化的表面可以用于實驗，以檢查不同嵴和/或溝寬度對特定類型的細胞的影響。此外，對于體內(nèi)的結(jié)構(gòu)的區(qū)域中具有變化的細胞特征的器官結(jié)構(gòu)，如圖7A中所示的平穩(wěn)地改變表面拓撲圖可以用于產(chǎn)生模擬這樣的特征的流動通道。
[0093]圖7B、7C和7D是其拓撲圖案沿著通道具有變化的流動通道表面的頂視圖。流動通道可以不是等比例的。穿過通道的流動方向是朝向頁面下方的，如圖7D的右側(cè)箭頭所示。在其他實施方案中，流體可以在相反的方向上流動。圖7B是具有兩個不同區(qū)域702和704的表面的頂視圖，所述兩個不同區(qū)域具有不同的溝寬度。上部區(qū)域702具有更窄的溝寬度，以使溝和嵴約為相同的寬度。下部區(qū)域704具有比上部區(qū)域702明顯更寬的溝。在下部區(qū)域704中的溝也比嵴寬。具有兩個不同的拓撲區(qū)域的流動通道可以用于模擬具有兩種不同細胞類型或細胞排列的體內(nèi)結(jié)構(gòu)。例如，腎小管具有沿其長度改變的細胞類型，并且腎小管的基底膜中的變化可以通過改變流動通道的拓撲圖在體外進行模擬。
[0094]圖7C的溝也是朝向流動通道的末端更寬；然而，嵴呈扇形分散以使溝平穩(wěn)地變寬，沿著通道而不是不同的區(qū)域在窄溝和更寬的溝之間產(chǎn)生平穩(wěn)的過渡。具有一個或多個該類型的側(cè)面的流動通道可以用于模擬在結(jié)構(gòu)中的細胞類型或細胞排列具有漸變的體內(nèi)結(jié)構(gòu)。具有該類型的拓撲圖的流動通道還可以用于實驗，以檢查不同嵴和/或溝寬度對特定類型的細胞的影響 。
[0095]圖7D是具有彼此不同的恒定拓撲圖712和716的兩個區(qū)域和介于恒定拓撲圖的兩個區(qū)域之間的過渡區(qū)域714的非矩形通道的頂視圖。流動通道712的起始端具有窄的寬度和窄的溝，并且流動通道716的末端更寬并且具有更寬的溝。所有區(qū)域712、714和716具有相同數(shù)量的嵴。如果在圖7D的表面上方的流動通道具有恒定的高度，那么由于第一區(qū)域712比最后的區(qū)域716的通道寬度更小并且流速更高，因此在第一區(qū)域712中所經(jīng)歷的剪切應(yīng)力將比在最后的區(qū)域716中的剪切應(yīng)力更高。該作用可以供選擇地通過改變通道高度來實現(xiàn)。當幾何形狀改變時，過渡區(qū)域714幫助維持層流。在圖3、4和5中描述的制造方法可以用于建立具有圖7所示的任何拓撲圖和幾何形狀的流動通道裝置。
[0096]表面拓撲圖可以具有除了圖6和7中所示的直角嵴和溝以外的圖案。一些可能的拓撲表面顯示于圖8A至8C中，圖8A至8C為具有不同拓撲圖案的三種基底的透視圖。圖8A顯示由窄溝隔開的三角形的嵴。邊緣可以比圖8A所顯示的更圓。圖SB顯示了圓形柱的隨機陣列。圖8C顯示了柱的線性陣列。圖8D顯示了倒置的圓錐形凹陷的線性陣列。圖SE顯示了圓錐形柱的線性陣列。圖8F顯示了倒置的半球形凹陷的線性陣列?？梢詫挿旱胤诸悶榘枷莺椭娜我饨Y(jié)構(gòu)可以排列成隨機或線性陣列。此外，圖8不旨在包括所有可能的凹陷和柱的設(shè)計，而是提供了可能的設(shè)計的說明。凹陷和柱家族還可以包括但不限于，柱、圓錐、半球、圓角凹陷(filleted pit)和倒角柱(chamfered post)。由于不同類型的細胞可以具有不同的體內(nèi)環(huán)境并且可以對仿生信號(cue)作出不同的應(yīng)答，因此所選擇的拓撲圖取決于所培養(yǎng)的細胞類型。雖然嵴和溝已顯示提供導致腎細胞對齊的仿生信號，但細胞外基質(zhì)在身體的不同部分是不同的，因此當在圖8所示類型的拓撲圖或另一種類型的拓撲圖上生長時，在不同器官中或甚至在腎的其他部分中的細胞可以更好地模擬其體內(nèi)特征。與圖4所示的方法相似的方法可以用于形成圖8A-8F中顯示的基底?？梢允褂闷渌夹g(shù)，特別是用于制備三角形溝或具有邊緣既不為直角也不為圓形的溝的其他圖案。如圖7所描述的，特征的尺寸和/或距離可以在不同的區(qū)域中或在漸變中沿著表面變化。此外，單一的流動通道可以具有多種類型的拓撲圖，如柱的區(qū)域和嵴和溝的區(qū)域，或散布有嵴和溝的柱。
[0097]圖9A和9B顯示了仿生流動通道的兩種示例性的用途。圖9A為用于使用仿生流動通道(如圖2的裝置200)的方法900的流程圖，以檢查潛在毒素的細胞毒性。該方法在高通量藥物篩選中是有用的，研究人員可以在投資化合物的進一步的藥物開發(fā)之前篩選細胞毒性化合物。對于毒性測試，根據(jù)圖3的步驟310所述的方法，將對某種類型的細胞具有潛在毒性的材料以一定濃度放置在溶液中，并通過含有該類型的細胞的培養(yǎng)物的流動通道流動(步驟902)。在一些實施方案中，特別是如果潛在的毒素難以生產(chǎn)或難以獲得時，注入系統(tǒng)包括注入閥，所述注入閥在緩沖流體在流動通道內(nèi)建立層流后釋放潛在的毒素。使用注入閥使實驗中消耗的潛在毒素的量降至最低。如果觀察設(shè)備指向流動通道，那么當潛在的毒素通過通道流動時，可以分析樣品。
[0098]根據(jù)圖3的步驟312所描述的方法，在潛在地有毒的溶液已經(jīng)流動通過通道后，漂洗并固定細胞(步驟904)以保存實驗結(jié)果用于觀察。然后將染色劑或熒光標記在拆卸流動通道之前或之后施加到細胞，以增加成像對比度(步驟906)?？梢允褂眠m于細胞類型和觀察設(shè)備的任何染色方法，如蘇木精和伊紅(H&E )染色、銀染色或免疫熒光染色。在一些實施方案中，染色劑為不能穿過健康細胞的細胞膜的活體染料，如臺盼藍或碘化丙錠。將活體染料引入具有潛在的毒素的流動通道。如果化合物是有毒的，其可以導致細胞膜的破裂并允許染料穿過膜并使細胞染色。
