專利名稱：：診斷和治療腎細(xì)胞癌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及診斷和治療腎細(xì)胞癌的方法。技術(shù)背景腎細(xì)胞癌(RCC)是第三常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性肺瘤，在全部人類惡性腫瘤疾病中占23%。目前，對(duì)于局限性RCC腫瘤，外科切除是最有效的治療手段，但對(duì)于晚期RCC患者沒有令人滿意的有效治療方法。一些RCC相關(guān)療法的有效率雖可達(dá)到約20%,但頻繁出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用，且患者的預(yù)后并未整體改善(LjungbergB，"(1999)BJUInt.84:405-11;LevyDA,Wa/.(1998)JUrol159:1163-7.)。腫瘤的階段被認(rèn)為是最具信息性的預(yù)后因子，而關(guān)于作為腎癌發(fā)生基礎(chǔ)的分子機(jī)制基本上一無所知。RCC腫瘤是基于組織學(xué)特點(diǎn)進(jìn)行表征的，比如透明細(xì)胞(80%)、乳頭狀(papillary)(10%)、難染色性(<5%)或顆粒狀、紡#^狀或者嚢腫相關(guān)癌(cyst-associatedcarcinomas)(5-15%)。這些組織學(xué)亞型各自顯示獨(dú)特的臨床行為，其中透明細(xì)胞型和顆粒型往往顯示更具侵襲性的臨床表現(xiàn)型。本研究選擇了最主要的類型即透明細(xì)胞癌。具體而言，本發(fā)明人對(duì)這樣的肺瘤中的基因表達(dá)模式進(jìn)行了大規(guī)模分析。其他研究小組報(bào)道的類似研究已經(jīng)鑒定了一些基因，這些基因可能對(duì)于預(yù)后目的或RCC的分類是有用的(TakahashiM，aa/.(2001)ProcNatlAcadSciUSA98:9754-9;YoungAN，Wa/.(2001)AmJPathol.158:1639-51;SkubitzKM&SkubitzAP.(2002)JLabClinMed140:52-64;TakahashiM,"a/.(2003)Oncogene22:6810-8;HigginsJP,e^/.(2003)AmJPathol162:925-32)。通過一些關(guān)于腎癌基因表達(dá)模式的研究，發(fā)現(xiàn)了有望成為診斷標(biāo)志或預(yù)后表征(profile)候選的基因。但是，來自腫瘤塊的這些數(shù)據(jù)并不能充分地反映腎癌發(fā)生過程中的表達(dá)變化，因?yàn)镽CC細(xì)胞一般以含有多種細(xì)胞組分的實(shí)體(solidmass)的形式存在。因此，先前公開的RCC表達(dá)模式可能反映的是不均一的模式。cDNA微陣列技術(shù)使得發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞及惡性細(xì)胞中全面的基因表達(dá)模式，以及比較惡性細(xì)胞與相應(yīng)的正常細(xì)胞間的基因表達(dá)成為可能(Okabe&(2001)CancerRes61:2129-37;Kitahara"a/"(2001)CancerRes61:3544-9;IinWa/"(2002)Oncogene21:4120-8;Hasegawaa/"(2002)CancerRes62:7012-7.)。這種手段使得人們能夠闡明癌細(xì)胞的復(fù)雜性質(zhì)和理解癌發(fā)生的機(jī)制。通過鑒定在腫瘤中脫調(diào)節(jié)(deregulated)的基因，可以更為精準(zhǔn)地it斷各種癌癥，還可以開發(fā)新治療靶標(biāo)(BienzandClevers，(2000)Cell103:311-20.)。為了從基因組整體的視角解明胂瘤基礎(chǔ)的機(jī)理，以及發(fā)現(xiàn)新治療藥物開發(fā)、診斷的靶分子，我們使用23040個(gè)基因的cDNA微陣列解析了一些胂瘤細(xì)胞的表達(dá)模式(Okabed(2001)CancerRes61:2129-37;Kitaharaa/.,(2001)CancerRes61:3544-9;Lin"/.，(2002)Oncogene21:4120-8;Hasegawada/"(2002)CancerRes62:7012-7.)。旨在揭示癌癥發(fā)生機(jī)制的研究為鑒定某些抗腫瘤劑的分子靶標(biāo)提供了方便。例如，原本開發(fā)用于抑制Ras相關(guān)生長(zhǎng)信號(hào)傳導(dǎo)途徑(其活化依賴于翻譯后法尼基化)的法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)，已被證明在動(dòng)物模型中可有效治療Ras依賴性腫瘤(SunJ等，(1998)Oncogene16:1467-73.)。類似地，使用抗癌藥物、以拮抗原癌基因受體HER2/neu為目的，聯(lián)合使用抗癌劑和抗HER2單克隆抗體trastuzumab對(duì)人體進(jìn)行的臨床試驗(yàn)，改善了乳腺癌患者的臨床反應(yīng)和總體生存(MolinaMA，等，(2001)CancerRes.;61(12):4744-9.)。最后，已經(jīng)開發(fā)出一種選擇性失活bcr-abl融合蛋白的酪氨酸激酶抑制劑STI-571,用于治療bcr-abl酪氨酸激酶組成型活化在白細(xì)胞轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用的慢性髓性白血病。這些種類的藥物設(shè)計(jì)用于抑制特定基因產(chǎn)物的致癌活性(O'DwyerME&DrukerBJ.(2000)CurrOpinOncol.;12(6):594-7)。因此，在癌細(xì)胞中普遍上調(diào)的基因產(chǎn)物顯然可以成為開發(fā)新抗癌劑的潛在靶標(biāo)。進(jìn)一步已經(jīng)證實(shí)，CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)識(shí)別I類MHC分子上呈遞的、來源于肺瘤相關(guān)抗原(TAA)的表位肽，并裂解腫瘤細(xì)胞。自發(fā)現(xiàn)首例TAA即MAGE家族以來，采用免疫學(xué)手段已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多其它的TAA(Boon,(1993)IntJCancer54:177-80;BoonandvanderBruggen,(1996)JExpMed183:725-9;vanderBruggen等，(1991)Science254:1643-7;BrichardV等，(1993)JExpMed178:489-95;KawakamiY等,(1994)JExpMed180:347-52.)。目前，一些新發(fā)現(xiàn)的TAA正作為免疫療法的靶標(biāo)接受臨床開發(fā)。迄今為止發(fā)現(xiàn)的TAA包括MAGE(vanderBruggen等，(1991)Science254:1643-7),gplOO(KawakamiY等，(1994)JExpMed180:347-52),SART(ShichijoS等，(1998)JExpMed187:277-88)和NY畫ESO-l(ChenYT等，(1997)ProcNatlAcadSciUSA94:1914-8)。另一方面，已證實(shí)在肺瘤細(xì)胞中特異性過高表達(dá)(over-expressed)的基因產(chǎn)物可以作為誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的耙標(biāo)被識(shí)別。這樣的基因產(chǎn)物包括p53(UmanoY等，(2001)BritJCancer84:1052-7),HER2/neu(TanakaH等，(2001)BritJCancer84:94-9),CEA(NukayaI等，(1999)IntJCancer80:92-7)等。盡管已在與TAA有關(guān)的基礎(chǔ)和臨床研究中取得了顯著進(jìn)步(RosenbergSA等，(1998)NatureMed4:321-7.;MukherjiB等，(1995)ProcNatlAcadSciUSA92:8078-82.;HuX等，(1996)CancerRes56:2479-83.)，但現(xiàn)有用于治療腺癌例如結(jié)腸直腸癌的候選TAA的數(shù)量仍然很有限。在癌細(xì)胞中大量表達(dá)且其表達(dá)局限于癌細(xì)胞中的TAA可能是理想的候選免疫療法靶標(biāo)。此外，能誘導(dǎo)強(qiáng)力且特異性的抗腫瘤免疫應(yīng)答的新型TAA的鑒定，有望促進(jìn)針對(duì)多類癌癥的肽接種策略的臨床應(yīng)用(BoonandvanderBruggen,(1996)JExpMed183:725-9.;vanderBruggen等，(1991)Science254:1643-7.;BrichardV等，(1993)JExpMed178:489-95.;KawakamiY等，(1994)JExpMed180:347-52.;ShichijoS等，(1998)JExpMed187:277-88.;ChenYT等，(1997)ProcNatlAcadSciUSA94:1914-8.;HarrisCC,(1996)JNatlCancerInst88:1442-5.;ButterfieldLH等，(1999)CancerRes59:3134-42.;VissersJL等，(1999)CancerRes59:5554-9.;vanderBurgSH等，(1996)JImmunol156:3308-14.;TanakaF等，(1997)CancerRes57:4465-8.;FujieT等，(1999)IntJCancer80:169-72.;KikuchiM等,(1999)IntJCancer81:459-66.;OisoM等,(1999)IntJCancer81:387-94.)。據(jù)多次報(bào)導(dǎo)，源自某些健康供體的經(jīng)肽刺激的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)對(duì)肽做出應(yīng)答而產(chǎn)生顯著水平的IFN-y，但在"Cr-釋放測(cè)定中很少以HLA-A24或A0201限制性方式對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性(KawanoK等，(2000)CancerRes60:3550-8.;NishizakaS等，(2000)CancerRes60:4830-7.;TamuraM等，(2001)JpnJCancerRes92:762-7.)。然而，與在白種人群中一樣，在日本人中HLA-A24和HLA-A0201兩者均是常見的HLA等位基因(DateY等，(1996)TissueAntigens47:93-101.;KondoA等，(1995)JImmunol155:4307-12.;KuboRT等，(1994)JImmunol152:3913-24.;ImanishiT等，(1992)ProceedingoftheeleventhInternationalHistocompatibilityWorkshopandConferenceOxfordUniversityPress,Oxford,1065.;WilliamsF等，(1997)TissueAntigen49:129.)。因此，由這些HLA呈遞的癌癥抗原肽可能對(duì)于日本人和白種人人群中的癌治療特別有用。另外，已知使用高濃度的肽通?？稍隗w外誘導(dǎo)低親和力的CTL,由此在抗原呈遞細(xì)胞(APC)上產(chǎn)生高水平的特異性肽/MHC復(fù)合物，有效激活這些CTL(Alexander-MillerMA等，(1996)ProcNatlAcadSciUSA93:4102-7.)。因此，為了致力于闡明癌癥相關(guān)的癌癥發(fā)生機(jī)制、和鑒定可能的新抗癌劑開發(fā)的靶標(biāo)，使用展示27436種基因的cDNA微陣列對(duì)純化的腎癌細(xì)胞群體中的基因表達(dá)圖式進(jìn)行了大規(guī)模解析。具體而言，聯(lián)合使用cDNA微陣列與激光束顯微解剖，考察了腎細(xì)胞癌的15例樣本的確切全基因組表達(dá)模式。本說明書中詳細(xì)描述的發(fā)現(xiàn)提示這些被鑒定的基因在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖中可能起著重要作用，因此它們是抗癌藥物開發(fā)的有希望的靶標(biāo)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及與腎細(xì)胞癌(RCC)相關(guān)的基因表達(dá)圖式的發(fā)現(xiàn)。在本說明書中，將腎細(xì)胞癌中差異性表達(dá)的基因統(tǒng)稱為"RCC核酸"或"RCC多核苷酸"，對(duì)應(yīng)的由其編碼的多肽稱為"RCC多肽"或"RCC蛋白"。為了表征與腎癌的發(fā)生相關(guān)聯(lián)的分子機(jī)制，本發(fā)明人聯(lián)用展示27436個(gè)人類基因的cDNA微陣列和激光微束顯微解剖(LMM)，與正常腎皮質(zhì)相比較，分析了15例腎細(xì)胞癌(RCC)外科標(biāo)本的全基因組基因表達(dá)模式。本發(fā)明人鑒定了251個(gè)在腎細(xì)胞癌中一般性上調(diào)的基因，還鑒定了721個(gè)在腎細(xì)胞癌中一般性下調(diào)的基因。經(jīng)鑒定，目前有74個(gè)上調(diào)基因和189個(gè)在腎細(xì)胞癌中下調(diào)的基因的功能是未知的。對(duì)19個(gè)代表性候選基因的半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持了本發(fā)明人的微陣列分析的可信度。這些數(shù)據(jù)提供了尋找候選基因的有用信息，這些候選基因的產(chǎn)物可能是RCC治療相關(guān)的分子靶標(biāo)。因而，本發(fā)明提供通過確定源自患者的生物樣品，如組織樣品中RCC相關(guān)基因的表達(dá)水平，來診斷受試者中的腎細(xì)胞癌或確定其發(fā)生腎細(xì)胞癌的傾向性(predisposition)的方法。在本說明書中，術(shù)語(yǔ)"RCC相關(guān)基因"是指其特征在于表達(dá)水平在RCC細(xì)胞和正常細(xì)胞之間有差別的基因。正常細(xì)胞是來源于正常腎組織的細(xì)胞。在本發(fā)明的上下文中，RCC相關(guān)基因是編號(hào)為RCC1-972的基因中的一種或多種基因。與基因的正常對(duì)照水平相比，基因表達(dá)水平的改變(例如上升或下降)表示該受試者患有RCC或存在發(fā)生RCC的危險(xiǎn)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"對(duì)照水平"是指在對(duì)照樣品中檢出的蛋白表達(dá)水平，其包括正常對(duì)照水平和RCC對(duì)照水平。對(duì)照水平可以是來自單個(gè)參照群體的單個(gè)表達(dá)圖式，也可以是來自多個(gè)表達(dá)圖式的單個(gè)表達(dá)圖式。例如，對(duì)照水平可以得自以前檢測(cè)的細(xì)胞的表達(dá)圖式數(shù)據(jù)庫(kù)。"正常對(duì)照水平"是指在正常健康個(gè)體中、或者在已知未患RCC的個(gè)體的群組中檢出的基因表達(dá)水平。正常個(gè)體是沒有腎細(xì)胞癌臨床癥狀的個(gè)體。另一方面，"RCC對(duì)照水平，，是指在患有RCC的人群中發(fā)現(xiàn)的RCC相關(guān)基因的表達(dá)模式。與正常對(duì)照水平相比，在受試樣品中4企出編號(hào)為RCC1-251的一種或多種基因表達(dá)水平上升，表明(由其獲得樣品的)受試者患有RCC或存在發(fā)生RCC的危險(xiǎn)。相反，與正常對(duì)照水平相比，在受試樣品中檢出編號(hào)為RCC252-972的一種或多種基因表達(dá)水平下降，表明該受試者患有RCC或存在發(fā)生RCC的危險(xiǎn)?；蛘?，可以將樣品中一系列RCC相關(guān)基因的表達(dá)與該系列基因的RCC對(duì)照水平相比較。樣品表達(dá)與RCC對(duì)照表達(dá)之間的相似性表明(由其獲得樣品的)受試者患有RCC或存在發(fā)生RCC的危險(xiǎn)。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)基因表達(dá)與對(duì)照水平相比上升或下降10%、25°/?；?0%時(shí)，可認(rèn)為基因表達(dá)水平"發(fā)生改變"。此外，當(dāng)基因表達(dá)與對(duì)照水平相比上升或下降l倍、2倍、5倍或以上時(shí)，可認(rèn)為基因表達(dá)水平發(fā)生改變。通過檢測(cè)RCC相關(guān)基因探針與源自患者的組織樣品的基因轉(zhuǎn)錄物之間的雜交，例如在陣列上，來確定基因表達(dá)。在本發(fā)明的上下文中，源自患者的組織樣品是得自受試者，例如已知或懷疑患有RCC的患者的任何組織。例如，組織可以包含上皮細(xì)胞。更具體地，組織可以是來自腎細(xì)胞癌(RCC)的上皮細(xì)胞。本發(fā)明還提供RCC參照表達(dá)模式，其包含RCC1-972中兩個(gè)以上的基因表達(dá)水平?；蛘撸琑CC參照表達(dá)模式還可以由RCC1-251中或RCC252-972中兩個(gè)以上所構(gòu)成。本發(fā)明還提供通過使表達(dá)RCC相關(guān)基因的受試細(xì)胞與受試物質(zhì)接觸、制或增強(qiáng)RCC相關(guān)基因例如RCC1-972的表達(dá)或活性的作用物質(zhì)的方法。受試細(xì)胞可以是上皮細(xì)胞，例如得自腎細(xì)胞癌的上皮細(xì)胞。與該基因的對(duì)照水平相比，上調(diào)的RCC相關(guān)基因(例如RCC1-251)的表達(dá)水平或其基因產(chǎn)物的活性減少，則表明該受試物質(zhì)是RCC相關(guān)基因的抑制劑，可用于減輕RCC的癥狀。或者，與該基因的對(duì)照水平相比，下調(diào)的RCC相關(guān)基因(例如RCC252-972)的表達(dá)水平或活性或其基因產(chǎn)物的活性增加，則表明該受試物質(zhì)是RCC相關(guān)基因表達(dá)或功能的增強(qiáng)劑，可用于減輕RCC的癥狀。本發(fā)明還提供試劑盒，其含有與一種或多種RCC核酸或RCC多肽結(jié)合的檢測(cè)試劑。本發(fā)明還提供與一種或多種RCC核酸結(jié)合的核酸陣列。本發(fā)明的治療方法包括治療或預(yù)防受試者中腎細(xì)胞癌的方法，該方法包括給受試者施用反義組合物的步驟。在本發(fā)明的上下文中，反義組合物降低特定靶基因的表達(dá)。例如，反義組合物可以含有與選自RCC1-251的上調(diào)RCC相關(guān)基因序列互補(bǔ)的核苷酸?；蛘撸景l(fā)明的方法可以包括給受試者施用小干擾RNA(siRNA)組合物的步驟。在本發(fā)明的上下文中，siRNA組合物降低上調(diào)RCC相關(guān)基因例如選自RCC1-251的核酸的表達(dá)，尤其是降低C6700V2(RCC81)、B7032N(RCC126)和B9320(RCC173)的表達(dá)。在另一個(gè)方法中，通過給受試者施用核酶組合物來治療或預(yù)防受試者中的腎細(xì)胞癌。相應(yīng)地，本發(fā)明包括核酸特異性核酶組合物，該組合物降低上調(diào)RCC相關(guān)基因(例如RCC1-251)的表達(dá)。其它治療方法包括這樣的方法，其中給受試者施用可提高一種或多種下調(diào)RCC相關(guān)基因(例如RCC252-972)的表達(dá)，或者提高由這些基因中一種或多種所編碼多肽之活性的化合物。本發(fā)明還包括疫苗和疫苗接種(vaccination)方法。例如，治療或預(yù)防受試者中RCC的方法可包括給受試者施用疫苗，所述疫苗含有由選自RCC1-251的RCC核酸編碼的RCC多肽或所述多肽的免疫學(xué)活性片段。在本發(fā)明的上下文中，免疫學(xué)活性片段是長(zhǎng)度短于全長(zhǎng)天然蛋白，但可誘導(dǎo)與全長(zhǎng)蛋白所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答相類似的免疫應(yīng)答的多肽。例如，優(yōu)選免疫學(xué)活性片段的長(zhǎng)度為至少8個(gè)殘基，并能夠刺激免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞或B細(xì)胞?？赏ㄟ^檢測(cè)細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子(如IL-2)生成(elaboration)或抗體產(chǎn)生來測(cè)量免疫細(xì)力包刺激。本發(fā)明還部分基于下述令人驚奇的發(fā)現(xiàn)抑制C6700、B7032N或B9320的表達(dá)對(duì)抑制包括腎細(xì)胞癌相關(guān)細(xì)胞生長(zhǎng)在內(nèi)的多種癌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)是有效的。本申請(qǐng)中記載的發(fā)明部分基于該發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明還提供抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。在這些方法中，還提供包括使下述組合物與細(xì)胞接觸的步驟的方法，所述組合物包含抑制C6700、B7032N或B9320表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)。本發(fā)明還提供抑制受試者中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。這些方法包括下述步驟給受試者施用含小干擾RNA(siRNA)的組合物，所述小干擾RNA與選自C6700、B7032N和B9320的序列特異性雜交。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供抑制生物樣品的細(xì)胞中C6700、B7032N或B9320基因中一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)的方法。通過以足夠抑制對(duì)象基因(例如C6700、B7032N或B9320基因)表達(dá)的量將雙鏈核糖核酸(RNA)分子導(dǎo)入細(xì)胞，可以抑制該基因的表達(dá)。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含核酸序列和載體的產(chǎn)品以及包含該產(chǎn)品的組合物，其對(duì)于例如實(shí)施本發(fā)明的方法是有用的。提供的產(chǎn)品中包括這樣的siRNA分子，當(dāng)將該siRNA分子導(dǎo)入表達(dá)靶基因的細(xì)胞時(shí)，其抑制C6700、B7032N或B9320基因中一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)。在這些分子中還有這樣的分子，它們由有義鏈和反義鏈構(gòu)成，所述有義鏈為對(duì)應(yīng)于C6700、B7032N或B9320靶序列的核糖核苷酸序列，所述反義鏈為與所述有義鏈互補(bǔ)的核糖核苷酸序列。該分子的有義鏈和反義鏈相互雜交，形成雙鏈分子。本發(fā)明還提供抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。通過使C6700、B7032N或B9320的小干擾RNA(siRNA)的組合物與細(xì)胞接觸，可以抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。還可以使細(xì)胞與轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑接觸。細(xì)胞可以以體內(nèi)、體外或離體形式提供。受試者優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，例如人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小鼠、大鼠、犬、貓、馬或牛。細(xì)胞可以是泌尿生殖系統(tǒng)例如腎細(xì)胞?；蛘?，細(xì)胞可以是腫瘤細(xì)月包(即癌癥細(xì)月包(cancercell)),例如癌細(xì)月包(carcinomacell)或&泉癌細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以是腎細(xì)胞癌細(xì)胞，更具體的是透明細(xì)胞。在本發(fā)明的上下文中，短語(yǔ)"抑制細(xì)胞生長(zhǎng)"指與未處理細(xì)胞相比，受處理的細(xì)胞的增殖速度較低或生存力下降。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的增殖測(cè)定法可以測(cè)量細(xì)胞生長(zhǎng)。本發(fā)明進(jìn)一步提供新轉(zhuǎn)錄變體C67MW，其不僅是腎細(xì)胞癌的候選診斷標(biāo)志，還是開發(fā)診斷新策略及有效抗癌劑的有希望的靶標(biāo)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，C6700V2多肽包含1151個(gè)氨基酸(SEQIDNO:66)的蛋白，其由SEQIDNO:65的開》丈閱讀沖匡編碼。除非另有說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中的普通技術(shù)人員所常規(guī)理解的意思相同。盡管在實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明時(shí)可使用與本文所述類似或等同的方法和材料，但適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧先绫菊f明書下面的描述。本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)都全文并入本文作為參考。在存在矛盾的情況下，以包括定義的本i兌明書為準(zhǔn)。另外，本文描述的材料、方法和實(shí)施例僅是為了說明而非限制本發(fā)明。本說明書記載的方法的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以在檢出腎細(xì)胞癌的明顯臨床癥狀之前對(duì)疾病進(jìn)行鑒定。