Dusp-9基因在檢測腎透明細胞癌中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明DUSP-9基因在檢測腎透明細胞癌中的應用，屬于基因工程【技術領域】。所述應用是指通過RT-PCR反應對樣本腎組織與正常腎組織中的DUSP-9基因的mRNA表達量進行對比，當樣本中mRNA表達量低于正常的mRNA表達量時，該樣本為腎透明細胞癌樣本；或通過對腎組織樣本進行免疫組化測定，當腎組織樣本的染色指數≤4時，該腎組織樣本中DUSP-9低表達，該樣本為腎透明細胞癌樣本。本發(fā)明具有以下優(yōu)點：(1)、通過實驗揭示了DUSP-9基因在腎透明細胞癌患者中低表達，為腎透明細胞癌患者的診斷提供了一種新的診斷性指標；(2)、本發(fā)明通過實驗揭示了DUSP-9基因可以作為判定DUSP-9預后的獨立性指標。
【專利說明】DUSP-9基因在檢測腎透明細胞癌中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及DUSP-9基因在檢測腎透明細胞癌中的應用。
【背景技術】
[0002]腎透明細胞癌(ccRCC)是全球范圍分布的一種常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤。盡管近年來ccRCC治療上有巨大的提升，但是發(fā)病率仍在逐漸升高，30%的ccRCC患者最初表現(xiàn)為轉移，高達40%的患者經歷腎切除術仍發(fā)展為局部復發(fā)或轉移。雖然已經發(fā)現(xiàn)環(huán)境和遺傳因素與ccRCC的發(fā)生是相關的，但ccRCC發(fā)生和發(fā)展的具體分子機制仍不清楚。DUSP-9(雙特異性磷酸酶-9)屬于雙特異性蛋白磷酸酶亞科。DUSP-9是促分裂原活化蛋白激酶家族中的一個負調節(jié)酶(如:ERK，JNK, p38)，它與細胞的增殖和分化相關。大規(guī)模平行測序研究已經證明了 ccRCC患者中DUSP-9的表達是下調的。然而，目前沒有公開發(fā)表的相關報告。因此，DUSP-9的表達水平和臨床重要性之間的關系尚需闡明。我們本次研究主要是想探究ccRCC患者中DUSP-9的表達及其臨床實踐價值。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的在于公開了 DUSP-9基因在檢測腎透明細胞癌中的應用。
[0004]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的:
DUSP-9基因在檢測腎透明 細胞癌中的應用。
[0005]上述技術方案所述的DUSP-9基因在檢測腎透明細胞癌中的應用，其中DUSP-9基因在腎透明細胞癌中低表達。
[0006]上述技術方案所述的DUSP-9基因在檢測腎透明細胞癌中的應用，包括下述步驟:
(1)、取樣本腎組織，提取腎組織的RNA；
(2)、對樣本的腎組織RNA進行逆轉錄，得到樣本腎組織的cDNA；
(3)、以步驟(2)獲得的腎組織cDNA為模版，以引物對P為引物，進行RT-PCR反應，將樣本腎組織中的DUSP-9基因的mRNA表達量與正常腎組織中的DUSP-9基因的mRNA表達量進行對比，當樣本中DUSP-9基因的mRNA表達量低于正常DUSP-9基因的mRNA表達量時，該樣本為腎透明細胞癌樣本；其中引物對P為:
DUSP-9 編碼鏈:5’ -TATGCCACGCCCTTTGAG-3’，
DUSP-9 非編碼鏈:5’ -CACAGCAGGATGTAGGAGATGA-3’。
[0007]上述技術方案所述的DUSP-9基因在檢測腎透明細胞癌中的應用，其中，所述RT-PCR的條件為:50° C 2分鐘和95。C 2分鐘，I個循環(huán)；95° C 15秒、55° C 30秒和72° C 40秒，40個循環(huán)。
[0008]上述技術方案所述的DUSP-9基因在檢測腎透明細胞癌中的應用，其中，所述的應用是通過對腎組織樣本進行免疫組化測定，當腎組織樣本的染色指數< 4時，該腎組織樣本中DUSP-9低表達，該樣本為腎透明細胞癌樣本。[0009]本發(fā)明具有以下有益效果:
1、本發(fā)明通過實驗揭示了DUSP-9基因在腎透明細胞癌患者中低表達，為腎透明細胞癌患者的診斷提供了一種新的診斷性指標；
2、本發(fā)明通過實驗(如表2的分析P值<0.005)揭示了 DUSP-9基因可以作為判定DUSP-9預后的獨立性指標；