[0099]一旦流體已經(jīng)流動通過通道并制備細胞，分析細胞以確定潛在的毒素的毒性。在各種實施方案中，使用通透性分析(permeability assays)、細胞活性分析、代謝活性分析或活/死分析確定毒性。如果物質(zhì)是有毒的，其可以導致細胞經(jīng)歷壞死，導致細胞停止生長和分裂或?qū)е录毎蛲?。?jīng)歷壞死的細胞可以迅速膨脹，失去膜完整性，停止代謝并釋放其內(nèi)容物。如以上所述，活體染料的`使用可以顯示這樣的影響?；铙w染料染色和/或細胞死亡的其他影響可以使用例如光學顯微鏡、電子顯微鏡或數(shù)字全息顯微鏡觀察?？梢栽趯嶒炦^程中或?qū)嶒灪笫褂糜糜诖_定細胞生活力的其他技術(shù)。細胞計數(shù)器，如CASY計數(shù)器或Coulter計數(shù)器,可以計數(shù)存活細胞的數(shù)量。如果細胞下的表面包括金電極,基于電細胞-基底阻抗傳感器(ELECTRIC CELL-SUBSTRATE IMPEDENCE SENSING (ECIS))的方法可以用作細胞的匯合、形狀和代謝的傳感器。
[0100]圖9B是使用仿生流動通道(如圖2的流動通道212)以檢查潛在的治療劑的功效的方法950的流程圖。方法950可以用于高通量篩選中，以確定潛在的藥物化合物是否可以具有治療效果。對于功效測試，根據(jù)圖3的步驟310所述的方法，將可能對流動通道中某種類型的細胞有益的化合物以一定濃度放置在溶液中，并通過流動通道流動(步驟952)。在一些實施方案中，特別是如果化合物難以生產(chǎn)或難以獲得時，注入系統(tǒng)可以包括注入閥，所述注入閥在緩沖流體在流動通道內(nèi)建立層流后釋放該化合物。如果觀察設(shè)備指向流動通道，那么當化合物通過通道流動時，可以分析樣品。[0101]根據(jù)圖3的步驟312所描述的方法，在溶液已經(jīng)流動通過通道后，漂洗并固定細胞(步驟904)以保存實驗結(jié)果用于觀察。在一些實施方案中，可以在拆卸流動通道之前或之后將染色劑或熒光標記施加到細胞，以增加成像對比度(步驟906)。可以使用適于細胞類型和觀察設(shè)備的任何染色方法，如蘇木精和伊紅(H&E)染色或銀染色。
[0102]一旦準備好細胞，對其進行分析以確定化合物對細胞具有何種作用，如果有的話。結(jié)合于特定蛋白或核酸的試劑可以施加到細胞層以確定在分析過程中蛋白或核酸的存在。潛在的治療化合物的物理作用可以使用例如光學顯微鏡、電子顯微鏡或數(shù)字全息顯微鏡觀察。感興趣的特征取決于細胞類型和所研究藥物的希望的作用。用于分析的方法應(yīng)根據(jù)研究所感興趣的細胞特征進行選擇。
[0103]雖然本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案已在本文中顯示和描述，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，這樣的實施方案僅以舉例的方式提供。本領(lǐng)域技術(shù)人員將進行許多變化、改變和替代而不背離本發(fā)明。應(yīng)懂得本文描述的本發(fā)明的實施方案的各種替代方案可以用于實踐本發(fā)明。意圖的是，以下權(quán)利要求限定本發(fā)明的范圍，并且覆蓋在這些權(quán)利要求及其等同物的范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)。
[0104]在一些實施方案中，一個或多個拓撲表面在生物人工裝置中形成，用于通過模擬腎或腎單位功能來復制或基本上復制器官功能，所述裝置如提交于2005年9月28日并于 2010 年 9 月 7 日授權(quán)的名稱為 “Systems, Methods, and Devices Relating to aCellularized Nephron Unit”的第7，790，028號美國專利中所描述的裝置。人工腎的任何特征，包括亨利袢、遠端管、集合管和相關(guān)的血管可以包括一種或多種上述的拓撲表面，以更好地復制腎的體內(nèi)條件。例如，血液流動層和/或過濾層的表面可以具有在其中形成的拓撲圖。包括可滲透水的細胞、泵鹽細胞或其它類型的細胞的細胞層可以在拓撲表面或拓撲表面的部分上生長。更具體地，選擇每個通道的拓撲圖使得生長在其上的細胞呈現(xiàn)腎的希望的部分的形態(tài)和表型。因此，在一個實施方案中，接種泵鹽細胞的通道的部分形成為具有第一納米拓撲圖，并且接種可滲透水的細胞的通道的部分形成為具有不同的納米拓撲圖。本文或第7，790，028號美國專利中所述的任何制造技術(shù)或制造技術(shù)的組合可以用于制備這樣的生物人工裝置。
[0105]示例性的生物人工裝置