通過以下的詳細(xì)說明和權(quán)利要求書，本發(fā)明的其它特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)是顯而易見的。附圖簡(jiǎn)要說明圖1顯示對(duì)于透明細(xì)胞RCC(左圖面)和正常腎皮質(zhì)細(xì)胞(右圖面)使用激光微束顯微解剖(LMM)的照片，(a行)顯微解剖前；(b行)顯微解剖后；(c行)經(jīng)顯微解剖的細(xì)胞。圖2圖2(a)顯示了高度表達(dá)基因的半定量RT-PCR驗(yàn)證測(cè)定結(jié)果。通過半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了21個(gè)基因(登錄號(hào).NM—018092，AA632745，麗一007250，W86513,BC077726,AA156409,W57613,CR749811,AW972553,AL832896,AK021778,AK026403,AK025204,NM—000677,AF070609,AI290343,AA442590,畫—000552，BC000234,BC034014和NMJ)04567)以及(內(nèi)部對(duì)照)的表達(dá)。微陣列的信號(hào)與半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。正常腎皮質(zhì)是從用于該微陣列的11例RCC患者制備的。RPTEC表示腎近端小管上皮細(xì)胞(renalproximaltubuleepithelialcell)。圖2(b)顯示采用半定量RT-PCR測(cè)量的11個(gè)RCC細(xì)胞系中的C6700的表達(dá)。圖3腎細(xì)胞癌細(xì)胞系和正常人組織中C6700表達(dá)圖式的Northern印跡分析結(jié)果。圖4使用特異性探針對(duì)多種正常人組織中3545堿基轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行多重Northern印跡分析的結(jié)果(上圖面)；即使用3545堿基轉(zhuǎn)錄物和4533堿基轉(zhuǎn)錄物的共有序列作為探針分析正常人組織中F5749的表達(dá)(下圖面)。圖5多種人組織中C8919轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡分析結(jié)果。圖6多種人組織中B7032N轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡分析結(jié)果(左圖面)；RCC細(xì)胞系(Caki-1,Caki-2，786-0，A498,ACHN，769-P，A704,RXF-631L,OS-RC-2，TUHRIOTKB和TUHR14TKB)、RPTEC(腎近端小管上皮細(xì)月包)和正常人器官(心、肺、肝、腎、睪丸和腦)中B7032N轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡分析結(jié)果(右圖面)。圖7多種人組織中B9320轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡分析結(jié)果(左圖面)；RCC細(xì)胞系(Caki畫l，Caki-2，786-0和A498)、RPTEC(腎近端小管上皮細(xì)胞)和正常人器官(心、肺、肝、腎、腦和睪丸)中B9320轉(zhuǎn)錄物的Northern印跡分析結(jié)果(右圖面)。圖8C6700的基因組結(jié)構(gòu)。C6700具有2個(gè)不同的變體，稱為VI和V2。圖8(a)顯示了基因組結(jié)構(gòu)，這里，空白三角表示框內(nèi)(inframe)終止密碼子的存在，實(shí)心三角表示第一個(gè)曱硫氨酸。圖8(b)顯示了SEMA5B的半定量RT-PCR分析結(jié)果，其中使用了從4個(gè)RCC細(xì)胞系(786-0，A704,OS-RC-2和TUHR14TKB)和胎兒腦polyA(+)RNA制備的RNA。圖9小干擾RNA(siRNA)的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，所述小干擾RNA設(shè)計(jì)成減少RCC細(xì)胞中C6700的表達(dá)。圖9(a)半定量RT-PCR結(jié)果，顯示RCC細(xì)胞系OC-RC-2中的內(nèi)源性C6700表達(dá)受到抑制。y^-MG用作內(nèi)部對(duì)照。si-#2載體顯示出敲低效應(yīng)(knockdowneffect);而si-亂序和si-模擬對(duì)C6700轉(zhuǎn)錄物的水平未顯示出任何效應(yīng)。與用si-亂序和si-;漠?dāng)M轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，用si-#2載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染引起集落數(shù)的減少(圖9(c))和存活細(xì)胞數(shù)的減少(圖9(b))(分別p<0.005和p<0.001;無配對(duì)t檢驗(yàn))。圖10COS7細(xì)胞中外源性B7032N蛋白的表達(dá)及亞細(xì)胞定位。圖10(a):轉(zhuǎn)染24小時(shí)和48小時(shí)后，通過Western印跡顯示的B7032N蛋白的外源性表達(dá)；圖10(b):C0S7細(xì)胞中外源性B7032蛋白的亞細(xì)胞定位。圖11B7032N的siRNA對(duì)RCC細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞生存力的敲低效應(yīng)。圖ll(a):RXF-631L細(xì)胞對(duì)si-B7032N(#4)或?qū)φ誷iRNA(si-亂序)的效應(yīng)，通過半定量RT-PCR(左上)，集落形成測(cè)定(左下)和MTT測(cè)定(右)進(jìn)行分析。用RT-PCR實(shí)驗(yàn)考察siRNA處理過的細(xì)胞中B7032N轉(zhuǎn)錄物的水平。(32-MG表達(dá)水平用作定量對(duì)照。siB7032N-#4載體顯示出敲低效應(yīng)；而si-亂序?qū)7032N轉(zhuǎn)錄物的水平未顯示任何效應(yīng)。與用si-亂序轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，用B7032N-#4載體轉(zhuǎn)染引起集落數(shù)的減少和活細(xì)胞數(shù)的減少(pO.0001;無配對(duì)t檢驗(yàn))。(b):A498細(xì)胞對(duì)si-B7032N(#4)或?qū)φ誷iRNA(si-亂序)的效應(yīng)，通過半定量RT-PCR左上)，集落形成測(cè)定(左下)和MTT測(cè)定(右)進(jìn)行分析。用RT-PCR實(shí)驗(yàn)考察siRNA處理過的細(xì)胞中B7032N轉(zhuǎn)錄物的水平。(32-MG表達(dá)水平用作定量對(duì)照。Si-B7032N-弁4載體顯示出敲^f氐效應(yīng)；而si-亂序?qū)7032N轉(zhuǎn)錄物的水平未顯示任何效應(yīng)。與用si-亂序轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，用si-B7032N-#4載體轉(zhuǎn)染引起集落數(shù)的減少和活細(xì)胞it的減少(pO.0001;無配對(duì)t檢驗(yàn))。圖12NIH3T3細(xì)胞中外源性B7032N的生長(zhǎng)促進(jìn)效應(yīng)。圖12(a):高水平表達(dá)外源性B7032N的細(xì)胞和用模擬載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的Western印跡分析結(jié)果。采用抗HA標(biāo)簽單克隆抗體確i/v了B7032N表達(dá)的外源性導(dǎo)入。卩-肌動(dòng)蛋白用作上樣對(duì)照。圖ll(b):NIH3T3-B7032N細(xì)胞的體外生長(zhǎng)。用B7032N轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞(B7032N-A,-B，-C,-0)和用模擬轉(zhuǎn)染的可113丁3細(xì)胞0莫擬-A,-B,-C),通過MTT測(cè)定進(jìn)行測(cè)量。圖13COS7細(xì)胞中外源性B9320蛋白的表達(dá)及亞細(xì)胞定位。圖12(a):轉(zhuǎn)染24小時(shí)和48小時(shí)后，Western印跡顯示的B9320蛋白的外源性表達(dá)；圖13(b):COS7細(xì)胞中外源性B9320蛋白的亞細(xì)胞定位。圖14B9320的siRNA對(duì)RCC細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞生存力的敲低效應(yīng)。圖14(a):Caki-2細(xì)胞對(duì)si-B9320(#2)或?qū)φ誷iRNA(si-亂序)的效應(yīng)，通過半定量RT-PCR(左上)、集落形成測(cè)定(左下)和MTT測(cè)定(右)進(jìn)^f亍分析。用RT-PCR實(shí)驗(yàn)于考察siRNA處理過的細(xì)胞中B9320轉(zhuǎn)錄物的水平。(32-MG表達(dá)水平用作定量對(duì)照。Si-B9320-#2載體顯示出敲低效應(yīng)；而si-亂序?qū)9320轉(zhuǎn)錄物的水平未顯示任何效應(yīng)。與用si-亂序轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，用Si-B9320-#2載體轉(zhuǎn)染引起集落數(shù)的減少和活細(xì)胞數(shù)的減少(pO.0001;無配對(duì)t檢驗(yàn))。圖14(b):A498細(xì)胞對(duì)Si-B9320-#2或?qū)φ誷iRNA(si-亂序)的效應(yīng)，通過半定量RT-PCR(左上)、集落形成測(cè)定(左下)和MTT測(cè)定(右)進(jìn)行分析。用RT-PCR實(shí)驗(yàn)考察siRNA處理過的細(xì)胞中B9320轉(zhuǎn)錄物的水平。(32-MG表達(dá)水平用作定量對(duì)照。Si-B9320-弁2載體顯示出敲低效應(yīng)；而si-亂序?qū)9320轉(zhuǎn)錄物的水平未顯示任何效應(yīng)。與用si-亂序轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相比，用Si-B9320-#2載體轉(zhuǎn)染引起集落數(shù)的減少和活細(xì)胞數(shù)的減少(pO.OOO1;無配對(duì)t檢驗(yàn))。圖15NIH3T3細(xì)胞中外源性B9320的生長(zhǎng)促進(jìn)效應(yīng)。圖15(a):高水平表達(dá)外源性B9320的細(xì)胞和用模擬載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的Western印跡分析結(jié)果。采用抗HA標(biāo)簽單克隆抗體確認(rèn)了B9320表達(dá)的外源性導(dǎo)入。P-肌動(dòng)蛋白用作上樣對(duì)照。圖15(b):NIH3T3-B9320細(xì)胞的體外生長(zhǎng)。用B9320轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞(B9320-1，-2，-3)和用模擬轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞(模擬-l，-2,-3)，通過MTT測(cè)定進(jìn)行測(cè)量。發(fā)明詳述除非另有特定的說明，本說明書中使用的詞語(yǔ)"一個(gè)(a)"或"一種(an)"或"該(the)"是指至少一個(gè)或至少一種。通常，使用腫瘤塊(tumormass)與正常腎細(xì)胞相比較進(jìn)行的RCC基因表達(dá)分析是失真的(distorted),這是因?yàn)镽CC細(xì)胞以含有多種細(xì)胞組分的實(shí)體(solidmass)的形式存在。這樣，結(jié)果中就包含噪聲數(shù)據(jù)(noisydata)。因此，本文中采用一種分離純細(xì)胞群體的方法一激光捕捉顯微解剖(LCM)法或稱激光微束顯微解剖(LMM)法，獲得了特定的癌細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞(Kitaharada/.，(2001)CancerRes，61:3544-9;Gjerdrum&a/,,(2001)JMolDiagn，3:105-10.)。本發(fā)明部分基于下述發(fā)現(xiàn)在得自RCC患者的腎細(xì)胞和上皮細(xì)胞之間，多種核酸的表達(dá)圖式有變化?；虮磉_(dá)的差異是通過全面cDNA微陣列系統(tǒng)鑒定的。使用與激光顯微解剖相結(jié)合的展示27648個(gè)基因的cDNA微陣列，分析了來自15例RCC的癌細(xì)胞的基因表達(dá)模式。通過比較釆用激光顯微解剖法選擇純化的、來自確診患者的癌細(xì)胞與正常腎細(xì)胞的表達(dá)模式，鑒定出有251個(gè)基因在RCC細(xì)胞中普遍上調(diào)，有721個(gè)基因在RCC細(xì)胞中普遍下調(diào)。進(jìn)一步，對(duì)具備在患者血清或尿中檢測(cè)癌相關(guān)蛋白的潛力的候選分子標(biāo)志進(jìn)行了選擇，發(fā)現(xiàn)了一些開發(fā)人RCC中信號(hào)抑制策略的潛在靶標(biāo)。本說明書中鑒定的差異表達(dá)基因具有作為RCC標(biāo)志和RCC基因靶標(biāo)的診斷用途，可以改變其表達(dá)以治療或減輕RCC癥狀。在RCC患者中表達(dá)水平被調(diào)變(即上升或下降)的基因總結(jié)于表4-5中，本說明書中將其統(tǒng)稱為"RCC相關(guān)基因"、"RCC核酸"或"RCC多核苷酸"；對(duì)應(yīng)的由其編碼的多肽稱為"RCC多肽"或"RCC蛋白"。除非另外說明，"RCC"指本說明書公開的任何序歹'j(例如RCC1-972)。對(duì)于先前已經(jīng)描述的基因，同時(shí)給出其數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)。通過測(cè)量細(xì)胞樣品中各種基因的表達(dá)，可以診斷RCC。類似地，測(cè)定這些基因應(yīng)答于各種藥物的表達(dá)，可以鑒定用于治療RCC的藥物。本發(fā)明包括確定(例如測(cè)量)表4-5所示序列中至少一種乃至全部序列的表達(dá)。使用由已知序列的GenBankTM數(shù)據(jù)庫(kù)登錄項(xiàng)提供的序列信息，可使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)檢測(cè)和測(cè)定RCC相關(guān)基因。例如，可使用序列數(shù)據(jù)庫(kù)登錄項(xiàng)中對(duì)應(yīng)于RCC序列的序列來構(gòu)建探針，用于在例如Northern印跡雜交分析中4企測(cè)對(duì)應(yīng)于RCC相關(guān)基因的RNA序列J笨針典型地包括參照序列的至少10個(gè)、20個(gè)、50個(gè)、100個(gè)或200個(gè)核芬酸。作為另一個(gè)例子，可以使用所述序列構(gòu)建引物，用于在例如基于擴(kuò)增的檢測(cè)方法，如基于逆轉(zhuǎn)錄的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中特異性擴(kuò)增RCC核酸。然后，將受試細(xì)胞群體，例如源自患者的組織樣品中的一種或多種RCC相關(guān)基因的表達(dá)水平與參照群體中相同基因的表達(dá)水平相比較。參照細(xì)胞群體包括一種或多種被比較參數(shù)已知的細(xì)胞，即腎細(xì)胞癌細(xì)胞(例如RCC細(xì)胞)或正常腎皮質(zhì)細(xì)胞(例如非RCC細(xì)胞)。與參照細(xì)胞群體相比，受試細(xì)胞群體中的基因表達(dá)圖式是否能表示RCC或其傾向性取決于參照細(xì)胞群體的組成。例如，如果參照細(xì)胞群體由非RCC細(xì)胞組成，受試細(xì)胞群體和參照細(xì)胞群體之間基因表達(dá)圖式的相似性表示受試細(xì)胞群體是非RCC。反之，如果參照細(xì)胞群體由RCC細(xì)胞組成，受試細(xì)胞群體和參照細(xì)胞群體之間的基因表達(dá)模式的相似性表示受試細(xì)胞群體含有RCC細(xì)胞。如果受試細(xì)胞群體中RCC標(biāo)志基因的表達(dá)水平與參照細(xì)胞群體中相應(yīng)RCC標(biāo)志基因的表達(dá)水平相差大于l.O倍、1.5倍、2.0倍、5.0倍、或10.0倍或更多，即可認(rèn)為其被改變。受試細(xì)胞群體和參照細(xì)胞群體之間的差異基因表達(dá)可以相對(duì)于對(duì)照核酸，例如持家基因(housekeepinggene)進(jìn)行歸一化。例如，對(duì)照核酸是已知不因細(xì)胞的癌或非癌狀態(tài)而存在差異的核酸?？梢岳脤?duì)照核酸的表達(dá)水平對(duì)受試和參照群體中的信號(hào)水平進(jìn)行歸一化。例示性的對(duì)照基因包括但不限于例如(3-肌動(dòng)蛋白、甘油醛3-磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl。可以將受試細(xì)胞群體與多個(gè)參照細(xì)胞群體相比較。其中每個(gè)參照群體的已知參數(shù)可以不同。因此，可將受試細(xì)胞群體與已知含有例如RCC細(xì)胞的第一參照細(xì)胞群體和已知含有例如非RCC細(xì)胞(正常細(xì)胞)的第二參照細(xì)胞群體相比較。受試細(xì)胞可以包含在來自受試者的、已知含有或疑似含有RCC細(xì)胞組織類型或細(xì)胞樣品中。受試細(xì)胞優(yōu)選獲自身體組織或體液，例如生物流體(如血液、痰或尿液)。例如，受試細(xì)胞可以純化自腎組織。優(yōu)選地，受試細(xì)胞群體含有上皮細(xì)胞。上皮細(xì)胞優(yōu)選來自已知或疑似為腎細(xì)胞癌的組織。參照細(xì)胞群體中的細(xì)胞應(yīng)來自與受試細(xì)胞的組織類型類似的組織類型。任選地，參照細(xì)胞群體是細(xì)胞系，例如RCC細(xì)胞系(即陽(yáng)性對(duì)照)或正常非RCC細(xì)胞系(即陰性對(duì)照)?；蛘?，對(duì)照細(xì)胞群體可源自分子信息數(shù)據(jù)庫(kù)，所述分子信息來源于受試參數(shù)或條件已知的細(xì)胞。優(yōu)選受試者為哺乳動(dòng)物。例示性的哺乳動(dòng)物包括但不限于人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、小鼠、大鼠、犬、貓、馬或牛?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的方法，在蛋白或核酸水平上測(cè)定本說明書公開的基因的表達(dá)。例如，可以使用Northern雜交分析測(cè)定基因表達(dá)，所述Northern雜交分析使用特異性識(shí)別這些核酸序列中的一種或多種序列的探針。此外，可以使用例如差異表達(dá)基因序列的特異性引物，采用基于逆轉(zhuǎn)錄的PCR檢測(cè)法測(cè)定基因表達(dá)。還可以在蛋白水平上測(cè)定表達(dá)，即通過測(cè)定由本說明書所述基因編碼的多肽水平或其生物活性來測(cè)定表達(dá)。這樣的方法是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于例如免疫測(cè)定法，該方法利用針對(duì)所述基因編碼的蛋白的抗體。由這些基因編碼的蛋白的生物活性一般是公知的。本說明書中使用的術(shù)語(yǔ)"生物體"是指至少由一個(gè)細(xì)胞構(gòu)成的任何活體。生物體可以是例如真核單細(xì)胞這樣的簡(jiǎn)單生物體，也可以是例如包含人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物這樣的復(fù)雜生物體。本說明書中使用的術(shù)語(yǔ)"生物樣品"是指整個(gè)生物體或其組織、細(xì)胞或構(gòu)成部分(例如體液，包括但不限于血液、粘液、淋巴液、滑液、腦脊髓液、唾液、羊水、臍帶血、尿、陰道液和精液)的子集(subset)。術(shù)語(yǔ)"生物樣品"還指從生物整體或其組織、細(xì)胞或構(gòu)成部分的子集制備的勻漿、裂解產(chǎn)物、提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物或組織培養(yǎng)物，或其中的級(jí)分或一部分。最后，"生物樣品"還指生物體已在其中增殖(propagate)的基質(zhì)，例如的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基或凝膠，其中含有蛋白或核酸分子等細(xì)胞成分。腎細(xì)胞癌的診斷在本發(fā)明的上下文中，通過測(cè)定受試細(xì)胞群體(即源自患者的生物樣品)中一種或多種RCC核酸序列的表達(dá)水平來"^斷RCC。優(yōu)選受試細(xì)胞群體含有上皮細(xì)胞，例如由腎組織獲得的細(xì)胞。還可以從血液或其它體液(例如尿)中測(cè)定基因表達(dá)。其它生物樣品也可用于測(cè)定蛋白水平。例如，可釆用免疫測(cè)定法或其它常規(guī)生物學(xué)測(cè)定測(cè)定來自待診斷受試者的血液或血清中的蛋白水平。確定受試細(xì)胞或生物樣品中一種或多種RCC相關(guān)基因，例如RCC1-972的表達(dá)，并將其與被測(cè)的一種或多種指定RCC相關(guān)基因的相關(guān)正常對(duì)照表達(dá)水平進(jìn)行比較。正常對(duì)照水平是典型地出現(xiàn)在已知未患RCC的群體中的RCC相關(guān)基因的表達(dá)模式。在源自患者的組織樣品中，一種或多種RCC相關(guān)基因表達(dá)水平的變化(例如上升或下降)表示該受試者患有RCC或存在發(fā)生RCC的危險(xiǎn)。例如，與正常對(duì)照水平相比，受試群體中一種或多種上調(diào)RCC基因即RCC1-251的表達(dá)增加，表示該受試者患有RCC或存在發(fā)生RCC的危險(xiǎn)。與之相對(duì)，與正常對(duì)照水平相比，受試群體中一種或多種下調(diào)基因即RCC252-972的表達(dá)減少，表示該受試者患有RCC或存在發(fā)生RCC的危險(xiǎn)。與正對(duì)照水平相比，受試群體中一種或多種RCC相關(guān)基因表達(dá)水平的改變表示該受試者患有RCC或存在發(fā)生RCC的危險(xiǎn)。例如，一系列RCC相關(guān)基因(RCC1-251、RCC252-972、RCC1-972)中至少1%、至少5%、至少25%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或更多發(fā)生改變，表示該受試者患有RCC或存在發(fā)生RCC的危險(xiǎn)。通過定量分析對(duì)應(yīng)于RCC相關(guān)基因的mRNA或者由這些基因編碼的蛋白，可以評(píng)估生物樣品中RCC相關(guān)基因的表達(dá)水平。mRNA的定量分析方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，可以通過Northern印跡分析或RT-PCR來評(píng)估對(duì)應(yīng)于RCC相關(guān)基因的mRNA的水平。RCC相關(guān)基因的核苷酸序列是已知的，因此，任何本領(lǐng)域技術(shù)人員均能夠設(shè)計(jì)出用于定量分析RCC相關(guān)基因的探針或引物。例如，示例性的C67MF2特異性引物組如SEQIDNO:38和12的核普酸序列所示?；蛘?，使用與共有核苷酸序列退火的引物組，可以對(duì)C6700V1和C6700V2兩者進(jìn)行擴(kuò)增。當(dāng)這樣的引物組的擴(kuò)增產(chǎn)物包含變體特異性區(qū)域(即外顯子21的缺失)時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物在序列長(zhǎng)度方面可能各不相同。例如，SEQIDNO:83和84的核苷酸序列的引物可以作為引物組用于兩種變體。而且，還可以使用變體特異性的探針來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，這些基因的表達(dá)水平可以基于由RCC相關(guān)基因編碼的蛋白的活性或量(quantity)來加以分析。后文描述了測(cè)定RCC相關(guān)基因編碼的蛋白的量的方法。例如，可以采用免疫測(cè)定法來確定生物材料中這樣的蛋白的存在。如前面所述，只要腎細(xì)胞癌患者的樣品中表達(dá)標(biāo)志基因(即RCC相關(guān)基因)，可以將任何生物材料用作測(cè)定蛋白或其活性的生物樣品。例如，腎小管是合適的生物樣品的例子。而體液，如血液及尿同樣可以用于分析。另一方面，為了測(cè)定由RCC相關(guān)基因編碼的蛋白的活性，可根據(jù)待分析的蛋白的活性選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。?duì)生物樣品中的RCC相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行評(píng)估，并與正常樣品(例如源自非患病受試者的樣品)中的表達(dá)水平相比較。如果這樣的比較顯示基因的表達(dá)水平比正常樣品中的表達(dá)水平高(表4所示的RCC相關(guān)基因，即1-251)或低(表5所示的RCC相關(guān)基因，即252-972),則判定該受試者患有RCC?？梢酝瑫r(shí)測(cè)定來自正常受試者和待診斷受試者的生物樣品中RCC相關(guān)基因的表達(dá)水平?；蛘呖梢圆捎媒y(tǒng)計(jì)學(xué)方法，根據(jù)從對(duì)照組預(yù)先采集的樣品中基因表達(dá)水平的分析獲得的結(jié)果，確定出表達(dá)水平的正常范圍。將從受試者樣品獲得的結(jié)果與正常范圍進(jìn)行比較，當(dāng)該結(jié)果未落入正常范圍時(shí)，則判定受試者患有RCC或存在發(fā)生RCC的危險(xiǎn)。在本發(fā)明的上下文中，還提供診斷細(xì)胞增殖性疾病，如RCC的診斷試劑。本發(fā)明的診斷試劑的例子包括與RCC相關(guān)基因的多核苷酸或多肽結(jié)合的化合物。優(yōu)選地，使用與RCC相關(guān)基因的多核苷酸雜交的寡核苷酸，或者與RCC相關(guān)基因編碼的多肽結(jié)合的抗體來作為這樣的化合物。本發(fā)明的RCC診斷方法可用于評(píng)價(jià)受試者中RCC治療的有效性。