3、本發(fā)明揭示了DUSP-9基因與腎透明細胞癌之間的關系，在常用的腎腫瘤診斷病理報告中，可以將DUSP-9的表達分析加入，作為判定患者預后的指標；在切片的過程中，對腫瘤染色會用到免疫組化過程，同時細胞染色過程簡易方便，結合染色程度和染色后陽性(及染色后的細胞)細胞比例來得出染色指數，(4為預后不良，^ 5為預后良好；可以盡最大可能的減少實驗的復雜程度，更加良好的判定患者的病理類型及預后。
[0010]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為46例ccRCC腫瘤樣本和相鄰正常腎組織樣本的DUSP-9基因表達的RT-PCR分
析；
圖2為107例ccRCC患者腫瘤組織和相鄰正常組織的免疫組化分析；
圖3為DUSP-9蛋白質表達的免疫組化分析中相鄰正常腎組織樣本與ccRCC腫瘤組織樣本的不同染色情況；
圖4為由Kaplan-Meier分析和時序測試所得到的DUSP-9的表達對生存的影響。
【具體實施方式】
[0011]為使本發(fā)明的技術方案便`于理解，以下結合具體試驗例對本發(fā)明DUSP-9基因在檢測腎透明細胞癌中的應用作進一步的說明。
[0012]試驗例1:DUSP_9基因在檢測腎透明細胞癌中的應用:
一、病例樣本及試劑:
1、病人和組織標本:
(I)、收集2008年2月到2009年12月的46例完成根除性腎臟切除術并經病理證實的ccRCC患者(根據中山大學癌癥中心腫瘤組織學和2002年美國癌癥聯(lián)合委員會對每個病人的疾病階段進行分類和再分類)的癌組織和鄰近的正常組織標本，其中男40例，女6例，平均年齡50歲(范圍:37 - 75歲)，并且用RT-PCR進行了分析。將手術切除后的腎組織立即浸泡在RNAlater (試劑盒；德國)中，并盡快放置_4°C冰箱中過夜，最后貯存在-80攝氏度低溫冰箱中備用。
[0013](2)、此外，我們對1999年到2007年收集到的211例ccRCCs病人癌組織的包埋樣本和其中107例(該107例選自211例患者中)相鄰正常組織的標本進行免疫組化實驗，211例病人的特點如表1中“臨床病理變量”和“η”欄所示。資料表明這些病人在術前未接受過放、化療。中山大學癌癥中心對這些病人進行腫瘤組織學和臨床診斷，并且根據《2002年美國癌癥聯(lián)合委員會，腎細胞癌的TNM分類》對每個病人的疾病階段進行分類和再分類。該研究得到中山大學研究機構審查委員會的批準，并且所有患者都已簽署知情同意書。
[0014]表1透明細胞腎細胞癌病人DUSP-9的表達與臨床病理特征之間的聯(lián)系
【權利要求】
1.DUSP-9基因在檢測腎透明細胞癌中的應用。
2.根據權利要求1所述的DUSP-9基因在檢測腎透明細胞癌中的應用，其特征在于:DUSP-9基因在腎透明細胞癌中低表達。
3.根據權利要求1或2所述的DUSP-9基因在檢測腎透明細胞癌中的應用，包括下述步驟: (1)、取樣本腎組織，提取腎組織的RNA； (2)、對樣本的腎組織RNA進行逆轉錄，得到樣本腎組織的cDNA； (3)、以步驟(2)獲得的腎組織cDNA為模版，以引物對P為引物，進行RT-PCR反應，將樣本腎組織中的DUSP-9基因的mRNA表達量與正常腎組織中的DUSP-9基因的mRNA表達量進行對比，當樣本中DUSP-9基因的mRNA表達量低于正常DUSP-9基因的mRNA表達量時，該樣本為腎透明細胞癌樣本；其中引物對P為: DUSP-9 編碼鏈:5’-TATGCCACGCCCTTTGAG-3’，
DUSP-9 非編碼鏈:5’ -CACAGCAGGATGTAGGAGATGA-3’。
4.根據權利要求3所述的DUSP-9基因在檢測腎透明細胞癌中的應用，其特征在于，所述RT-PCR的條件為:50° C 2分鐘和95。C 2分鐘，I個循環(huán)；95° C 15秒、55° C 30秒和72。C 40秒，40個循環(huán)。
5.根據權利要求1或2所述的DUSP-9基因在檢測腎透明細胞癌中的應用，其特征在于:所述的應用是通過對腎組織樣本進行免疫組化測定，當腎組織樣本的染色指數< 4時，該腎組織樣本中DUSP-9低表達，該樣本為腎透明細胞癌樣本。
【文檔編號】C12Q1/68GK103571955SQ201310515660
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權日:2013年10月28日
【發(fā)明者】吳松, 王倚天, 何穎穎, 張蒙, 呂兆潔, 王永強, 蔡志明 申請人:深圳市第二人民醫(yī)院