[0106]以舉例的方式而不是以限定的方式提供了包括亨利袢、遠端小管和集合管的整合的生物人工腎的說明性的實施方案。示例性的裝置(及其構(gòu)件)包括用于腎細胞生長的拓撲表面和細胞生長區(qū)域，其能夠暴露于流體剪切應(yīng)力(FSS)以刺激腎細胞生長模式和細胞功能，其更加接近地模擬在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的細胞生長模式和功能。雖然本文描述了生物人工亨利袢的各種實施方案，但應(yīng)理解用于圖案化亨利袢中的細胞的拓撲生長表面和FSS特征可以應(yīng)用于生物人工腎的其它結(jié)構(gòu)，包括但不限于生物人工遠端小管和集合管。此外，雖然以下討論描述了嵴和溝，但本文公開的任意表面拓撲圖可以包括在生物人工腎的一個或多個區(qū)域中，以使細胞生長更加接近地模擬體內(nèi)系統(tǒng)的細胞生長。非限定性的示例性的拓撲圖或拓撲修飾包括改變拓撲特征的間距、改變拓撲特征相對于流體流動的方向(例如，平行于流體流動的方向，或垂直于流體流動的方向)、和包括凹陷和柱家族的拓撲圖中的任意一種或多種。此外，在不同的拓撲區(qū)域可以包括過渡表面，以允許從一種細胞排列、行為和/或形態(tài)分級地或漸變地變成另一種。[0107]如本領(lǐng)域已知的，腎的不同區(qū)域經(jīng)歷不同的剪切應(yīng)力。流速和直徑兩者均影響剪切應(yīng)力，并且兩者可以沿著腎、腎單位或小管的任意給定區(qū)域改變。不希望束縛于理論，認為由于流體沿著小管被重吸收到組織，因此流速(體積流量)通常在更高的“上游”。因此，腎單位的流速從高到低可能為以下順序:近端小管、然后是降支亨利袢、然后是亨利袢的升支、然后是遠端小管、接著是集合管的起始。剪切力可能與流速從高到低具有相同趨勢；然而，當給定區(qū)域的直徑改變時，流量和剪切力之間的相關(guān)性可能不明確。除了直徑的變化以外，當評價流量和剪切力時考慮的另一個因素是流入大血管中的更小的支流的影響。例如，集合管直徑增大，但是流速在“下游”升高。這是由于更小的支流流入了更大的血管的下游。
[0108]因此，生物人工腎可以被配置成將任何給定區(qū)域中的細胞暴露于經(jīng)歷具體的FSS或FSS系列，或FSS循環(huán)(通常為“FSS”曲線)。也就是說，將生物人工腎的第一區(qū)域中的細胞暴露于第一 FSS曲線，而可以將生物人工腎的其它區(qū)域中的細胞暴露于不同的FSS曲線。例如，在一些實施方案中，在一個或多個FSS曲線中的FSS水平為約0.02-1.0達因/cm2。在一些實施方案中，在一個或多個FSS曲線中采用約0.1達因/cm2或更低的FSS水平。在再其它的實施方案中，在一個或多個FSS曲線中使用約0.01,0.02,0.05,0.07,0.09,0.1、
0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、
8.0,9.0或高達約10.0達因/cm2的FSS水平。在一些實施方案中，一個或多個FSS曲線中使用10.0達因/cm2或更高的FSS水平。在一些實施方案中，在FSS曲線中的FSS速率在細胞生長過程中改變/波動，以實現(xiàn)希望的細胞排列、細胞圖案和/或其它希望的細胞特性(例如，改變的緊密連接蛋白的表達、細胞外基質(zhì)蛋白、希望的細胞功能等)。
[0109]A.整合裝置
[0110]在腎中，血液首先通過腎小球過濾，濾液流出腎小球并進入近端小管，然后進入亨利袢，然后進入遠端小管和集合管。根據(jù)一個實施，本發(fā)明的仿生裝置用于替代亨利袢、遠端小管和集合管，提供腎小球和近端小管的功能。圖10顯示了根據(jù)該實施的說明性的整合裝置的示意圖。如顯示的，圖10的裝置100包括模擬亨利袢的生物人工袢10、遠端小管20和集合管30，其均互相連通以替代其生物對應(yīng)物?？梢韵蜻@些結(jié)構(gòu)中的每一個提供拓撲特征以使在其中的細胞生長具體地圖案化。此外，可以設(shè)計不同結(jié)構(gòu)(例如，亨利袢、遠端小管和集合管)使得在該結(jié)構(gòu)中的細胞暴露于流體剪切應(yīng)力，借以進一步在位置上和功能上使在該結(jié)構(gòu)中的細胞圖案化。
[0111]如所說明的，裝置100包括血液流動層200和過濾層300，和置于兩層200和300之間的膜。如所顯示的，血液流動層200包括袢10的血液流動層210，集合管30的血液流動層230和遠端小管20的血液流動層220 ;血液流動層200的三個組件:血液流動層210、220和230基本上位于一個平面。在供選擇的實施方案中，組件血液層210、220和230形成基本上三維的網(wǎng)絡(luò)或基本上位于兩個或多個平面上。血液流動層200進一步包括在其中形成的微流體通道或微通道，其允許血液從血液入口 110流入裝置100并通過血液出口 120流出裝置。
[0112]如所說明的，裝置100包括過濾層300，所述過濾層300也包括三個組件，袢10的過濾層310、集合管30的過濾層330和遠端小管20的過濾層320。類似地，這些組件過濾層可以位于相同的平面或位于多個平面中。類似地，這些組件過濾層可以形成基本上三維的網(wǎng)絡(luò)。過濾層300還包括在其中形成的微流體通道或微通道，其允許濾液從濾液入口 130流入裝置100并通過濾液出口 140流出裝置。
[0113]在涉及三維微流體網(wǎng)絡(luò)的某些實施方案中，采用垂直連接或垂直氣孔以使網(wǎng)絡(luò)中的不同層彼此流體連通。“垂直連接”或“垂直氣孔” 一般地是指垂直地將一層中的一個微通道與相同層或第二層中的至少另一個微通道連接的部分或完整通孔。垂直連接一般地基本上垂直于其所連接的層或微通道。中空纖維可以加入裝置和系統(tǒng)中以形成這樣的垂直氣孔。