根據(jù)本方法，包括受試細(xì)胞群體的生物樣品，是從接受RCC治療的受試者獲得的。本評(píng)價(jià)方法可依照診斷RCC的常規(guī)方法進(jìn)行。如果希望，可以在治療前、治療中和/或治療后的不同時(shí)間點(diǎn)由受試者獲取生物樣品。然后測(cè)定生物樣品中RCC相關(guān)基因的表達(dá)水平，并與來源于例如包含RCC狀態(tài)已知的細(xì)胞(即癌細(xì)胞或非癌細(xì)胞)的參照細(xì)胞群體的對(duì)照水平相比較。對(duì)照水平在未接受所述的治療的生物樣品中測(cè)定。如果對(duì)照水平來自不含癌細(xì)胞的生物樣品，那么來自患者的生物樣品中的表達(dá)水平與對(duì)照水平的相似性表示關(guān)注的受試者的治療是有效的。而來自患者的生物樣品中的RCC相關(guān)基因表達(dá)水平與對(duì)照水平的差異，表示臨床后果或預(yù)后較不理想。鑒定抑制或增強(qiáng)RCC相關(guān)基因表達(dá)的作用物質(zhì)使表達(dá)RCC相關(guān)的上調(diào)基因的受試細(xì)胞群與受試物質(zhì)接觸，然后測(cè)定RCC相關(guān)基因的表達(dá)水平或其基因產(chǎn)物的活性，可以鑒定抑制RCC相關(guān)基因的表達(dá)或其基因產(chǎn)物的活性的物質(zhì)。與對(duì)照水平(或不存在受試物質(zhì)條件下的表達(dá)或活性水平)相比，存在受試物質(zhì)條件下RCC相關(guān)基因的表達(dá)水平或其基因產(chǎn)物的活性水平降低，表明該物質(zhì)是RCC相關(guān)的上調(diào)基因的抑制劑，并可能有用于抑制RCC的發(fā)生和進(jìn)展?；蛘?，使表達(dá)RCC相關(guān)基因的受試細(xì)胞群與受試物質(zhì)接觸，然后確定RCC相關(guān)的下調(diào)基因的表達(dá)水平或其基因產(chǎn)物的活性，可以鑒定增強(qiáng)RCC相關(guān)下調(diào)基因的表達(dá)或其基因產(chǎn)物活性的物質(zhì)。與RCC相關(guān)基因的對(duì)照表達(dá)水平或活性(或不存在該受試物質(zhì)條件下的水平)相比，存在受試物質(zhì)試物質(zhì)可增加RCC相關(guān)的下調(diào)基因的表達(dá)或其基因產(chǎn)物的活性。受試細(xì)胞群可以是表達(dá)RCC相關(guān)基因的任何細(xì)胞。例如，受試細(xì)胞群可包含上皮細(xì)胞，如源自腎組織的細(xì)胞。而且，受試細(xì)胞還可以是源自腺癌細(xì)胞的永生化細(xì)胞系?；蛘?，受試細(xì)胞還可以是用RCC相關(guān)基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，或者是用與報(bào)道基因可操作相連的、來自RCC相關(guān)基因的調(diào)控序列(例如啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。評(píng)1介受試者中RCC治療的有效性在本說明書中鑒定的差異表達(dá)的RCC相關(guān)基因，為監(jiān)測(cè)RCC的治療過程提供了可能。在該方法中，由接受RCC治療的受試者提供受試細(xì)胞群體。必要時(shí)，在治療前、治療中和/或治療后的不同時(shí)間點(diǎn)由受試者獲取受試細(xì)胞群體。然后，測(cè)定細(xì)胞群體中一種或多種RCC相關(guān)基因的表達(dá)，并與包含RCC狀態(tài)已知的細(xì)胞的參照細(xì)胞群體相比較。在本發(fā)明的上下文中，參照細(xì)胞群體應(yīng)未接受所述的治療。如果參照細(xì)胞群體不含有RCC細(xì)胞，那么受試細(xì)胞群體和參照細(xì)胞群體中RCC相關(guān)基因表達(dá)的相似性表示關(guān)注的受試者的治療是有效的。而受試細(xì)胞群體和正常對(duì)照參照細(xì)胞群體中RCC相關(guān)基因表達(dá)的差異，表示臨床后果或預(yù)后較不理想。類似地，如果參照細(xì)胞群體含有RCC細(xì)胞，那么受試細(xì)胞群體和參照細(xì)胞群體中RCC相關(guān)基因表達(dá)之間的差異表示關(guān)注的受試者的治療是有效的，而受試細(xì)胞群體和正常對(duì)照參照細(xì)胞群體中RCC相關(guān)基因表達(dá)的相似性則表示臨床后果或預(yù)后較不理想。另外，可將在治療后得到的源自受試者的生物樣品中測(cè)定的一種或多種RCC相關(guān)基因的表達(dá)水平(即治療后的水平)與在治療開始之前得到的源自受試者的生物樣品中測(cè)定的一種或多種RCC相關(guān)基因的表達(dá)水平(即治療前的水平)相比較。如果RCC相關(guān)基因是上調(diào)基因，那么治療后樣品中表達(dá)水平的減少表示關(guān)注的受試者的治療是有效的，而治療后樣品中表達(dá)水平的增加或維持則表示臨床后果或預(yù)后較不理想。相反地，如果RCC相關(guān)基因是下調(diào)基因，那么治療后樣品中表達(dá)水平的增加表示關(guān)注的受試者的治療是有效的，而治療后樣品中表達(dá)水平的減少或維持則表示臨床效果或預(yù)后較不理想。在本說明書中，術(shù)語(yǔ)"有效的"表示治療引起受試者體內(nèi)病理性上調(diào)的基因的表達(dá)減少，或病理性下調(diào)的基因的表達(dá)增加，或腎細(xì)胞癌的大小、患病率(prevalence)或轉(zhuǎn)移潛力降低。當(dāng)預(yù)防性施用所述的治療時(shí)，術(shù)語(yǔ)"有效的"指治療延遲或防止腎細(xì)胞癌的形成，或者延遲、防止或減輕RCC的臨床癥狀。腎細(xì)胞癌的評(píng)價(jià)可以使用標(biāo)準(zhǔn)的臨床規(guī)程進(jìn)行。此夕卜，可以與任何已知的診斷或治療RCC的方法相結(jié)合來判別有效性。例如，通過確定癥狀性異常(symptomaticanomalies)可以進(jìn)行RCC的診斷，所述癥狀性異常例如體重減輕、腹痛、背痛、食糸欠減退、惡心、嘔吐和全身不適(generalizedmalaise)、虛弱和黃疽。選擇適于具體個(gè)體的用于治療RCC的治療劑個(gè)體基因組成(geneticmakeup)的差異可導(dǎo)致其代謝多種藥物的相對(duì)能力出現(xiàn)差異。在受試者體內(nèi)代謝從而起到抗RCC劑作用的作用物質(zhì)，可以通過在受試者的細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)癌癥狀態(tài)特征性基因表達(dá)圖式向非癌癥狀態(tài)特征性基因表達(dá)圖式的轉(zhuǎn)變而展現(xiàn)自身。因此，本說明書公開的差異表達(dá)的RCC相關(guān)基因，使得在來自選定受試者的受試細(xì)胞群體中測(cè)試推定的具有治療效果或預(yù)防效果的RCC抑制劑，確定該物質(zhì)在所述受試者中是否是合適的RCC抑制劑成為可能。為了鑒定出適于具體受試者的RCC抑制劑，將來自受試者的受試細(xì)胞群體暴露于治療劑中，然后確定一種或多種RCC1-972基因的表達(dá)。在本發(fā)明方法的上下文中，受試細(xì)胞群體可以含有表達(dá)RCC相關(guān)基因的RCC細(xì)胞。優(yōu)選受試細(xì)胞為上皮細(xì)胞。例如，可以在存在候選物質(zhì)的條件下溫育受試細(xì)胞群體，測(cè)定受試樣品的基因表達(dá)圖式，并與一種或多種參照模式，例如RCC參照表達(dá)模式或非RCC參照表達(dá)模式進(jìn)行比較。相對(duì)于含有RCC的參照細(xì)胞群體而言，受試細(xì)胞群體中一種或多種上調(diào)RCC基因即RCC1-251的表達(dá)減少，或者一種或多種下調(diào)RCC基因即RCC252-972的表達(dá)增加，表示該物質(zhì)具有治療效果。在本發(fā)明的上下文中，受試物質(zhì)可以是任何化合物或組合物。適合在本發(fā)明中使用的例示性的受試物質(zhì)包括但不限于免疫調(diào)節(jié)劑。用于鑒定治療劑的篩選測(cè)定本說明書公開的差異表達(dá)的RCC相關(guān)基因也可以用于鑒定治療RCC的候選治療劑。本發(fā)明的方法包括篩選候選治療劑，以確定該候選治療劑是否能夠?qū)⒁环N或多種RCC相關(guān)基因，例如RCC1-972的RCC狀態(tài)特征性表達(dá)模式轉(zhuǎn)變成非RCC狀態(tài)特征性的基因表達(dá)圖式。在本發(fā)明中，RCC1-972對(duì)于篩選用于治療或預(yù)防RCC的治療劑是有用的。在本方法中，將細(xì)胞暴露于一種或多種受試物質(zhì)(依次或組合)，并測(cè)定RCC1-972中一種或多種基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)。將在受試群體中測(cè)定的RCC相關(guān)基因的表達(dá)模式與未暴露于受試物質(zhì)的參照細(xì)胞群體中相同RCC相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較。能夠刺激過低表達(dá)(under-expressed)基因的表達(dá)或抑制過高表達(dá)基因的表達(dá)的物質(zhì)具有潛在的臨床益處。可以在動(dòng)物或受試者中進(jìn)一步驗(yàn)證這些物質(zhì)防止RCC發(fā)生和進(jìn)展的能力。在另一個(gè)方案中，本發(fā)明提供篩選候選物質(zhì)的方法，所述候選物質(zhì)在RCC治療中是有希望的靶標(biāo)。正如上文所詳細(xì)討論的，控制標(biāo)志基因的表達(dá)水平或它們的基因產(chǎn)物的活性，可以控制RCC的發(fā)生和進(jìn)展。因此，通過采用將所述表達(dá)水平和活性作為癌或非癌狀態(tài)指標(biāo)的篩選方法，可以鑒定出有望成為RCC治療靶標(biāo)的候選物質(zhì)。在本發(fā)明的上下文中，所述篩選可包括例如下述步驟a)使受試化合物與由選自RCC1-972的多核苷酸編碼的多肽接觸；b)檢測(cè)多肽與受試化合物之間的結(jié)合活性；和c)選擇與多肽結(jié)合的受試化合物。用于篩選的由標(biāo)志基因編碼的多肽可以是重組多肽，也可以是來源于自然界的蛋白，或它們的部分肽。與受試化合物相接觸的本發(fā)明的多肽例如可以是純化的多肽、可溶性蛋白、與載體結(jié)合的形態(tài)或與其它多肽融合的融合蛋白。作為篩選蛋白，例如篩選由標(biāo)志基因編碼之多肽結(jié)合的蛋白的方法，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多方法。這樣的篩選可通過，例如，免疫沉淀法，具體地以下述方式進(jìn)行。通過將標(biāo)志基因插入外源基因表達(dá)載體，包括^f旦不限于pSV2neo，pcDNAI，pcDNA3.1，pCAGGS和pCD8，使標(biāo)志基因在宿主(例如動(dòng)物)細(xì)胞等中表達(dá)。用于表達(dá)的啟動(dòng)子可以是通常使用的任何啟動(dòng)子，包括，例如，SV40早期啟動(dòng)子(RigbyinWilliamson(ed.)，(1982)GeneticEngineering,vol.3.AcademicPress,London,83-141)、EF-a啟動(dòng)子(Kim^a/.，Gene91:217-23(1990))、CAG啟動(dòng)子(Niwa"a/.，(1991)Gene108:193-9)、RSVLTR啟動(dòng)子(Cullen，(1987)MethodsinEnzymology152:684-704)、SRa啟動(dòng)子(TakebeW(1988)MolCellBiol8:466-72)、CMV立即早期啟動(dòng)子(CMVimmediateearlypromoter)(SeedandAruffo,(1987)ProcNatlAcadSciUSA84:3365-9)、SV40晚期啟動(dòng)子(GheysenandFiers，(1982)JMolApplGenet1:385-94)、腺病毒晚期啟動(dòng)子(Adenoviruslatepromoter)(KaufmanWa/.,(1989)MolCellBiol9:946-58)、HSVTK啟動(dòng)子等?？梢愿鶕?jù)任何方法將欲表達(dá)的外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞，這些方法例如電穿孔法(Chua/.，(1987)NucleicAcidsRes15:1311-26)、磷酸鉤法(ChenandOkayama，(1987)MolCellBiol7:2745-52)、DEAE葡聚糖法(Lopata"(1984)NucleicAcidsRes12:5707-17;SussmanandMilman,(1984)MolCellBiol4:1641-3)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(Lipofectin)法(DerijardB，a/"(1994)Cell76:1025-37;Lamb"fl/"(1993)NatureGenetics5:22-30:Rabindran"(1993)Science259:230-4)等。通過將特異性已知的單克隆抗體的識(shí)別位點(diǎn)(表位)導(dǎo)入多肽的N末端或C末端，可以以包含單克隆抗體的識(shí)別位點(diǎn)的融合蛋白的形式表達(dá)由標(biāo)志基因編碼的多肽。也可以使用商業(yè)上可得到的表位-抗體系統(tǒng)(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))?？梢岳闷涠嗫寺∥稽c(diǎn)表達(dá)與例如(3-半乳糖苷酶、麥芽糖-結(jié)合蛋白、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、綠色熒光蛋白(GFP)等的融合蛋白的載體是商業(yè)上可得到的。還報(bào)道了通過僅引入由幾個(gè)到十幾個(gè)氨基酸組成的小表位，使得所述多肽的特性不因融合而改變，而制備的融合蛋白。如聚組氨酸(His標(biāo)簽)、流感病毒凝集物(influenzaaggregate)HA、人c-myc、FLAG、水泡性口膜炎病毒斗唐蛋白(Vesicularstomatitisvirusglycoprotein)(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7才示簽)、人單純皰滲病毒并唐蛋白(humansimpleherpesvirusglycoprotein)(HSV標(biāo)簽)、E標(biāo)簽(單克隆噬菌體上的表位)等，以及識(shí)別它們的單克隆抗體都可以用作表位-抗體系統(tǒng)來篩選能結(jié)合由標(biāo)志基因編碼的多肽的蛋白(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))。在免疫沉淀法中，向用合適的洗滌劑(detergent)制備的細(xì)胞裂解物中添加這些抗體，形成免疫復(fù)合物。所述免疫復(fù)合物由標(biāo)志基因所編碼的多肽、具有與該多肽結(jié)合的能力的多肽和抗體組成。除使用抗上述表位的抗體之外，還可以使用抗標(biāo)志基因編碼多肽的抗體進(jìn)行免疫沉淀，所述抗體可選地如上所述制備。當(dāng)所述抗體是一種小鼠IgG抗體時(shí)，可以通過例如蛋白ASepharose或蛋白GSepharose沉淀免疫復(fù)合物。如果將由標(biāo)志基因編碼的多肽制備成帶有表位如GST的融合蛋白，可使用與這些表位特異性結(jié)合的物質(zhì)，例如谷胱甘肽-Sepharose4B等，按照與使用抗多肽的抗體相同的方式形成免疫復(fù)合物。免疫沉淀可以4艮寺居或遵照，例如文獻(xiàn)(HarlowandLane,(1988)Antibodies，511-52,ColdSpringHarborLaboratorypublications,NewYork)中的方法進(jìn)行。通常使用SDS-PAGE對(duì)免疫沉淀的蛋白進(jìn)行分析，可以使用合適濃度的凝膠通過蛋白的分子量來分析結(jié)合的蛋白。由于采用常規(guī)染色法例如考馬斯(Coomassie)染色或銀染色難以檢測(cè)與標(biāo)志基因所編碼的多肽結(jié)合的蛋白，因而可以通過下述方法改進(jìn)所述蛋白的檢測(cè)靈敏度在含有放射性同位素"S-曱硫氨酸或"S-半胱氨酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，在細(xì)胞中標(biāo)志蛋白，并檢測(cè)蛋白。在已知蛋白的分子量時(shí)，可以從SDS-聚丙烯酰胺凝膠中直接純化出目標(biāo)蛋白并測(cè)定其序列。作為與標(biāo)志基因編碼之多肽結(jié)合的蛋白的篩選方法，可以采用例如West-Western印跡分析(Skolnik"a/，(1991)Cell65:83-90)。具體地說，可以通過下述方法獲得能夠結(jié)合標(biāo)志基因所編碼的多肽的蛋白使用噬菌體載體(例如ZAP),由期望表達(dá)與標(biāo)志基因所編碼的多肽結(jié)合的蛋白的細(xì)胞、組織、器官(例如，組織如睪丸或卵巢)或者培養(yǎng)的細(xì)胞(例如Caki-l,Caki-2，786-0，A704，OS-RC-2，TUHR14TKB和A498)制備cDNA文庫(kù)；在LB-瓊脂糖(LB-agarose)上表達(dá)該蛋白，將表達(dá)的蛋白固定在濾膜(filter)上，再使經(jīng)純化和標(biāo)記的多肽與上述濾膜反應(yīng)，然后根據(jù)標(biāo)記檢測(cè)表達(dá)與標(biāo)志基因所編碼的多肽結(jié)合的蛋白的噬斑?？梢岳蒙锼嘏c抗生物素蛋白之間的結(jié)合，或者可以利用與標(biāo)志基因編碼的多肽特異性結(jié)合或與融合于該多肽的肽或多肽(例如GST)特異性結(jié)合的抗體，對(duì)由標(biāo)志基因編碼的多肽進(jìn)行標(biāo)記。也可以采用使用放射性同位素或熒光等的方法?；蛘?，在本發(fā)明的篩選方法的另一實(shí)施方案中，可以使用利用細(xì)胞的雙雜交系統(tǒng)(two-hybridsystem)("MATCHMAKER雙雜交系統(tǒng)"、"哺乳動(dòng)物MATCHMAKER雙雜交測(cè)定試劑盒"、"MATCHMAKER單雜交系統(tǒng)"(Clontech);"HybriZAP雙雜交載體系統(tǒng)"(Stratagene);參照"DaltonandTreisman，(1992)Cell68:597-612"，"FieldsandStemglanz,(1994)TrendsGenet10:286-92")。在雙雜交系統(tǒng)中，將本發(fā)明的多肽與SRF-結(jié)合區(qū)或GAL4-結(jié)合區(qū)融合，并在酵母細(xì)胞中表達(dá)。由預(yù)期表達(dá)與本發(fā)明的多肽結(jié)合的蛋白的細(xì)胞制備cDNA文庫(kù)，使該文庫(kù)在表達(dá)時(shí)與VP16或GAL4轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域(transcriptionalactivationregion)融合。然后將cDNA文庫(kù)導(dǎo)入上述酵母細(xì)月包，并從檢測(cè)到的陽(yáng)性克隆分離出源自所述文庫(kù)的cDNA(當(dāng)在酵母細(xì)胞中表達(dá)可與本發(fā)明的多肽結(jié)合的蛋白時(shí)，兩者的結(jié)合激活報(bào)道基因，使得陽(yáng)性克隆可被4企測(cè)到)。通過將上述分離的cDNA導(dǎo)入大腸桿菌并表達(dá)蛋白，可以制備由該cDNA編碼的蛋白。報(bào)道基因的例子，除HIS3基因外，還包括但不限于Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、螢光素酶基因等。采用親和層析法同樣可以篩選可與由標(biāo)志基因編碼的多肽結(jié)合的化合物。例如，可以將由標(biāo)志基因編碼的多肽固定于親和層析柱的載體上，并將受試化合物加于該層析柱，所述受試化合物包含能與由標(biāo)志基因編碼的多肽結(jié)合的蛋白。本說明書中的受試化合物可以是例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞裂解物等。在將所述受試化合物上樣后，對(duì)層析柱進(jìn)行洗滌，可制備出已與所述多肽結(jié)合的化合物。當(dāng)受試化合物是蛋白時(shí)，分析獲得的蛋白的氨基酸序列，基于該序列合成寡聚DNA,以該寡聚DNA為探針篩選cDNA文庫(kù)，從而獲得編碼所述蛋白的DNA。在本發(fā)明中，可以將利用表面等離子體共振現(xiàn)象(surfaceplasmonresonancephenomenon)的生物傳感器(biosensor)用作對(duì)結(jié)合的化合物進(jìn)行檢測(cè)或定量的手段。當(dāng)使用這類生物傳感器時(shí)，只使用極少量的多肽且不需標(biāo)記(例如BIAcore，Pharmacia),即可通過表面等離子體共振信號(hào)實(shí)時(shí)觀察本發(fā)明的多肽和受試化合物之間的相互作用。因此，使用生物傳感器諸如BIAcore來評(píng)價(jià)由標(biāo)志基因編碼的多肽和受試化合物之間的結(jié)合是可能的。當(dāng)固定化的由標(biāo)志基因編碼的多肽暴露于合成化合物、天然物質(zhì)庫(kù)或隨機(jī)噬菌體肽展示文庫(kù)時(shí)，篩選與之結(jié)合的分子的方法，以及用于分離所述蛋白及結(jié)合所述蛋白的化合物(包括激動(dòng)劑和拮抗劑)的、基于組合化學(xué)技術(shù)的高通量篩選方法(Wrighton等，(1996)Science273:458-64;Verdine,(1996)Nature384:11-13),是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。或者，本發(fā)明提供使用標(biāo)志基因編碼的多肽來篩選用于治療或預(yù)防RCC的化合物的方法，該方法包括以下步驟(a)使受試化合物與多肽接觸，所述多肽由選自RCC1-972的多核苷酸編碼；(h^企測(cè)步驟(a)的多肽的生物活性；和(c)選擇下述化合物與不存在受試化合物的條件下檢出的生物活性相比較，所述化合物抑制由選自RCC1-251的多核苷酸編碼的多肽的生物活性，或增強(qiáng)由選自RCC252-972的多核芬酸編碼的多肽的生物活性?？梢允褂脴?biāo)志基因的核普酸序列，以重組蛋白的形式獲得可用于本發(fā)明的篩選方法的蛋白。任何多肽均可用于篩選，只要它們保持由標(biāo)志基因編碼的多肽的生物活性?；谂c標(biāo)志基因及其編碼的蛋白有關(guān)的信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇蛋白的任何生物活性作為篩選指標(biāo)，并可以選擇任何適當(dāng)?shù)臏y(cè)量方法來測(cè)定選擇的生物活性。通過這種篩選分離的化合物是由標(biāo)志基因編碼的多肽的激動(dòng)劑或拮抗劑的候選物。術(shù)語(yǔ)"激動(dòng)劑"指通過與所述多肽結(jié)合而活化其功能的分子。同樣地，術(shù)語(yǔ)"拮抗劑"指通過與所述多肽結(jié)合而抑制其功能的分子。而且，通過這種篩選而分離的化合物，是標(biāo)志基因編碼多肽與分子(包括DNA和蛋白)的體內(nèi)相互作用的候選抑制劑或刺激劑。當(dāng)本發(fā)明的方法中檢測(cè)的生物活性為細(xì)胞增殖時(shí)，可以通過如實(shí)施例所述的如下方法進(jìn)行檢測(cè)例如，制備表達(dá)由標(biāo)志基因編碼的多肽的細(xì)胞，在存在受試化合物的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞，測(cè)定細(xì)胞增殖速度，測(cè)定細(xì)胞周期等，以及測(cè)定集落形成活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供篩選用于治療或預(yù)防RCC的化合物的方法。如上詳細(xì)描述，通過控制標(biāo)志基因的表達(dá)水平，可以控制RCC的發(fā)生和進(jìn)展。因而，通過以標(biāo)志基因的表達(dá)水平為指標(biāo)進(jìn)行篩選，可以鑒定可用于治療或預(yù)防RCC的化合物。在本發(fā)明的上下文中，這樣的篩選可包括例如以下步驟(a)使候選化合物與表達(dá)一種或多種標(biāo)志基因的細(xì)胞接觸，其中所述一種或多種標(biāo)志基因選自RCC1-972;和(b)選擇這樣的候選化合物其降低選自RCC1-251的一種或多種標(biāo)志基因的表達(dá)水平，或提高選自RCC252-972的一種或多種標(biāo)志基因的表達(dá)水平。表達(dá)標(biāo)志基因的細(xì)胞，包括例如由RCC建立的細(xì)胞系；這樣的細(xì)胞可以用于本發(fā)明的上述篩選(例如Caki-l,Caki-2,786-0，A704,OS畫RC-2，TUHR14TKB和A498)。表達(dá)水平可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行評(píng)估。在本篩選方法中，降低或增強(qiáng)一種或多種標(biāo)志基因的表達(dá)水平的化合物是用于RCC治療或預(yù)防的候選物質(zhì)?；蛘?，本發(fā)明的篩選方法可以包括以下步驟a)使候選化合物與其中導(dǎo)入了載體的細(xì)胞接觸，其中所述載體含有一種或多種標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)及在該轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的調(diào)控下表達(dá)的報(bào)道基因，其中所述一種或多種標(biāo)志基因選自RCC1-972;b)測(cè)定該報(bào)道基因的表達(dá)水平或活性；和c)選擇這樣的候選化合物沒有該候選化合物時(shí)檢測(cè)到的表達(dá)水平相比，當(dāng)所述標(biāo)志基因?yàn)檫x自RCC1-251的上調(diào)標(biāo)志基因時(shí)，該化合物減少該報(bào)道基因的表達(dá)或活性水平；或，當(dāng)所述標(biāo)志基因?yàn)檫x自RCC252-972的下調(diào)標(biāo)志基因時(shí)，該化合物增加該報(bào)道基因的表達(dá)水平。合適的報(bào)道基因和宿主細(xì)胞是本領(lǐng)域公知的。使用標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)可以制備適用于本發(fā)明的篩選方法的報(bào)道分子構(gòu)建體。當(dāng)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)時(shí)，可以使用先前的序列信息來制備報(bào)道分子構(gòu)建體。當(dāng)標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)仍未鑒定時(shí)，可以基于標(biāo)志基因的核苷酸序列信息從基因組文庫(kù)中分離含有轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的核苷酸區(qū)段。可用于結(jié)合蛋白的支持物(support)的實(shí)例包括不溶性多糖，如瓊脂糖、纖維素和葡聚糖；及合成樹脂，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅(silicon);可優(yōu)選使用由上述材料制備的商業(yè)上可得到的珠子和板(例如多孔板，生物傳感器芯片等)。使用珠子時(shí)，可以將它們填入柱子。蛋白與支持物的結(jié)合可根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行，這些方法例如化學(xué)結(jié)合或物理吸附。此外，蛋白可通過特異性識(shí)別它的抗體而與支持物結(jié)合。此外，還可以利用抗生物素蛋白和生物素來實(shí)施多肽與支持物的結(jié)合。蛋白之間的結(jié)合優(yōu)選在緩沖液中進(jìn)行，緩沖液的例子包括但不限于磷酸鹽緩沖液和Tris緩沖液。但是，任何不抑制蛋白之間結(jié)合的緩沖液都是適用的。本發(fā)明中，利用表面等離子體共振現(xiàn)象的生物傳感器可用作檢測(cè)或定量已結(jié)合的蛋白的裝置。使用這樣的生物傳感器(例如BIAcore,Pharmacia)時(shí)，僅使用少量的多肽，而且無需標(biāo)記，即可通過表面等離子體共振信號(hào)實(shí)時(shí)觀察蛋白之間的相互作用?；蛘撸梢詫?duì)標(biāo)志基因編碼的多肽進(jìn)行標(biāo)記，結(jié)合蛋白的標(biāo)記可用于檢測(cè)或測(cè)定已結(jié)合的蛋白。具體地，對(duì)一種蛋白進(jìn)行預(yù)標(biāo)記之后，在受試化合物存在的條件下使標(biāo)記的蛋白與其它蛋白接觸，然后在洗涂之后根據(jù)標(biāo)記檢測(cè)或測(cè)量已結(jié)合的蛋白。本發(fā)明的方法中，可以使用標(biāo)記物質(zhì)來標(biāo)記蛋白，所述標(biāo)記物質(zhì)如放射性同位素(例如3H、14c、32p、33p、35s、125i、131i)、酶(例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、p-半乳糖苷酶、p-葡糖苷酶)、熒光物質(zhì)(例如，異硫氰酸焚光素(fitc)、羅丹明)和生物素/抗生物素蛋白。當(dāng)用放射性同位素標(biāo)記蛋白時(shí)，可通過液體閃爍法(liquidscintillation)進(jìn)4亍沖企測(cè)或測(cè)定。或者，通過加入該酶的底物，用吸收光度計(jì)(absorptiometer)檢測(cè)或測(cè)定底物的酶促變化(如產(chǎn)生顏色)，從而可以檢測(cè)或測(cè)定用酶標(biāo)記的蛋白。此外，將熒光物質(zhì)用作標(biāo)記的情況中，可利用熒光光度計(jì)檢測(cè)或測(cè)定已結(jié)合的蛋白。在本發(fā)明篩選方法的語(yǔ)境中使用抗體時(shí)，優(yōu)選利用上述標(biāo)記物質(zhì)之一對(duì)所述抗體進(jìn)行標(biāo)記，并基于標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行纟企測(cè)或測(cè)定。或者，也可以將抗標(biāo)志基因編碼的多肽或生物素的抗體用作第一抗體(primaryantibody),使用以標(biāo)記物質(zhì)標(biāo)記的第二抗體對(duì)其進(jìn)行;險(xiǎn)測(cè)。此外，本發(fā)明的篩選中與蛋白結(jié)合的抗體，可使用蛋白G或蛋白A柱加以檢測(cè)或測(cè)定。在本發(fā)明的篩選方法中可以使用任何受試化合物，例如細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清、發(fā)酵微生物的產(chǎn)物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗制蛋白、肽、非肽化合物、合成的小分子化合物以及天然化合物。在本發(fā)明的上下文中，受試化合物可以還使用本領(lǐng)域已知的組合文庫(kù)法中多種手段的任一種獲得，所述方法包括(l)生物學(xué)文庫(kù)，(2)空間可尋址平行固相或溶液相文庫(kù)(spatiallyaddressableparallelsolidphaseorsolutionphaselibraries),(3)需要解巻積(deconvolution)的合成文庫(kù)法，(4)"一珠一化合物(onebeadonecompound)"文庫(kù)法和(5)使用親和層析選擇的合成文庫(kù)法。其中，使用親和層析選擇的生物學(xué)文庫(kù)法僅限于肽文庫(kù)，而其它四種方法適用于肽，非肽寡聚體或化合物小分子文庫(kù)(Lam(1997)AnticancerDrugDes.12:145-67)。合成分子文庫(kù)的方法的舉例可見于本
技術(shù)領(lǐng)域：
(DeWittWa/.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6909-13;Erb"(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11422-6;Zuckermann"a/.(1994)J.Med.Chem.37:2678-85;ChoW(1993)Science261:1303-5;Carelld(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carell"(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061;Gallop"a/.(1994)J.Med.Chem.37:1233-51)?；衔镂膸?kù)可存在于溶液中(參見Houghten(1992)Bio/Techniques13:412-21),和珠子上(Lam(1991)Nature354:82-4),芯片(Fodor(1993)Nature364:555-6)，細(xì)菌(美國(guó)專利5，223，409)，孢子(美國(guó)專利5,571,698;5,403,484和5,223,409),質(zhì)粒(Cull等(1992)Proc.Natl,Acad.Sci.USA89:1865-9)或噬菌體(ScottandSmith(1990)Science249:386-卯；Delvin(1990)Science249:404-6;Cwirla等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378-82;Felici(1991)J.Mol.Biol.222:301-10;美國(guó)專利申請(qǐng)2002103360)。通過本發(fā)明的篩選方法分離的化合物可用于抑制或增強(qiáng)由標(biāo)志基因編碼的多肽的活性，來治療或預(yù)防例如RCC等起因于細(xì)胞增殖性疾病的疾病。此外，通過本發(fā)明的篩選方法獲得的化合物，還包括本發(fā)明的篩選方法獲得的化合物中部分結(jié)構(gòu)發(fā)生添加、缺失和/或取代而得的化合物。用于治療或預(yù)防RCC的藥物組合物本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防腎細(xì)胞癌的組合物，其含有通過上述本發(fā)明的篩選方法選擇的任意化合物。當(dāng)將通過本發(fā)明的篩選方法分離的化合物作為藥物施用于人或其它哺乳動(dòng)物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、貓、犬、綿羊、豬、牛、猴、狒狒、黑猩猩時(shí)，分離的化合物可以直接施用，或者可以利用已知的藥物制備方法配制成劑型。例如，根據(jù)需要，所述藥物可以作為糖衣片劑、膠嚢劑、酏劑和微膠嚢口服；或者用水或任何其它藥學(xué)可接受的液體配制成無菌溶液或懸浮液，以注射劑的形式非口服攝取。例如，可以將化合物在一般接受的藥物施用方式所需的單位劑型(unitdose)中，與藥學(xué)可接受的載體或介質(zhì)混合在一起，所述載體或介質(zhì)具體有無菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、調(diào)味劑、賦形劑(excipient)、媒介物(vehicle),防腐劑、粘合劑等。根據(jù)這些制劑中活性成分的量，可以獲得在指定范圍內(nèi)的合適的給藥量。能夠混合到片劑和膠嚢中的添加劑的例子包括但不限于粘合劑如明膠、玉米淀粉、黃蓍膠(tragacanthgum)和阿拉伯膠，賦形劑例如結(jié)晶纖維素，溶脹劑例如玉米淀粉、明膠和海藻酸(alginicacid)，潤(rùn)滑劑例如硬脂酸4美，增甜劑例如蔗糖、乳糖或糖精，和調(diào)味劑例如薄荷(peppermint)、Gaw/Aen'fl油和櫻桃。當(dāng)單位劑型為膠嚢劑時(shí)，上述成分中還可以包括液體載體，例如油。注射用無菌組合物可以使用溶媒(vehicle)例如注射用蒸餾水，」接照標(biāo)準(zhǔn)的藥物配制方式進(jìn)4t配制。生理鹽水、葡萄糖以及包含輔料(adjuvants)，如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化鈉的其它等滲液體，可用作注射用水溶液。這些可以與合適的增溶劑組合使用，所述增溶劑諸如醇，例如乙醇，多元醇例如丙二醇和聚乙二醇，非離子表面活性劑例如Polysorbate80(TM)和HCO-50。芝麻油或大豆油是油質(zhì)液體的實(shí)例，所述油質(zhì)液體可以與苯甲酸爺酯或苯曱醇組合使用作為增溶劑，還可與緩沖液如磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩沖液、鎮(zhèn)痛劑如鹽酸普魯卡因、穩(wěn)定劑如苯曱醇和酚和/或抗氧化劑配制在一起。制備的注射劑可以裝入到合適的安瓿(ampoule)中?？梢岳帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法給患者施用本發(fā)明的藥物組合物，例如作為動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)或經(jīng)皮注射，或作為鼻內(nèi)、肌肉內(nèi)或口服給藥施用于患者。施用劑量和方法因患者的體重和年齡以及施用方法而異；不過，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠按常規(guī)選擇合適的施用方法。如果所述化合物可以由DNA編碼，則可將該DNA插入到基因治療用載體中，并給患者施用該載體以進(jìn)行治療。施用的劑量和方法因患者的體重、年齡和癥狀而異，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠合適地選擇它們。舉例來說，當(dāng)向普通成年人(體重60kg)口服施用與本發(fā)明的蛋白結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的化合物時(shí)，雖然根據(jù)其癥狀存在一些差異，但劑量通常為約0.1mg-約100mg每天，優(yōu)選為約l.Omg-約50mg每天，更優(yōu)選為約1.0mg-約20mg每天。當(dāng)以注射劑形式向普通成年人(體重60kg)非消化道給藥時(shí)，雖然根據(jù)患者、耙器官、癥狀和給藥方法存在一些差異，但方便的做法是靜脈內(nèi)注射約0.01mg-約30mg每天，優(yōu)選約0.1mg-約20mg每天，更優(yōu)選約0.1mg-約10mg每天的劑量。而且，在其它動(dòng)物的情況下，可以按60kg體重的標(biāo)準(zhǔn)換算常規(guī)算出合適的施用量。評(píng)估患腎細(xì)胞癌的受試者的預(yù)后本發(fā)明還提供評(píng)估患有RCC的受試者的預(yù)后情況的方法，所述方法包括將受試細(xì)胞群體中的一種或,多種RCC相關(guān)基因的表達(dá)與源自一系列疾病階段的患者的參照細(xì)胞群體中相同RCC相關(guān)基因的表達(dá)相比較的步驟。通過比較受試細(xì)胞群體與參照細(xì)胞群體中一種或多種RCC相關(guān)基因的基因表達(dá)，或隨時(shí)間比較源自受試者的受試細(xì)胞群體中基因的表達(dá)圖式，可以評(píng)估受試者的預(yù)后情況。例如，與正常對(duì)照相比，一種或多種下調(diào)的RCC相關(guān)基因，例如RCC252-972的表達(dá)減少，或者，與正常對(duì)照相比，一種或多種上調(diào)的RCC相關(guān)基因，例如RCC1-251的表達(dá)增加，表示預(yù)后不佳。相反地，一種或多種RCC相關(guān)基因(例如RCC1-972)的表達(dá)與正常對(duì)照相似，表示受試者預(yù)后比較良好。優(yōu)選地，可以通過比較RCC1-972的表達(dá)模式來評(píng)估受試者的預(yù)后情況。試劑盒本發(fā)明還包括RCC檢測(cè)試劑，例如特異性結(jié)合或鑒定一種或多種RCC核酸的核酸(諸如與RCC核酸的一部分互補(bǔ)的寡核苷酸序列)或者能夠與由RCC核酸編碼的蛋白結(jié)合的抗體。所述檢測(cè)試劑可以以試劑盒的形式包裝在一起。例如，可以將檢測(cè)試劑分別包裝在不同的容器中，例如核酸或抗體(可與固體基質(zhì)結(jié)合，或與將其同基質(zhì)結(jié)合的試劑分開包裝)、對(duì)照試劑(陽(yáng)性和/或陰性)和/或可檢測(cè)的標(biāo)記。試劑盒內(nèi)還可以包括實(shí)施所述測(cè)定的說明(如書面說明書、磁帶、VCR、CD-ROM等)。試劑盒的測(cè)定樣式可以是本領(lǐng)域已知的Northern雜交或夾心ELISA。例如，可以將RCC檢測(cè)試劑固定于固體基質(zhì)如多孔片條(porousstrip)上，以形成至少一個(gè)RCC檢測(cè)位點(diǎn)。多孔片條的測(cè)定區(qū)或檢測(cè)區(qū)可以包括多個(gè)位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)都含有核酸。測(cè)試片條也可以含有陰性和/或陽(yáng)性對(duì)照的位點(diǎn)?；蛘?，對(duì)照位點(diǎn)可以設(shè)置于與測(cè)試片條不同的片條上。任選地，不同的檢測(cè)位點(diǎn)可以含有不同量的固定化核酸，即第一個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)量較高，隨后的位點(diǎn)量較少。添加受試樣品后，顯示可測(cè)信號(hào)的位點(diǎn)數(shù)目提供樣品中存在的RCC的量的定量指標(biāo)(quantitativeindication)。4企測(cè)位點(diǎn)的形狀可以是任何適宜的可檢測(cè)的形狀，一般為跨越測(cè)試片條寬度的條狀或點(diǎn)狀。或者，試劑盒還包括含有一種或多種核酸的核酸基質(zhì)(nucleicacidsubstrate)陣列。陣列上的核酸特異性地鑒定由RCC1-972表示的一種或多種核酸序列。通過與陣列測(cè)試片條或芯片的結(jié)合水平可以鑒定由RCC1-972表示的2,3，4,5，6,7，8，9，10,15,20，25，40,50或更多種核酸的表達(dá)。基質(zhì)陣列可以存在于例如固體基質(zhì)上，所述固體基質(zhì)如美國(guó)專利5,744,305(其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考)中描述的"芯片"。陣列和核酸群(pluralities):本發(fā)明還包括一種或多種核酸的核酸基質(zhì)陣列。陣列上的核酸特異性地對(duì)應(yīng)RCC1-972所示的一種或多種核酸序列。通過^f企測(cè)與陣列結(jié)合的核酸，可鑒定RCC1-972所示的2,3,4,5，6,7,8，9,10，15，20，25，40,50或更多種核酸的表達(dá)水平。本發(fā)明還包括分離的(isolated)多種核酸的群(即兩種以上核酸的混合物)。核酸可以存在于液相或固相中，例如固定于如硝酸纖維素膜的固體支持物上。該群包含一種或多種RCC1-972所示的核酸。在多個(gè)實(shí)施方案中，核酸群包含RCC1-972所示的2,3，4，5,6,7,8,9，10，15,20,25，40，50或更多種核酸。抑制腎細(xì)胞癌的方法本發(fā)明還提供通過減少RCC1-251中的一種或多種基因的表達(dá)(或其基因產(chǎn)物的活性)、或者增加RCC252-972中的一種或多種基因的表達(dá)(或其基因產(chǎn)物的活性)來治療或減輕受試者中的RCC癥狀的方法?？梢詫⑦m當(dāng)?shù)闹委熁衔镱A(yù)防性或治療性地施用于患有RCC或處于RCC發(fā)病危險(xiǎn)中(或?qū)CC易感)的受試者。采用標(biāo)準(zhǔn)的臨床方法或者通過^r測(cè)RCC1-972中的一種或多種的異常表達(dá)水平(或相應(yīng)基因產(chǎn)物的活性)，可以鑒定出上述受試者。適當(dāng)?shù)闹委焺┑睦影ǖ幌抻诩?xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖和蛋白激酶活性的抑制劑。本發(fā)明的治療方法包括如下步驟增加一種或多種下述基因之基因產(chǎn)物的表達(dá)和/或活性與RCC細(xì)胞所來源的同一組織類型的正常細(xì)胞相比，所述基因的表達(dá)在RCC細(xì)胞中減少("下調(diào)"或"過低表達(dá)"基因)。在這些方法中，使用有效量的化合物對(duì)受試者進(jìn)行治療，所述化合物提高受試者中一種或多種過低表達(dá)基因的量。給藥可以是全身給藥或局部給藥。適宜的治療化合物包括但不限于過低表達(dá)基因的多肽產(chǎn)物，其生物活性片段，和編碼過低表達(dá)基因且具有允許在RCC細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)調(diào)控元件的核酸；例如，提高RCC細(xì)胞內(nèi)源性的此類基因的表達(dá)水平(即上調(diào)一種或多種過低表達(dá)基因的表達(dá))的物質(zhì)。施用這樣的化合物可對(duì)抗受試者腎細(xì)胞中一種或多種異常過低表達(dá)基因的影響，并改善受試者的臨床狀況。或者，本發(fā)明的治療方法可包括如下步驟減少在RCC細(xì)胞中表達(dá)異常增加的一種或多種基因("上調(diào)的"或"過高表達(dá)的"基因)的基因產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能?？梢园凑毡绢I(lǐng)域已知的幾種方法中的任何一種來抑制表達(dá)。例如，通過給受試者施用抑制或拮抗一種或多種過高表達(dá)基因的表達(dá)的核酸可以抑制表達(dá)，所述核酸例如破壞一種或多種過高表達(dá)基因的表達(dá)的反義寡核苷酸或小干擾RNA。反義多核芬酸如上所述，使用對(duì)應(yīng)于RCC1-251的核苷酸序列的反義核酸，可以降低RCC1-251的表達(dá)水平。對(duì)應(yīng)于在腎細(xì)胞癌中上調(diào)的RCC1-251的反義核酸對(duì)于腎細(xì)胞癌的治療是有用的。具體地說，本發(fā)明的反義核酸可通過與RCC1-251或與之對(duì)應(yīng)的mRNA結(jié)合而發(fā)揮作用，從而抑制所述基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)所述mRNA降解和/或抑制RCC1-251所編碼的蛋白的表達(dá)，由此抑制蛋白的功能。本說明書中使用的術(shù)語(yǔ)"反義核酸"包括與靶序列完全互補(bǔ)的核苷酸和具有一個(gè)或多個(gè)核苷酸錯(cuò)配的核苷酸，只要該反義核酸能與靶序列特異性雜交。例如，本發(fā)明的反義核酸包括那些在至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的范圍(span)內(nèi)，具有至少70%或更高、優(yōu)選至少80%或更高、更優(yōu)選至少90%或更高、更優(yōu)選至少95%或更高的同源性的多核苷酸。所述同源性可使用本領(lǐng)域已知的算法確定。本發(fā)明的反義核酸通過如下方式作用于產(chǎn)生由RCC相關(guān)標(biāo)志基因編碼的蛋白的細(xì)胞與編碼該蛋白的DNA或mRNA結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄或翻譯，促進(jìn)mRNA降解并抑制蛋白的表達(dá)，由此抑制蛋白的功能。通過與合適的基質(zhì)混合，可以將本發(fā)明的反義核酸制成外用制劑，如搽劑(liniment)或罨劑(poultice),其中所述合適的基質(zhì)對(duì)核酸是惰性的。并且，根據(jù)需要，通過添加賦形劑、等滲劑(isotonicagents)、增溶劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、鎮(zhèn)痛劑等，可以將本發(fā)明的反義核酸配制成例如片劑、粉末、顆粒、膠嚢、脂質(zhì)體膠嚢、注射劑、溶液、滴鼻劑和凍干劑。這些劑型可通過如下的公知方法制備。給患者施用本發(fā)明的反義核酸，可以直接將其施于患處，也可以將其輸入血管以使其到達(dá)患處。還可以使用反義封固介質(zhì)(antisense-mountingmedium)可以提高持久性和膜通透性。例子包括但不限于脂質(zhì)體、聚-L-賴氨酸、脂質(zhì)、膽固醇、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(lipofectin)或它們的衍生物。本發(fā)明的反義核酸的劑量，可以根據(jù)患者的狀況適當(dāng)調(diào)整，并以所需的量使用。例如，可以施用的劑量范圍為0.1至100mg/kg,優(yōu)選O.l至50mg/kg。本發(fā)明的反義核酸抑制本發(fā)明蛋白的表達(dá)，因而可以用于抑制本發(fā)明蛋白的生物活性。此外，含有本發(fā)明的反義核酸的表達(dá)抑制劑也可以用于抑制本發(fā)明的蛋白的生物活性。本發(fā)明的反義核酸包括經(jīng)修飾的寡核苷酸。例如，使用硫羰酸化(thioated)寡核苷酸可使寡核苷酸具有核酸酶抗性。可以使用針對(duì)標(biāo)志基因的siRNA來降低標(biāo)志基因的表達(dá)水平。本說明書中，術(shù)語(yǔ)"siRNA，，指阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。采用將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，這其中包括以DNA為RNA轉(zhuǎn)錄的模板的技術(shù)。siRNA包含下述兩者或兩者之一有義RCC1-251(例如C6700(RCC81)、B7032N(RCC126)或B9320(RCC173))核酸序列，反義RCC1-251(例如C6700、B7032N或B9320)核酸序列。siRNA可以由兩個(gè)互補(bǔ)的分子構(gòu)成；也可以構(gòu)建siRNA使其單一轉(zhuǎn)錄物具有來自靶基因的有義序列和互補(bǔ)的反義序列，例如發(fā)夾；在一些實(shí)施方式中，其導(dǎo)致微小RNA(microRNA,miRNA)的產(chǎn)生。在靶細(xì)胞中，siRNA與對(duì)應(yīng)于RCC1-251中之一的轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白減少。寡核苷酸的長(zhǎng)度為至少IO個(gè)核苷酸，可以與天然存在的轉(zhuǎn)錄物等長(zhǎng)。優(yōu)選寡核苷酸的長(zhǎng)度為不足75、50、25個(gè)核苷酸。更優(yōu)選寡核苷酸的長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸。本發(fā)明的方法可以用于在C6700、B7032N或B9320上調(diào)(例如由于細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化所致)的細(xì)胞中改變基因表達(dá)。在靶細(xì)胞中，siRNA與C6700、B7032N或B9320轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞的C6700、B7032N或B9320產(chǎn)生減少。寡核苷酸的長(zhǎng)度為至少約IO個(gè)核苷酸，可以與天然存在的C6700、B7032N或B9320轉(zhuǎn)錄物等長(zhǎng)。在本發(fā)明中，siRNA的耙序列可以選自C67^F2的核苦酸序列。該核苷酸序列的大部分是C6700的兩個(gè)變體即VI和V2之間共有的。因此，有效抑制一個(gè)變體的siRNA也可能抑制另一個(gè)變體。這樣，抑制C67WW和C67M兩者的siRNA可以用于癌癥的治療或預(yù)防?；蛘?，C67^F2特異性的siRNA也可以用于癌癥的治療或預(yù)防。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制C6700表達(dá)的C6700的siRNA寡核苷酸的例子包括包含靶序列的寡核苦酸，所述靶序列例如可能抑制CV57MW和C67M兩者的SEQIDNO:43、47或81的核苷酸。在本發(fā)明中，siRNA的靶序列可選自B7032N的核普酸序列。例如，含有SEQIDNO:106的核苷酸作為與B7032N的靶序列的siRNA寡核苷酸。在本發(fā)明中，siRNA的靶序列可以選自B9320V2的核苷酸序列。該核普酸序列的大部分是B9320VI和V2兩個(gè)變體之間共有的。因此，有效抑制一種變體的siRNA可能也抑制另一種變體。這樣，抑制B9320VI和B9320V2兩者的siRNA可以用于癌癥的治療或預(yù)防。或者，B9320V2特異性的siRNA也可以用于癌癥的治療或預(yù)防。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中抑制B9320表達(dá)的B9320的siRNA寡核苷酸的例子包括含有靶序列的寡核芬酸，其中所述靶序列例如可抑制B9320V2的SEQIDNO:110的核芬酸。具有在靶細(xì)胞中抑制基因表達(dá)的能力的雙鏈RNA的設(shè)計(jì)方法是公知的。