[0114]還如所說明的，裝置100包括膜。膜包括三個組件，袢10的膜410、遠端小管20的膜420和集合管30的膜430。組件膜410、420和430各自位于其各自的組件血液流動層和組件過濾層之間。如所說明的，組件膜410、420和430彼此分離。在供選擇的實施方案中，組件膜410、420和430可以是單張膜的部分。
[0115]如所顯示的，膜和其組件具有暴露于血液流動層200的頂面，和暴露于過濾層300的底面。
[0116]在某些實施方案中，膜及其組件是半滲透的。優(yōu)選地，膜的孔徑比細胞直徑小，使得細胞不能穿過(即，對動物細胞具有低滲透性)，而低分子量的營養(yǎng)物和流體可以穿過(即，對營養(yǎng)物具有高滲透性)。細胞大小不同，但是一般地為微米級。在某些實施方案中，膜由血液相容性材料制成。優(yōu)選地，平均膜孔徑為亞微米級，以確保有效地篩選細胞。半滲透膜包括大量不同的膜類型和形態(tài)，其可以分類如下:(1)由在密集的聚合物基質(zhì)中的圓柱形通孔組成的徑跡蝕刻膜，其通常通過離子蝕刻制成；或(2)纖維膜，其通過聚合物纖維的各種沉積技術(shù)制成。雖然這些膜不具有明確限定的孔拓撲圖，但制備方法被充分限定，以使纖維膜具有具體的分子量界限。徑跡蝕刻型膜是優(yōu)選的，因為他們限制了在一個維度上的流體運動。優(yōu)選地，流體運動是在垂直方向上的。纖維膜允許在橫向上和垂直地流體運動。
[0117]可以采用任意合適的方法來提供合適的多孔膜，所述方法包括本領(lǐng)域已知的那些和在所引用的美國專利和專利申請(如第6，942，879號、第6，455，311號美國專利，和第20060136182 號、第 20`050238687 號、第 20050202557 號、第 20030003575 號、第 20020182241號美國專利申請)以及其他參考文獻中描述的那些。
[0118]B.包括拓撲表面和FSS區(qū)域的生物人工亨利袢刺激腎細胞生長模式更接近地模擬體內(nèi)系統(tǒng)
[0119]1.一般結(jié)構(gòu)
[0120]亨利袢的一個基本功能是產(chǎn)生高濃度的尿素、鹽和其它溶質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的一個說明性實施方案模擬亨利袢的功能的生物人工袢描繪于圖11中。顯示于圖11中(還作為組裝裝置的部分描繪于圖10中)的說明性的生物人工亨利袢包括大體上U-形的微流體通道，所述微流體通道具有在相應(yīng)的過濾層310中形成的降支18和升支20以將濾液流從濾液入口 130攜帶通過出口 132。此外，生物人工袢10包括生物人工血管，所述生物人工血管也包括在相應(yīng)的血液流動層210中形成的降支12和升支14以將血流從血液入口 110攜帶通過出口 112。位于支12和14的大部分之間的多孔介質(zhì)16允許在血液流動層的兩個支12和14之間擴散。如圖12所示，兩個支12和14之間的連通有助于血液流動層210的逆流系統(tǒng)在血液流動層210的微通道的尖端28處產(chǎn)生高濃度的血液。
[0121]在示例性的實施方案中，單一的生物人工血管與圖13所示的大體上U-形的小管通過袢膜410偶聯(lián)，以制備生物人工亨利袢10。[0122]如圖11和13所示，根據(jù)說明性的實施方案，該生物人工亨利袢10在兩個微制造層210和310上形成，所述兩個微制造層210和310被可滲透水分和蛋白(多孔)的膜410隔開。如圖12所示，腎小球濾液在一層(濾液層310)中循環(huán)，而血液在另一層(血液流動層210)中循環(huán)。
[0123]生物人工袢10，特別是在濾液層310中的大體上U-形的微通道，還可以如圖14所示包括多個腎上皮細胞。降支18包括或內(nèi)襯通常僅允許水分通過的細胞22。升支20內(nèi)襯細胞24，所述細胞24將NaCl泵出小管或微通道且通常不允許水分通過。這些還一般地分別稱為容水性(water-permissive)或可滲透水的細胞和泵鹽細胞。根據(jù)一個特征，通過具有適當?shù)乜蓾B透的微通道壁將鹽泵出升支小管并循環(huán)液流的行為產(chǎn)生逆流倍增器(countercurrent multiplier)。在這樣的排列中，在u_形尖端26處的溶質(zhì)濃度變得比在入口 130和出口 132處的濃度高得多。在特定的實施方案中，大體上U-形的微通道具有不同的深度或直徑，其中微通道具有大體上圓柱形的形狀。例如，升支20可以比降支18更厚。在一個示例性的實施方案中，升支20具有大體上圓柱形的形狀和約60微米的直徑，而降支18具有大體上圓柱形的形狀和約12微米的直徑。
[0124]認為在生物或天然亨利袢中的泵鹽細胞通常不如在腎近端小管中發(fā)現(xiàn)的那些有功效。根據(jù)一個方法，選擇在腎近端小管細胞的通?？山邮艿乃俾实?0-90%下泵NaCl的細胞包括在生物人工袢10的升支20中。因此，它們在1.6xl0^6mmol/s/cm2或更高的速率下泵Na+。
[0125]2.在升支和降支內(nèi)的拓撲表面和FSS
[0126]因此，根據(jù)一個說明性的實施方案，本發(fā)明的人工亨利袢結(jié)構(gòu)包括具有升支和降支的微通道，其包括用于腎細胞生長的一個或多個拓撲表面。在一個非限定性的實例中，表面包括嵴/溝拓撲圖。在特定的實施方案中，嵴和溝為約0.75 μ m寬和0.75 μ m深，具有約1.5 μ m的間距。技術(shù)人員將理解的是，本文描述的供選擇的表面拓撲圖可以在任一個支或兩個支中構(gòu)造，產(chǎn)生改變的或供選擇的細胞圖案。