參見例如美國(guó)專利第6506559號(hào)，其全文并入本說明書作為參考。例^口，可/人Ambion網(wǎng)3占(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA-finder.html)獲得siRNA設(shè)計(jì)計(jì)算機(jī)程序。該計(jì)算機(jī)程序基于如下規(guī)程選擇核苦酸序列用于siRNA合成。選擇siRNA靶位點(diǎn)1.從目標(biāo)轉(zhuǎn)錄物的AUG起始密碼子開始向下游掃描，尋找AA二核苷靶位點(diǎn)。Tuschl等在(1999)Ge"^Dev13(24):3191-7中，不推薦針對(duì)5'和3'非翻譯區(qū)(UTRs)和鄰近起始密碼子的區(qū)域(75個(gè)堿基之內(nèi))設(shè)計(jì)siRNA,因?yàn)樯鲜鰠^(qū)域可能較為富含調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)。UTR結(jié)合蛋白和/或翻譯起始復(fù)合物可干擾與siRNA內(nèi)切核酸酶復(fù)合物的結(jié)合。2.將所述潛在靶位點(diǎn)與合適的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(人、小鼠、大鼠等)進(jìn)行比較，將與其它編碼序列顯著同源的任何靶序列排除在考慮之外。建議采用BLAST(AltschulSF，"a/"(1997)NucleicAcidsRes.;25:3389-402;(1990)JMolBiol.;215:403-10.)，其可見于NCBI月艮務(wù)器www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。3.選擇合格的靶序列用于合成。典型地，沿待評(píng)價(jià)的基因的長(zhǎng)度選擇數(shù)個(gè)靶序列。本發(fā)明還包括包含靶序列之核酸序列的分離核酸分子，例如SEQIDNO:43、47、81、106或110的核苷酸，以及與SEQIDNO:43、47、81、106或110的核苷酸的核酸序列互補(bǔ)的核酸分子。在本說明書中，術(shù)語(yǔ)"分離的核酸"是被從其固有環(huán)境(例如，若其為天然存在，其天然環(huán)境)中取出的，因而是從其天然狀態(tài)被以人工的(synthetically)方式改變的核酸分子。在本發(fā)明中，分離的核酸的例子包括DNA、RNA及它們的衍生物。當(dāng)分離的核酸為RNA或其衍生物時(shí)，應(yīng)在核苷酸序列中將堿基"t"替換為"u"。本說明書中，術(shù)語(yǔ)"互補(bǔ)的"指核酸分子的核苷酸單位之間形成Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對(duì)，而術(shù)語(yǔ)"結(jié)合"指兩種核酸或化合物、或者相關(guān)核酸或化合物、或者其組合之間的物理或化學(xué)相互作用。互補(bǔ)的核酸序列在適宜條件下雜交，形成基本不含或不含錯(cuò)配的穩(wěn)定雙鏈體。用于本發(fā)明的目的時(shí)，兩個(gè)序列的錯(cuò)配不超過5個(gè)即認(rèn)為互補(bǔ)。在本發(fā)明的上下文中，本發(fā)明的分離的核苷酸的有義鏈和反義鏈可以通過雜交形成雙鏈核苦酸或發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，這樣的雙鏈體的平均每io個(gè)配對(duì)中出現(xiàn)的錯(cuò)配不超過1個(gè)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙鏈體的鏈完全互補(bǔ)，這樣的雙鏈不含4晉配。核酸分子少于4725或4494個(gè)核苷酸(對(duì)于C6700)，或少于3503個(gè)核苷酸(對(duì)于B7032N),或少于2539或3427個(gè)核苷酸(對(duì)于B9320)。例如，核酸分子的長(zhǎng)度小于約500、約200、約75個(gè)核苦酸。本發(fā)明還包括含有一種或多種本說明書中描述的核酸的栽體，以及含有該載體的細(xì)胞。對(duì)于針對(duì)C6700、B7032N或B9320的siRNA或者編碼這些siRNA的DNA而言，本發(fā)明的分離的核酸是有用的。將這些核酸用于siRNA或編碼該siRNA的DNA時(shí)，有義鏈優(yōu)選長(zhǎng)于約19個(gè)核苷酸，更優(yōu)選長(zhǎng)于約21個(gè)核苷酸。本發(fā)明部分基于下述發(fā)現(xiàn)與非癌性腎細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)錄變體C67O0F2在腎細(xì)胞癌(RCC)中過高表達(dá)。C6700有兩種不同的轉(zhuǎn)錄變體。C6700V1或V2的cDNA長(zhǎng)分別為4725或4494個(gè)核香酸。C6700V1或V2的核酸和多肽序列分別示于SEQIDNO:63和64，或SEQIDNO:65和66。序列數(shù)據(jù)還可以通過以下登錄號(hào)獲得。C6700V1:AY358124C6700V2:BC077726轉(zhuǎn)染SEQIDNO:43、47或81的siRNA導(dǎo)致RCC細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制。C6700定位于染色體3p21.1,其指稱為Sema域、7個(gè)血小板凝血酶敏感蛋白重復(fù)(型1和型1樣)，跨膜域(TM)和短細(xì)胞質(zhì)域(腦信號(hào)蛋白5B)(designedSemadomain,seventhrombospondinrepeats(type1andtype1like),transmembranedomain(TM)andshortcytoplamicdomain(Semaphorin5B))，SEMA5B。腦信號(hào)蛋白家族成員，例如SEMA5B,與神經(jīng)發(fā)育過程中的軸突導(dǎo)向(axonalguidance)相關(guān)(Adams,&a/"(1996)Mec/z.Dev.57:33-45.)。RT-PCR和Northern印跡分析表明與腎近端小管上皮細(xì)胞相比，C6700在8個(gè)RCC細(xì)胞系(ACHN、769-P、RXF畫631L、TUHR10TKB、Caki畫l、Caki國(guó)2、786-0和A-498)的3個(gè)(A704、OS-RC-2和TUHR14TKB)中上調(diào)(圖2b和3,右圖面)。C6700具有由23個(gè)外顯子構(gòu)成的兩個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄變體，分別對(duì)應(yīng)于C6700V1和C6700V2(圖8a)。在本說明書中，發(fā)現(xiàn)了V2變體在RCC細(xì)胞中特異性地過高表達(dá)(圖8b)。本發(fā)明部分基于下述發(fā)現(xiàn)與非癌性腎細(xì)胞相比，B7032N在腎細(xì)胞癌(RCC)中過高表達(dá)。B7032N長(zhǎng)3503個(gè)核香酸。B7032N的核酸和多肽序列示于SEQIDNO:112和113。序列數(shù)據(jù)還可以通過以下登錄號(hào)獲得。麗—004567轉(zhuǎn)染SEQIDNO:106的siRNA引起RCC細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制。B7032N指稱為(designed)PFKFB4(6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6二磷酸酶4;6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-biphosphatase4)基因,半定量RT-PCR顯示其在臨床RCC病例(圖2a)和RCC細(xì)胞系(數(shù)據(jù)未給出)中上調(diào)，但其表達(dá)在受檢的正常生命器官中均不可檢出。隨后進(jìn)行的Northern印跡分析確認(rèn)約3.5kb的B7032N轉(zhuǎn)錄物在11個(gè)膀胱癌細(xì)胞系的2個(gè)中上調(diào)，但在除睪丸和胰臟之外的正常器官中均不表達(dá)(圖6)。本發(fā)明部分基于下述發(fā)現(xiàn)與非癌性腎細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)錄變體S9320F2在腎細(xì)胞癌(RCC)中過高表達(dá)。B9320有兩種不同的轉(zhuǎn)錄變體。B9320V1或V2的cDNA長(zhǎng)分別為2539或3427個(gè)核苷酸。B9320V1或V2的核酸和多肽序列分別示于SEQIDN0:115和116，或SEQIDNO:118和119。序列凄t據(jù)可以通過以下登錄號(hào)獲得。B9320V1:BC034014B9320V2:畫一l53350轉(zhuǎn)染SEQIDNO:110的siRNA引起RCC細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制。B9320指稱為(designed)FBXL16(F盒和富亮氨酸重復(fù)序列蛋白16)基因，半定量RT-PCR顯示其在RCC臨床病例(圖2a)和RCC細(xì)胞系(數(shù)據(jù)未給出)中上調(diào)，但其表達(dá)在受檢的任何正常生命器官中均不可檢出。隨后進(jìn)行的Northern印跡分析確認(rèn)兩種B9320轉(zhuǎn)錄物——大體上是B9320V1(2.4kb)和B9320V2(4kb),在4個(gè)膀胱癌細(xì)胞系的2個(gè)中顯著上調(diào)。B9320V1轉(zhuǎn)錄物在腎和曱狀腺中表達(dá)，而B9320V2轉(zhuǎn)錄物在除腦、睪丸、脊髓和胰臟之外的正常器官中均不表達(dá)(圖7)。siRNA組合物的結(jié)構(gòu)本發(fā)明涉及通過抑制C6700、B7032N或B9320的表達(dá)來抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，即癌細(xì)胞生長(zhǎng)。例如，通過特異性靶向C6700、B7032N或B9320基因的小干擾RNA(siRNA)可以抑制C6700、B7032N或B9320的表達(dá)。C6700、B7032N或B9320的耙標(biāo)包括例如SEQIDNO:43、47、81、106或110的核苷酸。在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，已證明雙鏈RNA(dsRNA)對(duì)基因表達(dá)發(fā)揮強(qiáng)力且特異性的沉默效應(yīng)，這稱為RNA干擾(RNAi)(SharpPA.(1999)GenesDev.;13:139-41.)。dsRNA被含RNA酶III基序的酶加工成20-23個(gè)核苦酸的dsRNA,稱作小干擾RNA(siRNA)。通過多組分核酸酶復(fù)合物，所述siRNA特異性以互補(bǔ)的mRNA為耙標(biāo)(HammondSM,da/.,(2000)Nature.;404:293-6;HannonGJ.(2002)Nature.;418:244-51.)。已經(jīng)證明，由20或21聚體dsRNA構(gòu)成，具有19個(gè)互補(bǔ)核苷酸以及3，末端的非互補(bǔ)胸苷或尿苷二聚體的siRNA，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有基因特異性的敲低效應(yīng)，而并不誘導(dǎo)基因表達(dá)的整體性變化(ElbashirSM，da/.，(2001)Nature.;411:494-8.)。而且，含有小核RNA(snRNA)U6或聚合酶IHH1-RNA啟動(dòng)子的質(zhì)粒，可有效地產(chǎn)生這樣的小RNA募集性III型類RNA聚合酶III(typeIIIclassofRNApolymeraseIII)，因此能夠組成性地抑制其耙mRNA(MiyagishiMandTairaK.(2002)NatBiotechnol.;20:497-500.;BmmmelkampTR，"a/.,(2002)Science.296:550-3.)。在本發(fā)明的上下文中，可以通過使細(xì)胞與包含C6700、B7032N或B9320的siRNA的組合物接觸來抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。進(jìn)一步將細(xì)胞與轉(zhuǎn)染劑接觸。適合的轉(zhuǎn)染劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制指與未暴露于組合物的細(xì)胞相比，所述細(xì)胞的增殖速度更慢或存活力下降。細(xì)胞生長(zhǎng)采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法測(cè)定，例如MTT細(xì)胞增殖測(cè)定。C6700、B7032N或B9320的siRNA可以針對(duì)C6700、B7032N或B9320基因序列的單個(gè)靶標(biāo)?；蛘?，siRNA可以針對(duì)C6700、B7032N或B9320基因序列的多個(gè)華巴標(biāo)。例如，組合物可以包含針對(duì)C6700、B7032N或B9320的2、3、4、5或更多個(gè)輩巴標(biāo)序列的C6700、B7032N或B9320的siRNA。C6700、B7032N或B9320的靶標(biāo)序列是指與C6700、B7032N或B9320基因的一部分相同的核苷酸序列。靶標(biāo)序列可以包含人C6700、B7032N或B9320基因的5'非翻譯(UT)區(qū)、開放閱讀框(ORF)或3'非翻譯區(qū)。或者，siRNA是與C6700、B7032N或B9320基因表達(dá)的上游或下游調(diào)節(jié)物(modulator)互補(bǔ)的核酸序列。上游或下游調(diào)節(jié)物的例子包括與C6700、B7032N或B9320基因啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子、與C6700、B7032N或B9320多肽相互作用的激酶或^5粦酸酶、C6700、B7032N或B9320啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。C6700、B7032N或B9320的siRNA與靶mRNA雜交，并通過與通常為單鏈mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，來干擾蛋白翻譯，這樣通過干擾蛋白的表達(dá)來減少或抑制由C6700、B7032N或B9320基因編碼的C6700、B7032N或B9320多肽的產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的siRNA分子可以根據(jù)其在嚴(yán)緊條件下與來自C6700、B7032N或B9320基因的mRNA或cDNA特異性雜交的能力來定義。就本發(fā)明而言，術(shù)語(yǔ)"雜交"或"特異性雜交"均是指2個(gè)核酸分子在"嚴(yán)緊的雜交條件"下雜交的能力。短語(yǔ)"嚴(yán)緊的雜交條件，，指如下條件，在該條件下核酸分子，通常在核酸的復(fù)雜混合物中，與其靶序列雜交，但不與其它序列發(fā)生可檢測(cè)程度的雜交。嚴(yán)緊條件依賴于序列，并且在不同環(huán)境中是不同的。較長(zhǎng)序列在較高溫度下特異性雜交。關(guān)于核酸雜交的全面指南見于Tijssen,(1993)Jfec/w/《Mes15/oc/zem&f/jA/b/ecw/ar/^Z"Vfe油.owvv她jVwc/e/c尸尸o6es，"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"。一般地,選捧的嚴(yán)緊條件為比在限定的離子強(qiáng)度、pH下指定序列的熱解鏈溫度(Tm)低約5-10°C。子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)的溫度(當(dāng)耙序列過量時(shí)，Tm溫度下，有50%的探針在平衡狀態(tài)下被占用)。此外，通過添加去穩(wěn)定劑，如曱酰胺也可以達(dá)到嚴(yán)緊條件。對(duì)選擇性或特異性的雜交而言，陽(yáng)性信號(hào)為至少2倍于背景，優(yōu)選為10倍于背景雜交。示例性的嚴(yán)緊雜交條件可為如下在50%曱酰胺、5xSSC、1%SDS中于42。C保溫，或者在5xSSC、1%SDS中于650C保溫，然后用0.2xSSC、0.1%SDS于50°C進(jìn)行洗滌。在本發(fā)明的上下文中，siRNA的長(zhǎng)度優(yōu)選為少于約500、約200、約100、約50或約25個(gè)核香酸。優(yōu)選地，siRNA的長(zhǎng)度為約19-約25個(gè)核香酸。用于制備C6700、B7032N或B9320siRNA的核酸序列的例子分別包括作為靶標(biāo)的SEQIDNO:43、47、81、106或110的核苷酸的序列。而且，為了增強(qiáng)siRNA的抑制活性，可以將核苷酸"u"添加到靶序列的反義鏈的3，端。待添加的"u，，的數(shù)目為至少約2，通常為約2-約10，優(yōu)選為約2-約5。添加的"u"在siRNA的反義鏈的3'端形成單鏈。細(xì)胞是表達(dá)或過高表達(dá)作為C6700V2的轉(zhuǎn)錄變體的C6700基因、B7032N或B9320的任意細(xì)胞。細(xì)胞是腎細(xì)胞等上皮細(xì)胞?；蛘撸?xì)胞是肺瘤細(xì)胞，例如癌、腺癌、母細(xì)胞瘤、白血病、骨髓瘤或肉瘤。細(xì)胞是腎細(xì)胞癌。C6700、B7032N或B9320的siRNA，可以以能與mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合的形式直接導(dǎo)入細(xì)胞?；蛘撸幋aC6700、B7032N或B9320的siRNA的DNA可以包含在載體中。例如，通過將C6700、B7032N或B9320耙序列以兩條鏈均能表達(dá)的形式(通過DNA分子的轉(zhuǎn)錄)克隆到表達(dá)載體中來制備上述載體，所述表達(dá)載體具有位于C6700、B7032N或B9320靶序列側(cè)翼的、可才喿作連接的調(diào)控序歹'J(Lee,N.S.，"a/"(2002)NatureBiotechnology20:500國(guó)5.)。與C6700、B7032N或B9320mRNA反義的RNA分子由第一啟動(dòng)子(例如位于所克隆的DNA3'側(cè)的啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄，而C6700、B7032N或B9320mRNA的有義鏈RNA分子由第二啟動(dòng)子(例如位于所克隆的DNA5'側(cè)的啟動(dòng)子序列)轉(zhuǎn)錄。所述有義鏈和反義鏈在體內(nèi)雜交，產(chǎn)生用于沉默C6700、B7032N或B9320的siRNA構(gòu)建體?；蛘?，可以利用兩個(gè)構(gòu)建體制備siRNA構(gòu)建體的有義鏈和反義鏈?？寺〉腃6700、B7032N或B9320可編碼具有二級(jí)結(jié)構(gòu)(例如發(fā)夾)的構(gòu)建體，其中，單一轉(zhuǎn)錄物兼具來自靶基因的有義序列和互補(bǔ)的反義序列。為了形成發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)，可在有義序列和反義序列之間放置由任意核苷酸序列組成的環(huán)序列(lo叩sequence)。因此，本發(fā)明還提供具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，的siRNA,其中，[A]為核糖核苷酸序列，其對(duì)應(yīng)于與來自C6700、B7032N或B9320的mRNA或cDNA特異性雜交的序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，[A]為與選自SEQIDNO:43、47、81、106或110的核苷酸的序列對(duì)應(yīng)的核糖核香酸序列，[B]為由約3~約23個(gè)核苷酸組成的核糖核苷酸序列，[A，]是由[A]的互補(bǔ)序列組成的核糖核苷酸序列。區(qū)域[A]和[A，]雜交，然后形成由區(qū)域[B]構(gòu)成的環(huán)。所述環(huán)序列的長(zhǎng)度優(yōu)選為約3-23個(gè)核苷酸。所述環(huán)序列，例如可以選自由如下序列組成的組(http:〃www.ambion.com/techlib/tb/tb—506.html)。此夕卜，由23個(gè)核苷酸組成的環(huán)序列也才是供活性siRNA(Jacque，JM.,&a/.，(2002)Nature418:435-8.)。CCC,CCACC或CCACACC:Jacque，JM.,"a/,,(2002)Nature418:435-8.UUCG:Lee，NS.,da/"(2002)NatureBiotechnology20:500-5.Fruscoloni:P.,da/.,(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:1639-44.UUCAAGAGA:Dykxhoom，D.M.,aa/,，(2003)NatureReviewsMolecularCellBiology4:457-67。例如，具有本發(fā)明的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的優(yōu)選siRNA如下所示。在以下結(jié)構(gòu)中，環(huán)序列可以選自CCC，UUCG，CCACC，CCACACC和UUCAAGAGA。優(yōu)選的環(huán)結(jié)構(gòu)是UUCAAGAGA(DNA中為"ttcaagaga")。CTACCTCTTCAGACTCAGC-[B]-GCTGAGTCTGAAGAGGTAG(對(duì)于SEQIDNO:43耙序列)CCATGTGAGCACTTGGATG-[B]-CATCCAAGTGCTCACATGG(對(duì)于SEQIDNO:47靶序列)GCAGCAACGTTGCAGCACA-[B]-TGTGCTGCAACGTTGCTGC(對(duì)于SEQIDNO:81靶序列)GAGGACAATCCAGACGGCT-[B]-AGCCGTCTGGATTGTCCTC(對(duì)于SEQIDNO:106耙序列)GGAGCTCTACAACGTGCTG-[B]-CAGCACGTTGTAGAGCTCC(對(duì)于SEQIDNO:IIO耙序列)C6700、B7032N或B9320序列側(cè)翼的調(diào)節(jié)序列可以相同也可以不同，但應(yīng)能夠獨(dú)立地、或者以時(shí)間性或空間性方式調(diào)控這些基因表達(dá)。通過將C6700、B7032N或B9320基因的模板分別克隆到載體上，siRNA得以在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，其中所述載體含有例如來自小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄單元或人H1RNA啟動(dòng)子。為了將載體導(dǎo)入細(xì)胞，可以使用轉(zhuǎn)染土曾強(qiáng)劑(transfection國(guó)enhancingagent)。FuGENE(Rochediagnostices),Lipofectamine2000(Invitrogen),Oligofectamine(Invitrogen)和Nucleofactor(WakopureChemical)可以用作轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，在體外檢測(cè)C6700、B7032N或B9320mRNA的多個(gè)部分的寡核苷酸或者與這些部分互補(bǔ)的寡核苷酸降低腫瘤細(xì)胞中(例如，使用腎細(xì)胞癌(RCC)細(xì)胞系等腎細(xì)胞系)C6700、B罰32N或B9320產(chǎn)生的能力。與不存在候選組合物時(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞相比，與所述候選siRNA組合物接觸的細(xì)胞中C6700、B7032N或B9320轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)物的減少，可以使用C6700、B7032N或B9320特異性抗體或采用其它^r測(cè)策略^r測(cè)到。對(duì)于在體外的基于細(xì)胞的測(cè)定或無細(xì)胞測(cè)定中減少C6700、B7032N或B9320產(chǎn)生的序列，進(jìn)一步測(cè)定其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。對(duì)于在體外的基于細(xì)胞的測(cè)定或無細(xì)胞測(cè)定中抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的序列，在大鼠或小鼠中進(jìn)行體內(nèi)測(cè)定，以確認(rèn)C6700、B7032N或B9320產(chǎn)生的減少和患有惡性肺瘤的動(dòng)物中腫瘤細(xì)月包生長(zhǎng)的減少。惡性腫瘤的治療方法通過施用C6700、B7032N或B9320的siRNA，可以治療具有C6700、B7032N或B9320的過高表達(dá)為特征的腫瘤的患者。例如，siRNA療法可以用于抑制患有或有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生腎細(xì)胞癌(RCC)患者中C6700、B7032N或B9320的表達(dá)。采用針對(duì)特定腫瘤類型的標(biāo)準(zhǔn)方法可以鑒定這樣的患者。采用例如計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(CT)、磁共振成像(MRI)、內(nèi)鏡逆行胰膽管造影術(shù)(ERCP)、磁共振胰膽管造影術(shù)(MRCP)或超聲波法，可以診斷腎細(xì)胞癌(RCC)。當(dāng)治療帶來受試者體內(nèi)上調(diào)基因表達(dá)減少或腫瘤的大小、患病率(prevalence)或轉(zhuǎn)移潛力降低等臨床效益時(shí)，其是有效的。當(dāng)預(yù)防性施用所述的治療時(shí)，"有效的"指治療延遲或防止腫瘤的形成，或者延遲、防止或減輕腫瘤的臨床癥狀?？梢耘c任何已知的診斷或治療特定腫瘤類型的方法相結(jié)合來確定有效性。siRNA治療可以4安下述方式進(jìn)行通過編碼本發(fā)明的siRNA的標(biāo)準(zhǔn)載體，和/或通過基因送遞系統(tǒng)例如合成siRNA分子的送遞，將siRNA施用于患者。典型地，將合成性siRNA分子化學(xué)穩(wěn)定化，以防止其在體內(nèi)被核酸酶降解。化學(xué)穩(wěn)定化RNA分子的制備方法是本
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的。典型地，這樣的RNA分子包含經(jīng)修飾的骨架和核苷酸，以防止核糖核酸酶作用。而其它的修飾也是可能的，例如膽固醇偶聯(lián)的siRNA顯示改善的藥理學(xué)性質(zhì)(Songetal.(2003)NatureMed.9:347-51)。特別是這其中,適宜的基因送遞系統(tǒng)包括脂質(zhì)體、受體介導(dǎo)的送遞系統(tǒng)或皰滲病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒等病毒載體。治療用核酸組合物可以配制在藥學(xué)可接受的載體中。治療組合物還可以包含諸如上述的基因送遞系統(tǒng)。藥學(xué)可接受的載體是適于給動(dòng)物施用的生物適應(yīng)性溶媒，例如生理鹽水?；衔锏闹委熡行Я渴强梢栽谥委煹膭?dòng)物中取得理想的醫(yī)療結(jié)果的量，例如減少C6700、B7032N或B9320基因產(chǎn)物的產(chǎn)生、減少例如增殖等細(xì)胞生長(zhǎng)或減少腫瘤生長(zhǎng)。非消化道給藥例如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)和腹腔內(nèi)送遞途徑，可以用于送遞C6700、B7032N或B9320的siRNA組合物。對(duì)于腎細(xì)胞癌的治療，腎動(dòng)脈直接注射是特別優(yōu)選的。對(duì)于任一患者的劑量依賴于多種因素，包括患者的身材(size)、體表面積、年齡、施用的具體核酸、性別、給藥時(shí)間及給藥途徑、一般健康情況以及同時(shí)施用的其它藥物。核酸的靜脈內(nèi)施用劑量為約106~1022個(gè)拷貝的核酸分子。本發(fā)明的多核苷酸可以采用標(biāo)準(zhǔn)方法施用，例如，注射到肌肉或皮膚等組織的間質(zhì)空間中、導(dǎo)入循環(huán)系統(tǒng)或體腔、或者通過吸入或吹入。多核苦酸通常通過注射，或者除此之外可以與水性或部分水性的藥學(xué)可接受的液體載體一起送遞至動(dòng)物。多核苷酸可以與脂質(zhì)體(例如陽(yáng)離子或陰離子脂質(zhì)體)組合。本發(fā)明的多核苷酸包含在靶細(xì)胞中表達(dá)所必需的基因信息，例如啟動(dòng)子。本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA,抑制本發(fā)明的多肽的表達(dá)，因而可抑制一個(gè)或數(shù)個(gè)本發(fā)明的多肽的生物活性。此外，包含本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的表達(dá)抑制劑可以抑制本發(fā)明的多肽的生物活性，因而是有用的。因此，包含本發(fā)明的反義寡核苷酸或siRNA的組合物可以用于治療腎細(xì)胞癌。或者，通過施用與基因產(chǎn)物結(jié)合或以其它方式抑制基因產(chǎn)物功能的化合物，可以抑制在RCC中過高表達(dá)的基因的一種或多種基因產(chǎn)物的功能。例如，所述化合物可以是與一種或多種過高表達(dá)的基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。本發(fā)明涉及抗體特別是針對(duì)由上調(diào)標(biāo)志基因所編碼的蛋白的抗體、或所述抗體的片段的用途。如本說明書中使用的，術(shù)語(yǔ)"抗體"指具有特異性結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子，其僅與用于合成該抗體的抗原(即上調(diào)標(biāo)志基因的基因產(chǎn)物)或與其緊密相關(guān)的抗原相互作用(即結(jié)合)。此外，抗體可以是抗體片段或修飾的抗體，只要其結(jié)合一種或多種標(biāo)志基因編碼的蛋白。例如，所述抗體片段可以是Fab、F(ab，)2、Fv或?qū)碜訦4連和L鏈的Fv片l爻通過合適的接頭連接而成的單鏈Fv(scFv)(Huston"a/"(1988)ProcNatlAcadSciUSA85:5879-83)。更具體地，可以用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體以產(chǎn)生抗體片段?；蛘撸€可以構(gòu)建編碼該抗體片段的基因，將其插入合適的表達(dá)載體，并在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)(參見例如CoMS.etal.:(1994)J.Immunol.152:2968-76;BetterM.andHorwitzAH.(1989)MethodsEnzymol.178:476-96;PluckthunA.andSkerraA.(1989)MethodsEnzymol.178:497-515;LamoyiE.(1986)MethodsEnzymol.121:652-63;RousseauxJ.etal.,(1986)MethodsEnzymol.121:663-9;BirdRE.andWalkerBW.(1991)TrendsBiotechnol.9:132-7.)?？贵w可以通過與各種分子如聚乙二醇(PEG)偶聯(lián)進(jìn)行修飾。本發(fā)明提供這樣的修飾抗體?？赏ㄟ^將抗體進(jìn)行化學(xué)修飾來獲得修飾抗體。這些修飾方法是本領(lǐng)域常規(guī)的?？贵w的恒定區(qū)的嵌合抗體，或者作為含有源自非人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、源自人抗體的框架區(qū)(FR)及恒定區(qū)的人源化抗體。所述抗體可利用已知技術(shù)制備。指向癌細(xì)胞中發(fā)生的特異性分子變化的癌癥療法已經(jīng)通過下述抗癌藥的臨床開發(fā)和管理機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)被認(rèn)定為有效用于治療晚期乳腺癌的曲妥單抗(trastuzumab)(Herceptin),用于治療慢性骨髓性白血病的曱磺酸伊馬替尼(imatinibmethylate)(Gleevec),用于治療非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的gefitinib(Iressa)和用于B細(xì)胞淋巴瘤和套細(xì)胞(mantlecell)淋巴瘤的rituximab(抗CD20mAb)(CiardielloFandTortoraG.(2001)ClinCancerRes.;7(10):2958-70.Review.;SlamonDJ,Wa/"(2001)NEnglJMed,;344(11):783-92.;RehwaldU，(2003)Blood,;101(2):420畫4.;FangG，(2000).Blood,96,2246-53.)。這些藥物臨床上是有效的，并且比傳統(tǒng)抗癌劑具有更好的耐受性，因?yàn)樗鼈儍H僅靶向轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。因此，這些藥物不僅改善了癌癥患者的存活率和生活質(zhì)量，而且證明了分子靶向癌癥療法理念的合理性。另外，當(dāng)靶向藥物與標(biāo)準(zhǔn)化療組合使用時(shí)，可以增強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)化療的凌丈力(GianniL.(2002).Oncology,63Suppl1，47-56.;KlejmanA，a(2002).Oncogene,21，5868-76.)。因此，未來的癌癥治療將很可能涉及將常規(guī)藥物與針對(duì)腫瘤細(xì)胞不同特性如血管生成(angiogenesis)和浸潤(rùn)性(invasiveness)的輩巴物特異性試劑組合。這些調(diào)節(jié)方法可以離體(e:cvzVo)、體外(例如通過在藥物的存在下培養(yǎng)細(xì)胞)或體內(nèi)(例如通過給受試者施用藥物)進(jìn)行。所述方法包括作為對(duì)抗(counteract)差異表達(dá)基因的異常表達(dá)或其基因產(chǎn)物的異常活性的療法，施用蛋白或蛋白的組合、或者核酸分子或核酸分子的組合?？梢杂棉卓?即降低或抑制)一種或多種過高表達(dá)基因的活性的治療劑來治療疾病和病癥，所述疾病和病癥的特征在于基因和基因產(chǎn)物的表達(dá)水平或生物活性(相對(duì)于未患有疾病或病癥的受試者)分別有所增加?？梢灾委熜曰蝾A(yù)防性地施用拮抗活性的治療劑。因此，可以用于本發(fā)明上下文中的治療劑包括例如(i)RCC相關(guān)基因的多肽或其類似物、衍生物、片段或同源物；(ii)抗過高表達(dá)基因或基因產(chǎn)物的抗體；(iii)編碼過高表達(dá)或過低表達(dá)的一種或多種基因的核酸；(iv)反義核酸或"功能障礙(dysfunctional)"的核酸(即，由于在一種或多種過高表達(dá)基因的核酸內(nèi)的異源插入所致)；(v)小干擾RNA(siRNA);或(vi)調(diào)節(jié)劑(即，改變過高表達(dá)或過低表達(dá)多肽與其結(jié)合配對(duì)物(bindingpartner)之間的相互作用的抑制劑、激動(dòng)劑和拮抗劑)。將功能障礙的反義分子用于通過同源重組來"敲除"多肽的內(nèi)源性功能(參見例如Capecchi,(1989)Science244:1288-92)。以水平或生物活性下降(相對(duì)于未患有疾病或病癥的受試者)為特征的疾病和病癥，可以使用提高活性(即，對(duì)其活性的激動(dòng)劑)的治療劑進(jìn)行治療?？梢砸灾委熁蝾A(yù)防的方式施用上調(diào)活性的治療劑?？梢岳玫闹委焺┌ǖ幌抻诙嚯?或其類似物、衍生物、片段或同源物)或提高生物利用度(bioavailability)的;敫動(dòng)劑。通過獲取患者組織樣品(例如從活檢組織)，并在體外測(cè)定其RNA或肽水平、表達(dá)的肽(或表達(dá)有所改變的基因的mRNA)的結(jié)構(gòu)和/或活性，來定量肽和/或RNA,>火而可以容易地;險(xiǎn)測(cè)出水平的上升或下降。本領(lǐng)域^^知的方法包括^f旦不限于免疫測(cè)定法(例如在Western印跡分析、免疫沉淀后進(jìn)行十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫細(xì)胞化學(xué)等)和/或檢測(cè)mRNA表達(dá)的雜交分析(例如Northern分析、點(diǎn)印跡、原位雜交等)。預(yù)防性給藥在出現(xiàn)疾病的明顯臨床癥狀之前進(jìn)4亍，以阻止疾病或病癥的出現(xiàn)或者延遲其進(jìn)程。本發(fā)明的療法可以包括使細(xì)胞與調(diào)節(jié)劑接觸的步驟，所述調(diào)節(jié)劑可調(diào)節(jié)一種或多種差異表達(dá)基因的基因產(chǎn)物的活性。蛋白活性調(diào)節(jié)劑的例子包括但不限于核酸、蛋白、這些蛋白的天然存在的關(guān)連配體(naturally-occurringcognateligands)、肽、肽才莫擬物及其它小分子。例如，合適的藥物可以刺激一種或多種差異性過低表達(dá)基因的一種或多種蛋白的活性。本發(fā)明還涉及治療或預(yù)防受試者中腎細(xì)胞癌的方法，該方法包括如下步驟對(duì)所述受試者施用疫苗，其中所述疫苗包含由選自RCC1-25l(即RCC上調(diào)基因)的核酸編碼的多肽、所述多肽的免疫學(xué)活性片段或者編碼所述多肽或其片段的多核苷酸。施用所述多肽在受試者中誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。為了誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，給有需要的受試者施用由選自RCC1-251的核酸編碼的多肽，所述多肽的免疫學(xué)活性片段或者編碼所述多肽或其片段的多核苷酸。多肽或其免疫學(xué)活性片段可以用作針對(duì)RCC的疫苗。在一些情況下，蛋白或其片段可以以結(jié)合于T細(xì)胞受體(TCR)或由抗原呈遞細(xì)胞(APC),如巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞(DC)或B細(xì)胞呈遞的形式進(jìn)行施用。由于DC具有強(qiáng)抗原呈遞能力，所以在APC中使用DC是最優(yōu)選的。在本發(fā)明中，針對(duì)RCC的疫苗是指具有如下能力的物質(zhì)將其接種于動(dòng)物時(shí)誘導(dǎo)抗腫瘤免疫。根據(jù)本發(fā)明，由RCC1-251編碼的多肽或其片段被認(rèn)為是HLA-A24或HLA-A*0201限制性表位肽，其可誘導(dǎo)針對(duì)表達(dá)RCC1-251的RCC細(xì)胞的強(qiáng)力且特異的免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明還包括使用多肽誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的方法。一般而言，抗肺瘤免疫包括諸如以下的免疫應(yīng)答-誘導(dǎo)抗腫瘤的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，-誘導(dǎo)識(shí)別腫瘤的抗體，和-誘導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此，當(dāng)某蛋白接種動(dòng)物后誘導(dǎo)任一種所述免疫反應(yīng)時(shí)，確定該蛋白具有抗腫瘤免疫誘導(dǎo)效果。由蛋白誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫可以通過在體內(nèi)或體外觀察宿主中的免疫系統(tǒng)針對(duì)該蛋白的應(yīng)答而進(jìn)行檢測(cè)。例如，檢測(cè)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)的方法是公知的。具體地，進(jìn)胞。以抗原特異性方式應(yīng)答于APC所呈遞之抗原的T細(xì)胞由于該抗原的刺激而分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞(或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞；CTL),然后增殖(這稱為T細(xì)胞活化)。因此，一些肽的CTL誘導(dǎo)可以通過將該肽經(jīng)由APC呈遞于T細(xì)胞和檢測(cè)CTL的誘導(dǎo)來進(jìn)行評(píng)估。此外，APC具有激活CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞，巨喧細(xì)胞，嗜酸粒細(xì)胞(eosinophil)和NK細(xì)胞的功效。由于CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中也是重要的，可使用這些細(xì)胞的激活效應(yīng)作為指標(biāo)來評(píng)價(jià)肽的抗腫瘤免疫誘導(dǎo)作用。使用樹突細(xì)胞(DC)作為APC評(píng)價(jià)CTL誘導(dǎo)作用的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的。在APC中，DC是具有最強(qiáng)CTL誘導(dǎo)作用的代表性APC。在該方法中，首先使受試多肽與DC接觸，然后使該DC與T細(xì)胞接觸。在與DC接觸后，如果檢測(cè)出具有針對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用的T細(xì)胞，則表示該受試多肽具有誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。CTL的抗腫瘤活性可以例如采用"Cr標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞的裂解(lysis)作為指標(biāo)來進(jìn)行檢測(cè)?；蛘撸捎肧H-胸苦攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶)釋放作為指標(biāo)來評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞損傷程度的方法也是眾所周知的。除DC外，外周血單核細(xì)胞(PBMC)也可用作APC。已4艮道通過在存在GM-CSF和IL-4的情況下培養(yǎng)PBMC來增強(qiáng)CTL的誘導(dǎo)。相似地，已顯示通過在存在鑰孔威血藍(lán)素(KLH)和IL-7的條件下培養(yǎng)PBMC可誘導(dǎo)CTL?？梢哉J(rèn)為通過這些方法確定為具有CTL誘導(dǎo)活性的受試多肽，是具有DC激活效應(yīng)和隨后的CTL誘導(dǎo)活性的多肽。因此，誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤細(xì)胞的CTL的多肽可用作抗腫瘤的疫苗。此外，通過與所述多肽接觸而獲得誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤的CTL的能力的APC也可用作抗腫瘤的疫苗。此外，通過APC呈遞多肽抗原而獲得細(xì)胞毒性的CTL也可用作抗腫瘤的疫苗。利用由APC和CTL產(chǎn)生的抗腫瘤免疫的這些腫瘤治療方法稱為細(xì)胞免疫療法。一般來說，當(dāng)使用多肽用于細(xì)胞免疫療法時(shí)，已知通過組合多種具有不同結(jié)構(gòu)的多肽并使其與DC接觸可增加CTL誘導(dǎo)的效率。因此，當(dāng)用蛋白片段刺激DC時(shí)，使用多種類型的片段的混合物是有利的?；蛘?，多肽對(duì)抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)可以通過觀察針對(duì)腫瘤的抗體產(chǎn)生的誘導(dǎo)來進(jìn)行確認(rèn)。例如，當(dāng)用多肽免疫的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中誘導(dǎo)產(chǎn)生抗該多肽的抗體，這些抗體抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，所述多肽視為具有誘導(dǎo)抗腫瘤免疫的能力。施用本發(fā)明的疫苗誘導(dǎo)抗腫瘤免疫，而該抗腫瘤免疫的誘導(dǎo)為治療和預(yù)防RCC提供可能?？拱┲委熁?qū)Π┌Y發(fā)病的預(yù)防可以包括任何下述步驟癌性細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制，癌癥的退縮(involution)以及癌癥發(fā)生的抑制。癌癥的治療或預(yù)防還包括患有癌癥的個(gè)體死亡率和發(fā)病率降低、血液中腫瘤標(biāo)志物水平減少、癌癥伴發(fā)的可檢測(cè)癥狀的緩解等。所述治療性和預(yù)防性效果優(yōu)選是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。例如，在觀察中顯著性水平為5%或更低，在所述對(duì)照進(jìn)行比較。例如，可將Student'st-檢驗(yàn)，Mann-WhitneyU-檢驗(yàn)或ANOVA用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。上述具有免疫活性的蛋白或編碼該蛋白的載體可與佐劑組合。佐劑是指當(dāng)與具有免疫活性的蛋白共同(或相繼)施用時(shí)增強(qiáng)針對(duì)該蛋白的免疫應(yīng)答的化合物。佐劑的例子包括但不限于霍亂毒素(choleratoxin)、沙門氏菌毒素(salmonellatoxin)、明鞏(alum)等。此外，本發(fā)明的疫苗可適宜地與藥學(xué)可接受的載體組合。這樣的載體的例子包括但不限于無菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養(yǎng)液等。此外，疫苗可根據(jù)需要包含穩(wěn)定劑，懸浮劑，防腐劑，表面活性劑等。疫苗可全身或局部地進(jìn)行施用。疫苗施用可以包括單次給藥，或者包括多次強(qiáng)化給藥(boosteradministrations)。當(dāng)使用APC或CTL作為本發(fā)明的疫苗時(shí)，可以例如通過離體方法治療或預(yù)防腫瘤。更具體地，收集接受治療或預(yù)防的受試者的PBMC，使細(xì)胞與多肽在離體條件下接觸，誘導(dǎo)APC或CTL,然后將該細(xì)胞施用于受試者。也可通過將編碼多肽的載體在離體條件下導(dǎo)入PBMC中來誘導(dǎo)APC。體外誘導(dǎo)的APC或CTL可以在施用前進(jìn)行克隆。通過克隆和培養(yǎng)具有高靶細(xì)胞破壞活性的細(xì)胞，可以更有效地實(shí)施細(xì)胞免疫治療。此外，以該方式分離的APC和CTL不僅可以用于針對(duì)提供細(xì)胞的受試者進(jìn)行細(xì)胞免疫治療，還可以用于針對(duì)來自其它個(gè)體的相似類型的腫瘤進(jìn)行細(xì)胞免疫治療。進(jìn)一步，提供含有藥學(xué)有效量的本發(fā)明的多肽的藥物組合物，其用于治療或預(yù)防包括癌癥在內(nèi)的細(xì)胞增殖性疾病。該藥物組合物可以用于激發(fā)抗腫瘤免疫。用于抑制RCC或惡性RCC的藥物組合物本發(fā)明中，適宜的藥物制劑包括適于口服、直腸、鼻、局部(包括口腔或舌下)、陰道或非消化道(包括肌肉內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi))施用的制劑，以及適于通過吸入或吹入(insufflation)施用的制劑。優(yōu)選靜脈內(nèi)施用。制劑可以任選包裝在離散的劑量單位(dosageunit)中。適于口服施用的藥物制劑包括膠嚢劑、扁嚢劑(cachet)或片劑，它們各含有一定量的活性成分。適合的制劑還包括粉末、顆粒，溶液，懸浮液或乳液?；钚猿煞挚梢匀芜x以大丸藥糖劑(boluselectuaiy)或糊劑(paste)的形式施用。用于口服給藥的片劑和膠嚢劑可含有常規(guī)賦形劑諸如結(jié)合劑、填充劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑或濕潤(rùn)劑。片劑可通過壓縮或成型來制備，其中任選含有一種或多種配方成分。壓縮片劑可通過如下方法制備將活性成分以自由流動(dòng)的形式(如粉末或顆粒)任選地與結(jié)合劑、潤(rùn)滑劑、惰性稀釋劑、潤(rùn)滑劑、表面活性劑和/或分散劑混合，并在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器中進(jìn)行壓縮。成型片劑可通過如下方法制備在適當(dāng)?shù)臋C(jī)器中對(duì)利用惰性液體稀釋劑濕潤(rùn)的粉末化合物的混合物進(jìn)行成型。所述片劑可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行包覆(coated)。口服液體制備物可以是例如水性或油性的懸濁液、溶液、乳液、糖漿或酏劑的形式，或者也可以作為干燥產(chǎn)物提供，在使用前用水或其它適宜媒介物構(gòu)成。所述液體制備物可含有常規(guī)添加劑諸如懸浮劑，乳化劑，非水性溶媒(可包括食用油)和/或防腐劑。片劑可任選地配制以提供其中活性成分的緩釋或控釋。片劑的包裝中可以包含每月服用的一片藥物。適于非消化道施用的制劑包括水性和非水性的無菌注射溶液，其中任選地含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑(bacteriostat)和使得制劑與目標(biāo)受體的血液等張的(isotonic)溶質(zhì)；以及水性和非水性的無菌懸浮液，其中含有懸浮劑和/或增稠劑。所述制劑可以以單位劑量或多次劑量容器提供，例如密封的安瓿和小瓶；還可以在冷凍-干燥(凍干的)條件下保存，這樣僅需要恰在使用前添加無菌液體載體例如鹽水、注射用水。此外，可提供所述制劑用于連續(xù)輸注(continuousinfusion)。即配即用的注射溶液和懸浮液可由前述的無菌粉末、顆粒及片劑的類型制備。適于直腸給藥的制劑包括栓劑(suppository),其中包含標(biāo)準(zhǔn)載體如可可脂或聚乙二醇。適于口內(nèi)局部給藥，例如含服或舌下給藥的制劑包括錠劑(lozenge)和軟錠劑(pastille),其中錠劑在調(diào)味基質(zhì)，如蔗糖和阿拉伯膠(acacia)或黃蓍膠(tragacanth)中包含活性成分，而軟錠劑在基質(zhì)，如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中包含活性成分。鼻內(nèi)給藥時(shí)，本發(fā)明的化合物可以用作液體噴霧劑、可分散粉末，或以滴鼻劑(drop)的形式。滴鼻劑可用水性或非水性基質(zhì)配制，該基質(zhì)中任選含有一種或多種分散劑、增溶劑和/或懸浮劑。吸入給藥時(shí)，可以由吹入器、霧化器、加壓包裝(pressurizedpack)或其它輸送氣溶膠噴霧的便利裝置方便地輸送本發(fā)明的化合物。加壓包裝可含有適宜的噴射劑，如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適宜氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可通過提供輸送計(jì)量量(meteredamount)的閥門來確定劑量單位。或者，通過吸入或吹入給藥時(shí)，化合物可以是干粉組合物的形式，例如該化合物與適宜粉末基質(zhì)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末組合物可以以單位劑型提供，這些劑型例如膠嚢、藥筒(cartridge)、凝膠(gdatin)或發(fā)泡包(blisterpack),借助吸入器或吹入器，可由上述劑型施用所述粉末。其它的制劑包含可釋放治療劑的可植入裝置及粘性貼片(adhesivepatches)o需要時(shí)，可以采用適于緩釋活性成分的上述制劑。藥物組合物中還可以含有其它活性成分，諸如抗微生物劑，免疫抑制劑和/或防腐劑。應(yīng)當(dāng)理解除上述具體提及的成分外，本發(fā)明的制劑可含有本
技術(shù)領(lǐng)域：