[0127]在一些實施方案中，拓撲細胞生長表面涂覆有細胞外基質(zhì)蛋白，如IV型膠原，所述細胞外基質(zhì)蛋白吸附到包括例如十六烷硫醇分子的自組裝單層(SAM)。隨后將腎細胞(例如，HK-2細胞)接種到生長表面上，并且在一些實施方案中，細胞經(jīng)受0.01 - 10.0達因/cm2的FSS。細胞可以在生長過程中、匯合后或在生長的過程中和在細胞匯合處兩者暴露于FSS0另外地或供選擇地，F(xiàn)SS可以連續(xù)地或周期性地施加到細胞。在一些實施方案中，采用
0.02-1.0達因/cm2的FSS。在再其它的實施方案中，使用約0.01,0.02,0.05,0.07,0.09、
0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、
7.0,8.0,9.0或10.0達因/cm2的FSS。在一些實施方案中，F(xiàn)SS速率在細胞生長過程中改變/波動，以實現(xiàn)希望的細胞對齊、細胞圖案和/或其它希望的細胞特性(例如，改變的緊密連接蛋白的表達、細胞外基質(zhì)蛋白、希望的細胞功能等)。如本領(lǐng)域已知的，腎單位的不同區(qū)域(例如，亨利袢、集合小管和遠端小管的不同區(qū)域)經(jīng)歷不同的剪切應(yīng)力。因此，生物人工腎可以被配置成將任何給定的區(qū)域中的細胞暴露于經(jīng)歷具體的FSS或FSS系列，或FSS循環(huán)。
[0128]如實施例1所示，與在沒有FSS的空白的、非結(jié)構(gòu)化的表面上生長的細胞相比，在這樣的條件下(即，在拓撲基底和在FSS下)的腎細胞生長在低至0.02達因/cm2和高至1.0達因/cm2的剪切應(yīng)力下產(chǎn)生具有增強的對齊、粘附特性和/或緊密連接特性的細胞。通過本技術(shù)的方法生長的細胞更加接近地模擬在體內(nèi)環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的那些，并且因此比在“標準”條件下(例如，在平坦的或非結(jié)構(gòu)化的表面上并且在沒有FSS的條件下)生長的細胞更優(yōu)越地用于生物人工裝置，如人工腎單位或其部分。
[0129]在以上例示的生物人工亨利袢中，升支將內(nèi)襯在約1.6xl(Tmmol/s/cm2下主動運輸Na+并阻斷其它運輸?shù)募毎⑶医抵?nèi)襯允許運輸水分并阻斷或基本上阻斷大部分(如果不是全部)其它種類(包括蛋白和濾液中的其它分子)的運輸?shù)募毎?。由于細胞將在拓撲表面上生長并暴露于FSS，因此預期細胞圖案、粘附和/或緊密連接性質(zhì)將不僅在細胞水平上影響生物人工裝置的整體結(jié)構(gòu)(參見例如，實施例1)，而且還將影響裝置的功能。基于與其他細胞的鄰近度并且暴露于FSS，將促進細胞更加像其體內(nèi)對應(yīng)物發(fā)揮作用。因此，細胞功能將更加接近地模擬體內(nèi)細胞功能。
[0130]如以上所述，相似的拓撲特征可以設(shè)計在遠端小管和集合管中，并且在這些結(jié)構(gòu)中的腎細胞可以同樣地暴露于FSS以刺激希望的圖案。
實施例
[0131]提供了以下實施例以更加完整地說明本技術(shù)的各種實施方案。這些實施例決不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。
[0132]實施例1-流體剪切應(yīng)力增強細胞與拓撲圖案的對齊
[0133]A.仿生流動裝置
[0134]構(gòu)建了包括嵴/溝特征的本技術(shù)的仿生流動裝置。流動裝置的結(jié)構(gòu)顯示在圖15A-D中。流動裝置包括流體通道的陣列以控制流體剪切應(yīng)力(FSS)和具有控制的表面特性的細胞基底。拆卸的(圖15B)和組裝的(圖15C)裝置包括兩層:微模塑通道和在拓撲上圖案化的基底，所述基底使用E CM蛋白處理以提示細胞粘附和功能。裝置的橫截面說明了在微流體通道內(nèi)并粘附于拓撲基底的腎小管細胞的匯合層(圖15D)。在通道內(nèi)并粘附到ECM涂布的區(qū)域的細胞的相襯圖像(圖15E)。
[0135]將拓撲特征從鎳合金模具熱壓到聚苯乙烯基底(分別為圖16A和B)。聚苯乙烯基底的邊緣輪廓顯示了限定的嵴/溝特征(圖16C)。嵴和溝為0.75 μ m寬和0.75 μ m深，具有
1.5 μ m的間距(比例尺，I μ m)。
[0136]B.流動i秀導的剪切應(yīng)力表征
[0137]流動裝置的表征表明通道設(shè)計會向細胞粘附區(qū)域提供已知的和均勻的FSS。使用COMSOL Multiphysics軟件的計算模型模擬預測在細胞粘附區(qū)域和大部分基底表面區(qū)域上方的均勻的剪切應(yīng)力(數(shù)據(jù)未顯示)。COMSOL模擬預測穿過細胞粘附區(qū)域和大部分基底表面區(qū)域的均勻的剪切應(yīng)力。剪切應(yīng)力分布顯示了在通道的入口和出口處的更高的剪切應(yīng)力，所述更高的剪切應(yīng)力在包括圓形細胞粘附區(qū)域的大部分通道中快速發(fā)展為均勻的剪切應(yīng)力(數(shù)據(jù)未顯示)。穿過腔室底板在距離入口 12.5mm處作剪切應(yīng)力輪廓圖，并且該圖表明，穿過通道的寬度，剪切應(yīng)力改變小于5% (數(shù)據(jù)未顯示)。
[0138]C.細胞粘附區(qū)域
[0139]細胞粘附區(qū)域包括吸附到十六烷硫醇分子的自組裝單層膜(SAM)的IV型膠原蛋白。簡言之，2.5mm直徑的圓形聚二甲基硅氧烷(PDMS)壓模的表面使用ImM的十六烷硫醇溶液(HDT的200標準乙醇(200prOOfethanOl)溶液)涂飾。將溶液壓模到拓撲表面(基底)上并穩(wěn)固地保持30秒。30秒之后釋放壓模。然后，使用2mM PEG(在200標準乙醇中)回浸表面2小時。通過抽吸去除PEG溶液，并使用乙醇徹底漂洗表面。然后，在室溫下在30μ8/ml IV型膠原溶液(在PBS中)中孵育基底3小時。通過抽吸去除膠原溶液，并使用PBS徹底漂洗基底。
[0140]SAM提供了一個示例性的模型化學，所述模型化學提供了細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的一致的和可表征的吸附，產(chǎn)生對粘附細胞的可重復的基于ECM的信號。SAM還使通過微接觸印刷(μ CP)對表面的化學圖案化成為可能，其允許在諸如多表型共培養(yǎng)和細胞形態(tài)影響等的應(yīng)用中選擇性放置細胞。如通過SEM所檢查到的，IV型膠原涂層覆蓋嵴的頂部以及溝內(nèi)的表面兩者(數(shù)據(jù)未顯示)。拓撲圖案化和μ CP的組合允許物理和化學圖案兩者的不同控制以根據(jù)使用者指定的配置提示細胞。
[0141]如下將人腎近端小管上皮細胞(ΗΚ-2細胞；ATCC CRL-2190)接種在裝置的功能化的嵴/溝表面上并生長至匯合。將細胞懸液溶液(包含培養(yǎng)基和HK-2)置于包含拓撲和化學圖案化的基底的陪替氏培養(yǎng)皿中以使初始接種密度為300個細胞/mm2。培養(yǎng)基是補充了 0.5%FBS、10ng/mLhEGF、5 μ g/mL 胰島素、0.5 μ g/mL 氫化可的松、0.5 μ g/mL 腎上腺素、
6.5ng/mL三碘甲狀腺原氨酸、10 μ g/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、100U/ml青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將細胞置于37°C和5%C02的孵育器中。每隔一天更新培養(yǎng)基。細胞在3-4天內(nèi)達到匯合。 然后，在與如以上描述的相同的條件下，將細胞暴露于0、0.02或
1.0達因/cm2FSS下2小時。
[0142]P.結(jié)果
[0143]結(jié)果顯示在圖17中。在結(jié)構(gòu)化的基底上的細胞顯示與溝對齊，而在空白的基底上的細胞則沒有(圖17A ;箭頭表明在拓撲基底上的溝的方向)。由于溝和FSS的存在，在10°內(nèi)與溝對齊的細胞核的百分比顯著增加(圖17B)。關(guān)于圖12B:前三個條代表在空白(非結(jié)構(gòu)化的)基底上生長并暴露于0、0.02或1.0達因/Cm2FSS的細胞。后三個條代表在結(jié)構(gòu)化的基底上生長并暴露于0、0.02或1.0達因/Cm2FSS的細胞。I達因/cm2FSS的存在顯著增加了粘附到拓撲基底上的細胞的核的對齊。在0.02達因/Cm2FSS下也觀察到了實質(zhì)性改
進。數(shù)據(jù)表示為平均值土標準偏差。*，P〈0.001與空白相對，τ =0樣品，t，P〈0.005與拓
撲相對，τ=0基底。(比例尺，30 μ m)。
[0144]剪切應(yīng)力和拓撲圖兩者均影響HK-2細胞中緊密連接(“TJ”)的形成。TJ形成的強度通過在FSS條件下定量在空白和拓撲基底上的細胞周長周圍的ZO-1強度來測量。對ZO-1進行如下可視化。使用0.5%Triton X-100的PBS溶液滲透化細胞，接著使用1%BSA在室溫下封閉30分鐘。將細胞與第一抗體(Z0-1594, Invitrogen)—起在室溫下孵育I小時。采用PBS清洗細胞三次并與第二抗體(山羊抗小鼠IgG, Alexa Fluor488, Invitrogen)—起在室溫下孵育I小時。采用PBS洗滌細胞三次并將蓋玻片固定在具有ProLong Gold plusDAPI (InvitiOgen)的載玻片上并且在顯微分析之前允許固化過夜。圖像分析包括使用常規(guī)計算機成像程序測量ZO-1標記的強度以測定ZO-1的熒光強度。對于細胞的所有邊界定量強度并且也定量連接的連續(xù)性。
[0145]結(jié)果顯示在圖18和19中，圖18A和B顯示了在空白和拓撲基底上培養(yǎng)并暴露于
0、0.02或1.0達因/Cm2FSS的細胞的ZO-1表達的代表性圖像。隨著拓撲圖和FSS刺激物的添加，ZO-1邊緣的形態(tài)從間斷過渡到連續(xù)的。箭頭表明了嵴/溝拓撲圖的方向。圖19A顯示了沿細胞周長整合并通過細胞周長、定量的緊密連接表達和分布歸一化的ZO-1強度。與那些在空白表面上培養(yǎng)的細胞相比，在拓撲基底上培養(yǎng)的細胞的ZO-1強度顯著增加。與暴露于τ =0條件的拓撲基底上的細胞相比，在拓撲基底上的暴露于所有水平的FSS的細胞顯示ZO-1強度顯著增加。圖19C顯示了沿細胞周長測量的ZO-1強度的標準偏差并定量了緊密連接的連續(xù)性。與在空白表面上的細胞相比，所有拓撲樣品的ZO-1強度的標準偏差降低并且對暴露于拓撲基底和FSS兩者的細胞群體來說最低。在兩個小時的FSS之后，在空白表面上的細胞群體不存在ZO-1強度差異。數(shù)據(jù)表示為平均值土標準偏差。*，Ρ〈0.05與空白相對，τ=0樣品；#，P〈0.001與空白相對，τ=0樣品；卞，P〈0.001與拓撲相對，τ =0樣品。(比例尺，15 μ m)。