對(duì)于所述制劑類型常規(guī)的其它試劑，例如適于口服給藥的制劑可以含有調(diào)味劑。優(yōu)選的單位劑型制劑中含有如下述有效量或其適宜部分的活性成分。對(duì)于前述的各種情況，可以以約0.1-約250mg/kg每天的劑量范圍口服或通過注射施用所述組合物，例如多肽和有機(jī)化合物。成人的劑量范圍通常為約5mg-約17.5g/天，優(yōu)選為約5mg-約10g/天，最優(yōu)選為約100mg-約3g/天。片劑或其它以分散單元提供的單位劑型可適宜地含有以這樣的劑量或者作為多個(gè)這樣的劑量有效的量，例如含有約5mg-約500mg，通常為約100mg-約500mg。所用劑量將依賴于多種因素，包括受試者的年齡和性別，治療的確切疾患及其嚴(yán)重程度。此外，給藥途徑也可依賴于病癥及其嚴(yán)重程度而變化。然而無論怎樣，本領(lǐng)域技術(shù)人員都能在考慮上述因素的基礎(chǔ)上常規(guī)地計(jì)算出合適的最佳劑量。下面的實(shí)施例中進(jìn)一步描述了本發(fā)明的方面，這些實(shí)施例并不意圖限制權(quán)利要求書中記載的本發(fā)明的范圍。下面的實(shí)施例將對(duì)在RCC細(xì)胞中差異表達(dá)的基因的鑒定及表征進(jìn)行說明。使用通過激光顯微解剖選擇純化的透明細(xì)胞RCC細(xì)胞和正常腎皮質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行腎細(xì)胞癌基因表達(dá)模式的全基因組cDNA微陣列分析使用展示27648個(gè)基因的cDNA微陣列分析基因表達(dá)模式，鑒定了用于介入性治療的腫瘤標(biāo)志和靶標(biāo)。腎細(xì)胞癌是作為包含多種細(xì)胞組分的實(shí)體塊存在。因此，采用激光微束顯微解剖(LMM)從15例腎細(xì)胞癌中純化癌細(xì)胞?？疾炱浠虮磉_(dá)模式，與正常的純化腎皮質(zhì)細(xì)胞的模式進(jìn)行了比較。這些細(xì)胞群體由此被均一化(高于95%純化的細(xì)胞)。結(jié)果，鑒定出251個(gè)基因在腎細(xì)胞癌細(xì)胞中普遍上調(diào)。在這些上調(diào)基因中，包括已經(jīng)報(bào)道的在RCC中過高表達(dá)的細(xì)胞周期蛋白-Dl(CCA/)(HedbergY.，""/.,(1999)Int.J.Cancer,84:268-72,1999.)。該基因在本發(fā)明的15例信息RCC病例的9例中過高表達(dá)。鑒定出721個(gè)基因在腎細(xì)胞癌細(xì)胞中普遍下調(diào)。本發(fā)明克服了先前方法的諸多限制。因此，本發(fā)明的基因表達(dá)模式構(gòu)成了十分準(zhǔn)確的癌參照。首先，由于多種細(xì)胞成分不僅存在于正常組織中也存在于癌組織中，使用臨床樣品的微陣列分析先前已被證明難度很大。特別是，腎細(xì)胞癌具有以包含多種細(xì)胞成分的實(shí)體塊的形式存在的特點(diǎn)。因此，使用腎細(xì)胞癌總體和正常腎皮質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)模式分析會(huì)受到受檢組織中的混合細(xì)胞的比例的顯著影響，這些比例可能會(huì)掩蓋腎細(xì)胞癌相關(guān)基因的顯著增加或減少。因此，在本發(fā)明中，使用LMM系統(tǒng)從外科標(biāo)本中純化了很高純度(95。/。以上)的癌細(xì)胞和正常上皮細(xì)胞。由于采用LMM甚至可以完成單個(gè)細(xì)胞水平的顯微解剖，該技術(shù)對(duì)于腎細(xì)胞癌標(biāo)本的準(zhǔn)確微陣列分析而言是重要的。仔細(xì)地純化癌細(xì)胞和正常腎皮質(zhì)細(xì)胞，然后分離RNA，進(jìn)行cDNA孩么陣列分析，結(jié)果鑒定了251個(gè)表達(dá)普遍上調(diào)的基因(在超過50%的癌癥病例中可獲表達(dá)數(shù)據(jù)且表達(dá)比(Cy5/Cy3強(qiáng)度比)大于5.0的基因；對(duì)于在33-50%的病例中可計(jì)算，且在可計(jì)算的全部病例中表達(dá)比大于5.0的基因也加以i平估。本說明書中獲得并描述的模式與早期的模式相比有所改進(jìn)，這是因?yàn)樗鼈兪峭ㄟ^對(duì)高度純化的癌性細(xì)胞(腎細(xì)胞癌)的群體進(jìn)行分析，并與最相關(guān)的正常對(duì)照，即腎皮質(zhì)細(xì)胞的高純度群體相比較而獲得的。先前的方法和模式受到很高比例的混雜細(xì)胞的影響，這些細(xì)胞會(huì)降低先前模式的準(zhǔn)確度和可信度。本發(fā)明的模式是第一個(gè)大規(guī)模腎細(xì)胞癌精確全基因組基因表達(dá)模式。這些數(shù)據(jù)鑒定了用于腎細(xì)胞癌治療相關(guān)治療性調(diào)節(jié)的分子靶標(biāo)和用于癌癥或癌前狀態(tài)的早期準(zhǔn)確診斷的特異性新腫瘤標(biāo)志。除非另有說明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中的普通技術(shù)人員所常規(guī)理解的意思相同。盡管在實(shí)施或檢驗(yàn)本發(fā)明時(shí)可使用與本文所述類似或等同的方法和材料，但適當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧先绫菊f明書下面的描述。本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利和其它參考文獻(xiàn)都全文并入本文作為參考。在存在沖突的情況下，以包括定義的本說明書為準(zhǔn)。另外，本文描述的材料、方法和實(shí)施例僅是為了說明而非限制本發(fā)明。實(shí)施例材料與方法在下述的實(shí)施例中將會(huì)進(jìn)一步地描述本發(fā)明，該實(shí)施例不限制權(quán)利要求書中本發(fā)明的范圍。評(píng)價(jià)得自疾病組織的組織和正常組織來鑒定差異表達(dá)的基因或者疾病狀態(tài)例如RCC。按照下述方法進(jìn)行測(cè)定患者，組織才羊品及細(xì)月包系從知情同意的15個(gè)患者(其中男性9例，女性6例；透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌包括10例pTl、2例pT2以及3例pT3;患者的年齡范圍為36歲至75歲，平均年齡61.3歲)獲得了腎細(xì)胞癌，所有的患者對(duì)此都給予了知情同意(表l)。從醫(yī)療記錄中獲得了臨床信息，并且由病理學(xué)工作者按照組織病理學(xué)亞型分級(jí)對(duì)每一個(gè)腫瘤進(jìn)行了診斷。按照日本泌尿?qū)W會(huì)腎細(xì)胞癌臨床病理研究通用規(guī)則判斷了每個(gè)患者的臨床階段。所有的樣品馬上冷凍并保存在-80。C。將從腎細(xì)胞癌(Caki-1，Caki-2，786-0，A498,ACHN,769-P,A704，RXF-631L，OS-RC-2，TUHR10TKB以及TUHR14TKB)細(xì)胞獲得的細(xì)胞系及腎近端小管上皮細(xì)胞(RPTEC)用添加10%胎牛血清，1%抗生素/抗真菌劑溶液的合適培養(yǎng)基單層培養(yǎng)，并維持在37。C含5%C02的空氣中。表1RCC患者的臨床病理特征<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>組織樣品及LMM將樣品包埋于TissueTekOCT介質(zhì)(Sakura)中，然后保存在-80。C直至使用。將冷凍的樣品用恒冷切片機(jī)(cryostat)連續(xù)地切成8jxm的薄片并用蘇木精和伊紅對(duì)其進(jìn)行染色來確定分析區(qū)域。為了防止癌細(xì)胞和非癌性細(xì)胞的交叉污染，利用EZCutLMMSystem(SLMicrotestGmbH)制備了這兩個(gè)群體，制備按照經(jīng)過一些改良的廠商規(guī)程進(jìn)行。為了最大程度地減小組織采集和組織保存過程中的影響，癌癥樣品是使用同樣的程序小心處理的。為了檢驗(yàn)RNA的品質(zhì)，對(duì)從每個(gè)剩余組織中提取的總RNA進(jìn)行了變性(degenerative)瓊脂糖凝膠電泳，核糖體RNA條帶的存在確證了它們的品質(zhì)。RNA提取及基于T7的RNA擴(kuò)增從激光捕獲的每一細(xì)胞群體中將總RNA提取到350|il的RLT裂解緩沖液(QIAGEN)中。在室溫下用30單位的DNA酶I(QIAGEN)處理提取的RNA30分鐘。在70。C處理10分鐘失活后，利用RNeasyMiniKit(QIAGEN)按照廠商的建議純化RNA。利用AmpliscribeT7TranscriptionKit(EpicentreTechnologies)對(duì)所有DNA酶I處理過的RNA進(jìn)行了基于T7的擴(kuò)增。對(duì)于每一個(gè)樣品，兩輪擴(kuò)增產(chǎn)生了41.5-163.4嗎的擴(kuò)增RNA(aRNA)，而當(dāng)發(fā)明人對(duì)從來自11個(gè)腎癌患者的正常腎皮質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)增RNA時(shí)，共得到了477.0iug。取分別來自癌性細(xì)胞和正常腎皮質(zhì)細(xì)胞的2.5ng等份試樣，將它們存在Cy5-dCTP和Cy3-dCTP(AmershamBiosciences)的條件下分別在進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄。cDNA孩t陣列為了獲得用于在載玻片上點(diǎn)樣的cDNA，發(fā)明人按照前述方法(Kitahara0，etal.,(2001)CancerRes;61:3544-9)對(duì)每個(gè)基因進(jìn)行了RT-PCR。用高密度MicroarraySpotterLucidea(GEHealthcare,AmershamBiosciences)將PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣在VII型載玻片上(GEHealthcare,AmershamBiosciences,BuckinghamshireUK);將9,216個(gè)基因一式二份地點(diǎn)樣在單一載玻片上。共制備了三組不同的載玻片(共27,648個(gè)基因點(diǎn))；每組中還包括相同的52個(gè)持家基因以及兩個(gè)陰性對(duì)照。按照前述方法(OkabeH,etal.，(2001)CancerRes;61:2129-37)從aRNA制備了cDNA探針。在雜交實(shí)驗(yàn)中，取7.5來自每個(gè)癌性組織或來自對(duì)照的擴(kuò)增RNA(aRNA),分別在存在Cy5-dCTP和Cy3-dCTP(GEHealthcare,AmershamBiosciences)的條件下對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按照前人所述的方法(OkabeH，etal.,(2001)CancerRes;61:2129-37)進(jìn)行了雜交，洗滌以及信號(hào)的檢測(cè)。雜交及數(shù)據(jù)獲取實(shí)施之外，雜交和洗滌均按照前述方法進(jìn)行(OnoK.，etal.，(2000)CancerRes，60:5007-11)。利用ArrayVision4欠4牛(ImagingResearch,Inc,，St.Catharines,Ontario,Canada)通過背景置換的方法來自27,648個(gè)點(diǎn)的Cy3和Cy5信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行了定量和分析。隨后，對(duì)每個(gè)目標(biāo)點(diǎn)的Cy5(腫瘤)和Cy3(對(duì)照)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行了調(diào)整，使陣列上的52個(gè)持家基因的平均Cy3/Cy5比等于1。由于從低信號(hào)強(qiáng)度獲得的數(shù)據(jù)的可信度較低，發(fā)明人按照前述方法在每個(gè)載玻片上確定了截留(cut-off)值(Ono,K.，etal.,(2000)CancerRes，60:5007-11.),并且將Cy3和Cy5染料所產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度均低于截留值的基因排除于進(jìn)一步分析之外(Saito曙Hisaminato,A.,etal.，(2002)DNARes，9:35-45.)。對(duì)于其它基因，發(fā)明人利用每個(gè)樣品的原始數(shù)據(jù)計(jì)算了Cy5/Cy3的比例。RCC中普遍上調(diào)或下調(diào)的基因的鑒定每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)比(Cy5/Cy3強(qiáng)度比)被歸入四類之一(A)上調(diào)(表達(dá)比>5.0);(B)下調(diào)(表達(dá)比<0.2);(C)無變化(表達(dá)比在0.2和5.0之間)；(D)無表達(dá)(或者有少量的表達(dá)但是低于檢測(cè)截留水平)。使用這些分類，檢測(cè)出了在樣品中表達(dá)比普遍有變化的一組基因。為了檢測(cè)在每一組中普遍顯著上調(diào)或下調(diào)的候選基因，首先對(duì)27,648個(gè)基因的總體表達(dá)圖式進(jìn)行了篩選，選擇表達(dá)比>5.0或者<0.2的基因，并且這些基因存在于>50%的已分類的組中。半定量RT-PCR挑選出了19個(gè)上調(diào)基因，并且通過半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)考察了其表達(dá)水平。利用隨機(jī)引物和SuperscriptII(LifeTechnologies,Inc.)將得自每個(gè)樣品中的l-ugaRNA等份試樣反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA。稀釋每個(gè)cDNA混合物，用于使用表2所示的引物進(jìn)行后續(xù)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。為了將每個(gè)基因的表達(dá)量歸一化，從52個(gè)持家基因中選擇了法尼基二磷酸法尼基轉(zhuǎn)移酶1(FZ)F77)作為內(nèi)部對(duì)照，因?yàn)楝F(xiàn)有微陣列數(shù)據(jù)顯示該基因的Cy5/Cy3波動(dòng)最小。對(duì)PCR反應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，確保了產(chǎn)物強(qiáng)度處于擴(kuò)增反應(yīng)的線性階段。表2.用于半定量RT-PCR的引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>D9765AA4425905'-ATGATGGCCATTTTGATGCT-3'735'-GCTCTCCACGTTGGTAGGTC-3'74A3412麗—0005525'-CACCAATGGCTCTGTTGTGT-3'755'-TAAGAGCTCAGCCTTTATTGTGG-3'76C4971BC0002345'-GCTACTACATGATTGGTGAGCAG-3'775'-CTTTAATTGAGGTCACAGGCATC-3'78B7032N畫—0045675'-CTTCCAGACTCATCTGTCAGAGC-3'1175'-GCAACTCCTAACTCCCCTCTGTA陽(yáng)3'87B9320BC0002345'扁CAGAGAGCCAGAGAGTGAGAGAG-3'885'-GCATATACAGGAGAATGAGGTCG-3'89FDFT1畫—0044625'-AGTGAAATGCAGGTGAGAAGAAC-3'295'-TCATTCTAGCCAGGATCATACTAAG-3'30因?yàn)镃6700具有2個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄物，所以使用以下引物進(jìn)行半定量RT-PCR來確認(rèn)哪一個(gè)變體在RCC細(xì)胞內(nèi)過高表達(dá)C6700FV15'-GTCCCCACTGCTTTGAGATG-3'(SEQIDNO:37)，C6700RV15'畫GTGTGTGTTCCTGAACAGATGAA-3，(SEQIDNO:12);C6700FV25'畫GACTGTGCAGGGTTCAATCTC-3，(SEQIDNO:38),C6700RV25，-GTGTGTGTTCCTGAACAGATGAA-3，(SEQIDNO:12);用作內(nèi)部對(duì)照的(32-微球蛋白O^MG)5'-TTAGCTGTGCTCGCGCTACT-3，(SEQIDNO:39)，5'陽(yáng)TCACATGGTTCACACGGCAG-3，(SEQIDNO:40)。為了考察RCC細(xì)胞(786-0,A704,OS-RC-2和TUHR14TKB)中C6700V1和C6700V2的表達(dá)水平，使用以下引物組進(jìn)行了RT-PCR實(shí)驗(yàn)5'-CTGGAAACAGCAGCCAGAG畫3，(SEQIDNO:83)和5，-CAGTGCTGGCAAGACAGGTA-3，(SEQIDNO:84)。對(duì)PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，以確保產(chǎn)物強(qiáng)度處于擴(kuò)增的對(duì)數(shù)階段內(nèi)。使用以下引物組通過RT-PCR進(jìn)一步確認(rèn)B9320變體的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平變體1:5'-GGAGTGGGAACCGCAGAAC-3'(SEQIDNO:卯)，和5'-GACCCCCACCTTCAAATCAC-3'(SEQIDNO:91)，變體2:5'-GCTCGTGCTCGACAGGTGTGTA-3'(SEQIDNO:92)和5'-CAGGTCATGGCCGGGTTC-3'(SEQIDNO:93)。對(duì)PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，以確保產(chǎn)物強(qiáng)度處于擴(kuò)增的對(duì)數(shù)階段內(nèi)。Northern印跡分析在1%變性瓊脂糖凝膠上分離下述樣品的1ng等份試樣并轉(zhuǎn)移到尼龍膜上使用Micro-FastTrack(Invitrogen)從4個(gè)腎細(xì)胞癌細(xì)胞系及RPTEC細(xì)胞分離的各種mRNA，以及人正常組織polyA(+)RNA(Clontech,PaloAlto，California),心、肝、肺、腎、腦和睪丸。再使該Northern印跡和人多組織Northern印跡(Clontech，PaloAlto,CA)與通過RT-PCR獲得的候選基因的[a"P]-dCTP標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。預(yù)雜交、雜交和清洗按供應(yīng)商的建議進(jìn)行。將印跡用增感屏在-8(TC放射自顯影14天。特異性探針是使用表3所示的特異性引物組通過PCR制備的。表3.用于Northern探針的引物的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>表達(dá)載體的構(gòu)建用KOD-PlusDNA聚合酶(Toyobo,Osaka,Japan)通過PCR獲得了B7032N和B9320的可讀框序列，其中使用了下述引物B7032N-正向，5'-AACGAATTCATGGCGTCCCCACGGGA-3'(SEQIDNO:97)(下劃線表示EcoRI限制酶位點(diǎn))和5'-CAACTCGAGCTGGTGAGCAGGCACCGTG-3'(SEQIDNO:98)(下劃線表示Xhol限制酶位點(diǎn))，和B9320-正向，5'-CAAGAATTCATGTCGAGCCCGGGCATC-3'(SEQIDNO，99)和5'-GCTGAATTCACCTCAATGACGAGGCAGCGG-3'(SEQIDNO,100)(下劃線表示EcoRI限制酶位點(diǎn))。將B7032N的PCR產(chǎn)物插入pCAGGSsnH3F表達(dá)載體的EcoRI和Xhol位點(diǎn)中。將B9320的PCR產(chǎn)物插入pCAGGSsnH3F表達(dá)載體的EcoRI位點(diǎn)中。通過DNA測(cè)序確認(rèn)了這些構(gòu)建體的DNA序列。免疫細(xì)胞化學(xué)分析以5乂104個(gè)/孔接種了COS7細(xì)胞以進(jìn)行外源性表達(dá)。24小時(shí)和48小時(shí)后，使用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑(Roche)根據(jù)制造商說明書分別以lmgpCAGGS-HA-B7032N或pCAGGS-HA-B9320瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞。然后，用含有4%多聚曱醛的PBS(-)于4。C固定細(xì)胞15分鐘，并用含有0.1%TritonX-100的PBS4°C處理2.5分鐘以使其可滲透。隨后，于4°C將細(xì)胞用含3%BSA的PBS(-)覆蓋12小時(shí)以封閉非特異性雜交。接著，將B7032N-HA轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞和B9320-HA轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞與1:1000稀釋的大鼠抗HA抗體(SANTACRUZ)—起溫育。用PBS(-)清洗后，用l:3000稀釋的AlexaFluro488-偶聯(lián)抗大鼠第二抗體(MolecularProbe)對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行染色。用4'，6，-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸(4',6'"diamidine^'-phenylindolendihydrochrolide)(DAPI)對(duì)細(xì)胞核復(fù)染色。在TCSSP2AOBS(Leica,Tokyo,Japan)顯微鏡下獲得熒光圖像。Western印跡分析如前述用pCAGGS-nHA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，使其分別外源性表達(dá)B7032N蛋白和B9320蛋白。分別在轉(zhuǎn)染24小時(shí)和48小時(shí)后回收全細(xì)胞裂解物。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在裂解緩沖液(50mMTris(pH7.5)，150mmol/LNaCL,10mmol/LCHAPS和0.1%蛋白酶抑制劑合劑組III(Calbiochem))中裂解。勻漿后，將細(xì)胞裂解物在水上保溫30分鐘，14000rpm離心15分鐘，使僅上清與細(xì)胞碎片分離。用蛋白測(cè)定試劑盒(Bio-Rad，Hercules,CA)估計(jì)總蛋白量，然后將蛋白與SDS-上樣緩沖液混合，煮沸，然后加載到10%SDS-PAGE凝膠。電泳后，將蛋白印跡到硝酸纖維素膜(GEHealthcare)上。將含有蛋白的膜用封閉液封閉，然后與大鼠抗HA單克隆抗體(SANTACRUZ)—起溫育，以檢測(cè)外源B7032N蛋白或B9320蛋白。最后將膜與HRP偶聯(lián)的第二大鼠抗體溫育，并通過ECL檢測(cè)試劑(GEHealthcare)使蛋白條帶可^見化。建立穩(wěn)定表達(dá)PFKFB4的NIH3T3細(xì)胞如上所述，用FUGENE6將B7032N表達(dá)載體、B9320表達(dá)載體或模擬載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入NIH3T3細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在含有0.9mg/ml遺傳霉素(G418)(Invitrogen)的培養(yǎng)基中溫育。將克隆NIH3T3細(xì)胞通過有限稀釋進(jìn)行亞克隆。用抗HA單克隆抗體通過Western印跡分析對(duì)帶HA標(biāo)簽的B7032N或帶HA標(biāo)簽的B9320的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估。最后，建立了數(shù)個(gè)克隆，并命名為B7032N-NIH3T3或B9320-NIH3T3。為了研究B7032N或B9320的促生長(zhǎng)作用，我們將4種獨(dú)立的B7032N-NIH3T3細(xì)胞(B7032N-A,-B，-C和-D)和3種獨(dú)立的模擬-MH3T3細(xì)胞(模擬-A,-B,-C),或4種獨(dú)立的B9320-NIH3T3細(xì)胞(B9320-1,-2，-3)和3種獨(dú)立的模擬-MH3T3細(xì)胞(模擬-l，-2，3)，各自接種了5xl()3個(gè)細(xì)胞，并采用Cell-countingkit-8(DOJINDO,Kumamoto,Japan)按廠商的說明書每天進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，經(jīng)過5天。這些實(shí)驗(yàn)按一式三份進(jìn)行。用psiU6X3.0構(gòu)建C67Q0、B7032N和B9320特異性siRNA表達(dá)載體我們根據(jù)先前的報(bào)道(WO2004/076623;ShimokawaT,"a/.CancerRes.2003;63:6116-20.)用psiU6BXsiRNA表達(dá)載體(對(duì)C6700)和PsiHIBXsiRNA表達(dá)載體(對(duì)B7032N和B9320)建立了基于載體的RNAi系統(tǒng)。通過將表6中的雙鏈寡核普酸克隆到psiU6BX載體的位點(diǎn)中制備了針對(duì)C6700、B7032N和B9320的siRNA表達(dá)載體(psiU6BX-C6700，psiHlBX-B7032N或psiHlBX-B9320)。對(duì)照質(zhì)粒psiU6BX-模擬，Luc，亂序和EGFP，是通過將雙鏈寡核香酸克隆到psiU6BX3.0載體的B&I位點(diǎn)中制備的。C6700、B7032N和B9320的基因沉默效應(yīng)將RCC細(xì)胞系OS-RC-2(用于C6700)、RXF-631L和A498(用于B7032N)、以及Caki-2和A498(用于B9320)鋪板于10cm培養(yǎng)皿上(1X106細(xì)胞/皿)，按提供商的推薦使用FuGENE6試劑(Roche)、使用Lipofectamine2000(Invitrogen)轉(zhuǎn)染psiU6BX畫C6700、psiU6BX-B7032N和psiU6BX-B9320以及作為陰性對(duì)照的psiU6BX-模擬、Luc、亂序和EGFP。