[0146]當施加拓撲圖和FSS時，如通過Z0-1TJ所定義的細胞周長過渡到具有更多的熒光信號的更高強度。全部的熒光信號以及熒光信號的位置表明了升高的ZO-1表達和細胞周長的遷移。在細胞周長周圍的ZO-1強度的標準偏差充當TJ連續(xù)性的可量化的度量標準。更低的標準偏差轉(zhuǎn)換為更加連續(xù)的ZO-1周長。如通過ZO-1強度標準偏差所測量的，伴隨拓撲圖和FSS的施加，細胞周長從更加間斷的形態(tài)過渡到連續(xù)的形態(tài)?？傊琓J強度和連續(xù)性的升高表明使用拓撲基底和FSS暴露生長的細胞向質(zhì)量屏障功能前進，并向小管特異性功能移動。在拓撲基底上細胞對FSS響應(yīng)的增強表明這兩種物理刺激物的協(xié)同影響。通過仿生流動裝置提示的 細胞很可能是穩(wěn)定的以形成具有腎近端小管的自然過濾行為的發(fā)育良好的、高度功能化的上皮層，所述仿生流動裝置顯示ZO-1標記的TJ的高的和連續(xù)的強度。
【權(quán)利要求】
1.一種生物人工腎，其包括: 微流體流動通道，其包括至少一個拓撲表面； 與流動通道流體連通的入口，用于允許流體流入所述流動通道；和 接種在所述拓撲表面上的腎細胞；其中 選擇所述流動通道的表面的拓撲圖，以使所述腎細胞形成置于所述表面以上的細胞層，以實現(xiàn)通過至少一個表面的拓撲圖至少部分地確定的排列、行為或形態(tài)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物人工腎，其中選擇所述表面的拓撲圖以促進細胞層中的細胞與至少一個表面的粘附增加。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物人工腎，還包括流體源，用于使流體經(jīng)由入口流動通過流動通道，其中所述流體誘導在細胞層上的剪切應(yīng)力。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所 述的生物人工腎，其中所述流動通道形成為一種或多種結(jié)構(gòu)的部分，所述結(jié)構(gòu)選自亨利袢、集合小管和遠端小管。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物人工腎，其中所述流體源配置成使流體以一定流速流動，所述流速在生物人工腎的至少一個區(qū)域中產(chǎn)生在細胞層上的一定水平的剪切應(yīng)力，所述剪切應(yīng)力的水平小于或等于約10.0達因/Cm2。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物人工腎，其中所述流體源配置成使流體以一定流速流動，所述流速在生物人工腎的至少一個區(qū)域中產(chǎn)生在細胞層上的一定水平的剪切應(yīng)力，所述剪切應(yīng)力的水平小于或等于約1.0達因/Cm2。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物人工腎，其中所述流體源配置成使流體以一定流速流動，所述流速在生物人工腎的至少一個區(qū)域中產(chǎn)生在細胞層上的一定水平的剪切應(yīng)力，所述剪切應(yīng)力的水平小于或等于約0.1達因/cm2。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物人工腎，其中所述流體源配置成使流體以一定流速流動，所述流速在生物人工腎的至少一個區(qū)域中產(chǎn)生在細胞層上的一定水平的剪切應(yīng)力，所述剪切應(yīng)力的水平為約0.02達因/cm2。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物人工腎，其中所述流體通道如此配置，使得流體在生物人工腎的第一區(qū)域以第一流速流動，并且在生物人工腎的第二區(qū)域以第二流速流動。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生物人工腎，其中所述第一流速產(chǎn)生在第一區(qū)域中的細胞層上的第一水平的剪切應(yīng)力，并且其中所述第二流速產(chǎn)生在第二區(qū)域中的細胞層上的第二水平的剪切應(yīng)力，并且其中所述第一和第二水平的剪切應(yīng)力是不同的。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生物人工腎，其中所述生物人工腎包括亨利袢，所述亨利袢包括升支和降支，并且其中第一區(qū)域是所述亨利袢的升支，而第二區(qū)域是所述亨利袢的降支。
12.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生物人工腎，其中所述生物人工腎包括集合管、遠端小管和予利祥，所述予利祥包括升支和降支，其中弟一區(qū)域在予利祥中，而弟二區(qū)域在集合管和遠端小管中的一個或多個中。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物人工腎，其包括第一和第二表面，其中所述流動通道的第一表面具有第一拓撲圖，并且其中所述流動通道的第二表面具有第二拓撲圖。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的生物人工腎，其中所述生物人工腎包括亨利袢，所述亨利袢包括升支和降支，其中所述第一表面在亨利袢的升支中，并且其中所述第二表面在亨利袢的降支中。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的生物人工腎，其中所述生物人工腎包括集合管、遠端小管和亨利袢，所述亨利袢包括升支和降支，其中第一表面在亨利袢中，并且其中第二表面在集合管和遠端小管中的一個或多個中。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的生物人工腎，其包括在第一和第二表面之間的過渡拓撲表面。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的生物人工腎，其中所述第一表面的拓撲圖包括具有第一間距的嵴，并且所述第二表面的拓撲圖包括具有第二間距的嵴。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的生物人工腎，其中所述第一表面的拓撲圖包括在相對于流體流動的第一方向上的嵴，并且所述第二表面的拓撲圖包括在相對于流體流動的第二方向上的嵴。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的生物人工腎，其中所述第一拓撲圖包括嵴，而第二拓撲圖包括凹陷和柱家族中的一種或多種拓撲圖。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物人工腎，其中所述表面的拓撲圖包括嵴，所述嵴的寬度為約5 μ m或更小。
21.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物人工腎，其包括置于基底的一部分上的親細胞性物質(zhì)，用于在基底的所述部分中生長細胞層，并且其中基底的所述部分形成流動通道的表面。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的生物人工腎，其中所述親細胞性物質(zhì)包括膠原蛋白。
23.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的生物人工腎，其中所述表面拓撲圖使得細胞層的排列、行為或形態(tài)復制腎中的細胞的排列、行為或形態(tài)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物人工腎，還包括至少第二流動通道，所述第二流動通道具有至少一個第二流動通道的表面，所述第二流動通道的表面具有在其中形成的拓撲圖。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的生物人工腎，其中所述第一流動通道與所述第二流動通道被膜隔開。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的生物人工腎，其中所述第一流動通道接種有腎上皮細胞。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的生物人工腎，其中所述第二流動通道接種有血管上皮細胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求24所述的生物人工腎，其中所述第一流動通道包括血液流動層，并且所述第二流動通道包括濾液層。
29.根據(jù)權(quán)利要求24所述的生物人工腎，其中所述第一通道的至少一個表面包括與所述第二通道中的相應(yīng)表面不同的表面拓撲圖。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的生物人工腎，其中所述第一通道中的表面拓撲圖包括與所述第二通道中的表面拓撲圖不同的間距或形狀。
31.根據(jù)權(quán)利要求24所述的生物人工腎，還包括用于使流體流動通過第一流動通道和第二流動通道的第一流體源，其中所述流體誘導第一通道中的細胞層上的第一剪切應(yīng)力和第二通道中的細胞層上的第二剪切應(yīng)力。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的生物人工腎，其中所述第一剪切應(yīng)力與所述第二剪切應(yīng)力不同。
33.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物人工腎，其中所述腎細胞包括一種或多種細胞類型，所述細胞類型選自近端小管細胞、腎近端小管上皮細胞、Madin-Darby犬腎細胞、原代內(nèi)髓集合管細胞、原代近端小管細胞、胚胎干細`胞、成體干細胞、誘導多能干細胞和內(nèi)皮細胞。
【文檔編號】C12M3/00GK103764190SQ201280037209
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2012年6月15日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月15日
【發(fā)明者】約瑟夫·L·查萊斯特, 埃爾斯·弗羅利希, 杰弗里·T·伯恩斯坦 申請人:查爾斯斯塔克布料實驗室公司