每種構(gòu)建體轉(zhuǎn)染后10天，從細(xì)胞提取總RNA,然后用針對(duì)上述C6700共有區(qū)域的特異性引物通過半定量RT-PCR確認(rèn)siRNA的敲低效應(yīng)。在含0.7mg/ml新霉素(遺傳霉素；GibcoBRL,Carlsbad,CA)的培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)染的OS-RC-2細(xì)胞。然后，在遺傳霉素選擇5天后，從細(xì)胞提取總RNA，再使用如下特異性引物組通過半定量RT-PCR測(cè)定siRNA的敲^氐效應(yīng)作為內(nèi)部對(duì)照正向，5，-AACTTAGAGGTGGGGAGCAG-3，(SEQIDNO:85)和反向，5，-CACAACCATGCCTTACTTTATC-3，(SEQIDNO:86);對(duì)于C6700:5'-TGACCTGTGCTTAGAAGTCCTTT-3'(SEQIDNO:ll)和5'-GTGTGTGTTCCTGAACAGATGAA-3'(SEQIDNO:12);對(duì)于B7032N:正向，5'-CGGTGGTCTCTCATCCTTGT-3，(SEQIDNO:101)和反向，5'-GCAACTCCTAACTCCCCTCTGTA-3，(SEQIDNO:87);對(duì)于B9320:正向，5，-GCCTCGAGGTTATGCTTGAA-3，(SEQIDNO，102)和反向，5，-ATGCAGTCACTCACGCTCAG畫3，(SEQIDNO，103)。在3-(4，5-二曱基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)測(cè)定中，在轉(zhuǎn)染7天和14天后使用Cell-countingkit-8(DOJINDO,Kumamoto,Japan)按照供應(yīng)商的規(guī)程評(píng)價(jià)細(xì)胞活力。溫育21天后，用4°/。多聚曱醛固定這些細(xì)胞，并用Giemsa溶液進(jìn)4亍染色，以進(jìn)行集落形成測(cè)定。結(jié)果RCC中普遍上調(diào)或下調(diào)基因的鑒定為了防止周圍非癌性細(xì)胞或非正常細(xì)胞的混雜，進(jìn)行了激光微束顯微解剖，以僅選擇腫瘤塊中的癌細(xì)胞和源自正常腎皮質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞。如圖1所示，RCC的代表例是從各臨床標(biāo)本中顯微解剖的。這樣，我們可以較為準(zhǔn)確地(preciously)獲得后面的基因表達(dá)模式。為了闡明RCC的癌發(fā)生基礎(chǔ)的機(jī)制，首先考察了RCC中普遍上調(diào)或下調(diào)的基因。通過15例RCC中的基因表達(dá)模式，鑒定了表達(dá)普遍變化的972個(gè)基因；有251個(gè)基因在超過50%的信息病例中顯示表達(dá)比大于5.0(參見材料與方法)(表4),而與正常腎皮質(zhì)細(xì)胞相比，有721個(gè)基因在RCC細(xì)胞中的表達(dá)降低至不足0.2(表5)。這些上調(diào)基因中包括已經(jīng)報(bào)道在RCC中過高表達(dá)的細(xì)胞周期蛋白-Dl(CCM)/)(HedbergY.,"a/"(1999)Int.J.Cancer,84:268-72.)。該基因在本發(fā)明中15例信息病例的9例中是過高表達(dá)的。這些上調(diào)基因中，有182個(gè)基因的生物學(xué)功能是某種程度已知的。它們中，HIG2(低氧誘導(dǎo)性基因2)，NNMT(煙酰胺N-曱基轉(zhuǎn)移酶)，IGFBP3(胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3)，VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)和VWF(VonWillebrand因子)已經(jīng)被報(bào)道為與腎腫瘤形成有關(guān)的基因(TogashiA，"d.，(2005)CancerRes.;65:4817-26;YaoM，d(2005)JPathol.;205:377誦87;CheungCW，"(2004)KidneyInt.;65:1272-9;StaehlerM，"a/"(2005)CurrDrugTargets.;6:835國(guó)46;BraybrookeJP，Wa/"(2000)ClinCancerRes.;6:4697-704.),這支持了我們的微陣列數(shù)據(jù)的高品質(zhì)。這些上調(diào)基因表現(xiàn)出各種功能，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因(ADORA3，EDA2R)，或者參與多種代謝途徑(SCD，ENPP3)、轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(SLC1A3，ABCG1)、血管生成(VEGF)、凋亡(FTS)和細(xì)胞粘著(CDH2)的基因。特別是，與正常皮質(zhì)細(xì)胞相比，這些上調(diào)基因中有92個(gè)表達(dá)水平高出超過10倍，例如ADORA3(腺苷A3受體)，SLC1A3(溶質(zhì)載體家族1,成員3)和STC2(硬骨魚鈣蛋白2)在超過90%的信息病例中上調(diào)超過10倍。這些下調(diào)基因中的532個(gè)已經(jīng)得到了一定程度的功能表征。這其中包括WT1(維爾姆斯瘤1),CDKN1C(細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1C)和GAS1(生長(zhǎng)停滯特異性l)，有人已經(jīng)暗示了它們?cè)谏L(zhǎng)抑制或細(xì)胞凋亡中的作用(NiuZ,&(2005)JUrol;174:1460-2;KikuchiT，^a/"(2002)Oncogene.;21:2741-9;WatanabeH，"a/"(1998)ProcNatlAcadSciUSA,;95:1392-7;EvdokiouA&CowledPA.(1998)IntJCancer.;75:568-77.)。特別是WTl(維爾姆斯瘤l)和CDKNIC在全部的15例RCC病例中顯著下調(diào)，GAS1也在15例的14例中顯著下調(diào)，表明這些基因的下調(diào)可能與RCC腫瘤的發(fā)生相關(guān)。表4RCC中的上調(diào)基因<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>表5RCC中的下調(diào)基因<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>536F2724AK024275FLJ14213假設(shè)蛋白FLJ14213537B4626BC052574FLJ20171假設(shè)蛋白FLJ20171538B4469AB081837FLJ20315假設(shè)蛋白FLJ20315539A8964AI091459FLJ204894艮i殳蛋白FLJ20489540D5189BX101094FLJ21128假設(shè)蛋白FLJ21128541F3313AK025164FLJ21511假設(shè)蛋白FLJ21511542B訓(xùn)6R34577FLJ21657<艮設(shè)蛋白FLJ21657543B5905T83961FLJ21986假設(shè)蛋白FLJ21986544B1851AA032154FLJ22655假設(shè)蛋白FLJ22655545A8061AA808804FLJ23469假設(shè)蛋白FLJ23469546B8353AY358845FLJ31166假設(shè)蛋白FLJ31166547B6208AA723586FLJ31951假設(shè)蛋白FLJ31951548D4414AA994364FLJ32421假i殳蛋白FLJ32421549B7458NBC068446FLJ34658假設(shè)蛋白FLJ34658550F6944AL137326FLJ37478假設(shè)蛋白FLJ37478551D5971AI912733FLJ40125假設(shè)蛋白FLJ40125552B4545AI359551FLJ90119假設(shè)蛋白FLJ90119553A1098AF000560LOCI26208假設(shè)蛋白LOC126208554C7585AK095271LOCI28977假設(shè)蛋白LOC128977555C4878BC040176LOC130576假設(shè)蛋白LOC130576556C9677AL832661LOC143381假設(shè)蛋白LOC143381557D5601AK056793LOC1456944Si殳蛋白LOC145694558B0277AA747835LOCI50568假設(shè)蛋白LOC150568559D9407CR749484LOC152519假設(shè)蛋白LOC152519560C8269BC060866LOC163782假設(shè)蛋白LOC163782561C1869BC046365LOC2530124Si殳蛋白LOC253012562A6532AY358336LOC255743假設(shè)蛋白LOC255743563B3517AK097190LOC285286假設(shè)蛋白LOC285286564C9503AA621124LOC338773假設(shè)蛋白LOC338773565C9551AL133596LOC339692假設(shè)蛋白LOC339692566D3168AA776749LOC57821假設(shè)蛋白LOC57821567D1155AY358100MGC11324假設(shè)蛋白MGC11324568B1230AA703185MGC24039假設(shè)蛋白MGC24039569D3691R49126MGC24039假設(shè)蛋白MGC24039570B3759AF067420MGC27165假設(shè)蛋白MGC27165571C1982AI076840MGC33926假設(shè)蛋白MGC33926572B0979BC030666MGC33993假設(shè)蛋白MGC33993573F0655AK026196MGC4172假設(shè)蛋白MGC4172574B0742BX648671MGC61571假設(shè)蛋白MGC61571575C0400BC021290MP-2IGF-IImRNA-結(jié)合蛋白2576A3044BC075840IGHG1免疫J求蛋白重鏈恒定區(qū)gamma1(Glm標(biāo)志)577B1676BC025985IGHG4免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)gamma4(G4m標(biāo)志)578A1032M87790IGLC1免疫球蛋白lambda恒定區(qū)1(Mcg標(biāo)志)579A2442AK074668ISLR含免疫球蛋白超家族的富亮氨酸重復(fù)序列580C7503N90724IGSF4免疫球蛋白超家族，成員4581A0560NNM一000618IGF1胰島素樣生長(zhǎng)因子1(促生長(zhǎng)因子C)582A0160NCR621807IGFBP1胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白1583A1034BC004312IGFBP2胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2,36kDa584A4474AF047433ITGB4BP整聯(lián)蛋白beta4結(jié)合蛋白585B3893AY549722ITLN1Intelectin1(呋喃型半乳糖結(jié)合性)586A3829NM—002182IURAP白細(xì)胞介素1受體輔助蛋白587A3037BC030975IL1RL1白細(xì)胞介素1受體樣1588B7877AA056734IQSEC3IQ才莫體和Sec7域3589A9295AY335938IRX1Iroquois同源才匡蛋白1590F8485AW452669IARS異亮氨酸-tRNA合成酶591A2888BI759204KUC1激肽釋放酶1，腎的/胰的/唾液的592A3135NX05332KLK3激肽釋放酶3,(前列腺特異性抗原)593A3-211M13143KLKB1激肽釋放酶B,血漿(Fletcher因子)1594A6092AF208070KLHL3Kelch樣3(果蠅)595B4062XI4640KRT13角蛋白13596C2083NM—002277KRTHA1角蛋白，毛發(fā)，酸性，1597D0488AA405685UHSKerB角蛋白，超高辟"，B598A9635BU621583KIAA0056KIAA0056蛋白599B6832BC002378KIAA0652KIAA0652基因產(chǎn)物600A5953N24235KIAA0789KIAA0789基因產(chǎn)物601C9575XM—032571KIAA0888KIAA0888蛋白602A8875R56087KIAA0984KIAA0984蛋白603B8035AL834240KIAA1576KIAA1576蛋白604C6986麗—020946KIAA1608KIAA1608605B1759AA629743KIAA1712KIAA1712606B8308NM一OO1001936KIAA1914KIAA1914607B4896AK124139KIAA1970KIAA1970蛋白608D6871AB062483K諸A驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員18A609D6309BU608866KIF5A驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員5A610C8249NM_000893KNG1激肽原1611A0005NNM—153683KLKlotho612B6617NM一153486LDHD乳酸脫氬酶D613A3061U07643LTF乳運(yùn)鐵蛋白614A0227NM—032737L廳B2核纖層蛋白B2615AO184NM一000426LAMA2層粘連蛋白，alpha2(分區(qū)蛋白，先天性肌萎縮癥)<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>835A6689BU741863SPOCKSparc/骨粘連蛋白，cwcv和kazal樣域蛋白聚糖(睪丸蛋白聚糖)836C8088D87465SPOCK2Sparc/骨粘連蛋白，cwcv和kazal樣域蛋白聚糖(睪丸蛋白聚糖)2837D6561AA994999SYNE2含血影蛋白重復(fù)序列，核被膜2838B2953BG182727SPDY1Speedy同源物1(果蠅)839A1630N雨—003117SPAM1精子粘附分子1(PH-20透明質(zhì)酸酶，透明帶結(jié)合)840D3872AK095036SPAG16精子相關(guān)的抗原16841A6卯9固—018667SMPD3鞘磷脂磷酸二酯酶3,中性膜(中性鞘磷脂酶II)842D3239AA112743SGPL1鞘氨醇-l-磷酸裂合酶1843F6820CR749297SKIPSPHK1(鞘氨醇激酶型l)相互作用性蛋白844B7559AB073386SGEF含Src同源3域的鳥噪呤核苷酸交換因子845D7386BC071780UNQ846SRSR846846A5462AF389338SCD4硬脂酰-CoA去飽和酶4847B7313AF059203SOAT2固醇0-?；D(zhuǎn)移酶2848B8432AF352729FLJ12541視黃酸基因6刺激的同源物(小鼠)849A0042AF029082SFNStratifin850D7518AA007591SENP5SUM01/sentrin特異性蛋白酶5851D3685AI911481SUV420H2花斑抑制物4-20同源物2(果蠅)852A6670AB018279SV2A突觸小泡糖蛋白2A853A4814畫—004209SYNGR3突觸循環(huán)蛋白3854B3942AA191573SYNJ2突觸小泡磷酸酶2855A56卯AB028952SYNPO突觸足蛋白856B8366AI342255SYNP02突觸足蛋白2857C6207AB188489SYNP02L突觸足蛋白2樣858D3671AA247642SNAP23突觸小體的相關(guān)蛋白，23kDa859D0385AK125106SYTL5突觸結(jié)合蛋白樣5860D3336AA524150SDC4祐結(jié)蛋白聚糖4(雙棲蛋白聚糖，抗凝蛋白聚糖)861A27隨雨—003182TAC1速激肽，前體1(物質(zhì)K，物質(zhì)P,神經(jīng)激肽1,神經(jīng)激肽2,神經(jīng)調(diào)節(jié)肽L，神經(jīng)激肽alpha,神經(jīng)肽K,神經(jīng)肽gamma)862A3465M74558SILTAL1(SCL)中斷座位863B3047AI361002TBC1D17TBC1域家族，成員17864A1332AF054910TEKT2筑絲蛋白2(睪丸的)865A1151NM55618TNC生腱蛋白C(六臂(hexabrachion))866B3377AA807166TSGA10睪丸特異性，10867A4895BC0072卯TSPAN-1四次跨膜1868A2869AF054839TSPAN-2四次跨膜2869D5273AA862436THEA硫酯酶，脂肪相關(guān)的870A4717BC050383TMPO胸腺生成素871A4595U96131TRIP13甲狀腺激素受體相互作用因子(interactor)13872B4649BM996064TJP3緊密連接蛋白3(緊密聯(lián)合(閉鎖小帶)3)873A1583NU91963TIX1Tolloid樣1874A0461NM一001068T0P2B拓樸異構(gòu)酶(DNA)IIbeta180kDa875B6507AI929792被轉(zhuǎn)錄的座位876C0437H04828被轉(zhuǎn)錄的座位877C7770AA165165;j皮轉(zhuǎn)錄的座l立878B9634BXU0180被轉(zhuǎn)錄的座位879A9694AA719352被轉(zhuǎn)錄的座位880D0852AA429665^皮轉(zhuǎn)錄的座4立881B9979CF595488被轉(zhuǎn)錄的座位882C6460W96022被轉(zhuǎn)錄的座位883B7326Z98489-波轉(zhuǎn)錄的座^立884B5115T50062被轉(zhuǎn)錄的座位885B1454AI820955被轉(zhuǎn)錄的座位886D5241AA938971:被轉(zhuǎn)錄的座位887A9673AA609323被轉(zhuǎn)錄的座位888C7747CA314541被轉(zhuǎn)錄的座位889D4261AA877216被轉(zhuǎn)錄的座位890D3102BX088780被轉(zhuǎn)錄的座位891D5026AI822035被轉(zhuǎn)錄的座位892D7115BX100620被轉(zhuǎn)錄的座位893D3291AA766649被轉(zhuǎn)錄的座位894D3672AA809349被轉(zhuǎn)錄的座位895D5414BX114748被轉(zhuǎn)錄的座位896B2956AA034053被轉(zhuǎn)錄的座位897C4551N64389被轉(zhuǎn)錄的座位898D4230BF513800被轉(zhuǎn)錄的座位899D3842AA830448被轉(zhuǎn)錄的座位900B3515AA74醒被轉(zhuǎn)錄的座位901B2297AW197616被轉(zhuǎn)錄的座位902B9513H簡(jiǎn)6被轉(zhuǎn)錄的座位903B1956AA663781被轉(zhuǎn)錄的座位904B2436AI220328被轉(zhuǎn)錄的座位卯5D3092BX088758被轉(zhuǎn)錄的座位906D5402BX1079444皮轉(zhuǎn)錄的座4立卯7A7973BU738725被轉(zhuǎn)錄的座位<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>通過半定量RT-PCR和RNA印跡分析驗(yàn)證選定的基因?yàn)榱舜_證通過cDNA微陣列分析所獲得的數(shù)據(jù)的可靠性，對(duì)患有透明細(xì)胞RCC的信息病例中有明顯上調(diào)的21個(gè)基因(登錄號(hào)NM—018092，AA632745,畫—007250,W86513,BC077726,AA156409,W57613,CR749811AW972553,AL832896,AK021778,AK026403,AK025204,畫—000677,AF070609,AI290343,AA442590,NM—000552，BC000234,BC034014以及NM—004567)進(jìn)行了半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)。在這些基因中，通過與作為正常對(duì)照的腎近端小管上皮細(xì)胞(RPTEC)比較，確認(rèn)了有13個(gè)基因(登錄號(hào)麗—018092,AA632745,麗—007250，W86513,BC077726,AA156409,W57613,CR749811,AW972553,AL832896,AK021778,AK026403或AK025204)在Caki-l、Caki-2、786-0以及A498這四種RCC細(xì)胞系中上調(diào)。其中，有8種基因也在RCC細(xì)胞系中上調(diào)(圖2a)。這些結(jié)果與大多數(shù)受試病例中的微陣列分析結(jié)果高度一致。特別是證實(shí)了與RPTEC相比，C6700的表達(dá)量在ACHN，769-P,RXF-631L,TUHR10TKB,Caki-l,Caki-2，786-0和A-498這八種細(xì)胞系中的3種，A704、0S-RC-2和TUHR14TKB中上調(diào)(圖2b)。為了進(jìn)一步考察這些候選基因的表達(dá)圖式，使用各種cDNA片段作為探針對(duì)多種人組織和RCC細(xì)胞系進(jìn)行了Northern印跡分析(見材料與方法)。在這些候選基因中，C6700(指稱為腦信號(hào)蛋白5B,SEMA5B(Genbank登錄號(hào)BC077726)的表達(dá)限于除了胎腎和胎腦外的正常人組織中(圖3左圖面)。另夕卜，利用C6700的cDNA片段作為探針對(duì)RCC細(xì)胞系進(jìn)行了Northern印跡分析(見材料與方法)。C6700的表達(dá)在11種RCC細(xì)胞系中的三種中上調(diào)(圖3,右圖面)。接著，USCS數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，F(xiàn)5749，指稱為ABI基因家族成員3(ASS/f)結(jié)合蛋白G45/W尸)(Genbank登錄號(hào)AK025204)，定位在染色體3ql2上，并且具有由11個(gè)外顯子構(gòu)成的3545個(gè)^威基的轉(zhuǎn)錄物和由35個(gè)外顯子構(gòu)成的4533個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄物。利用特異探針進(jìn)行的多重Northern印跡分析顯示3545個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄物在任何正常人組織中均無表達(dá)(圖4a)，然而用3545堿基轉(zhuǎn)錄物和4533堿基轉(zhuǎn)錄物的共有序列作為探針，則觀察到正常人組織中普遍表達(dá)大約2.0、4.5和7.5kb的轉(zhuǎn)錄物(圖4b)。C8919,指稱為L(zhǎng)OC339977，與假設(shè)蛋白MGC38937相似(Genbank登錄號(hào)；CR749811),定位在4ql1染色體上，并且具有由4個(gè)外顯子構(gòu)成的3348個(gè)石咸基的轉(zhuǎn)錄物。多重Northern印跡分析顯示大約3.4kb的轉(zhuǎn)錄物僅在骨骼肌中有非常微弱的表達(dá)(圖5)。B7032N，指稱為PFKFB4(6-果糖磷酸激酶-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶4)基因(GenBank登錄號(hào)NM—004567)，其大約3.5kb的PFKFB4轉(zhuǎn)錄物在11個(gè)膀胱癌細(xì)胞系的2個(gè)中表達(dá)上調(diào)，但在除睪丸和胰臟以外的正常器官中沒有表達(dá)(圖6)。B9320，指稱為i^丑76(F-box和富亮氨酸重復(fù)序列蛋白16)基因(GenBank登錄號(hào)VI為BC034014，V2為NM—153350),它的大約4kb(Vl)和2.4kb(V2)的兩個(gè)FBXL16轉(zhuǎn)錄物在4個(gè)膀胱癌細(xì)胞系的2個(gè)中顯著上調(diào)。2.4kb轉(zhuǎn)錄物在腎臟和曱狀腺中有表達(dá)，然而4kb的轉(zhuǎn)錄物在除了腦、睪丸、脊髓和胰臟以外的正常器官中沒有表達(dá)(圖7)。為了進(jìn)一步考察B7032N的特性，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中測(cè)定了B7032N的表達(dá)及B7032N基因產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位。首先，當(dāng)表達(dá)B7032N蛋白的質(zhì)粒(pCAGGS-B7032N-HA)瞬時(shí)孝爭(zhēng)染至!JCOS7纟田月包中日于，western印跡分析顯示，在轉(zhuǎn)染24和48小時(shí)后，外源B7032N作為預(yù)期大小的條帶表達(dá)(圖10a)。此外，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示了在所有轉(zhuǎn)染細(xì)胞中外源均定位于細(xì)胞質(zhì)(圖10b)。為了進(jìn)一步考察B9320的特性，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中考察了B9320的表達(dá)及B9320基因產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位。首先，將表達(dá)B9320蛋白的質(zhì)粒(pCAGGS-B9320-HA)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞中時(shí)，western印跡分析顯示，外源B9320在轉(zhuǎn)染24和48小時(shí)后均作為單一條帶表達(dá)(圖13a)。此外，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示在所有轉(zhuǎn)染細(xì)胞中外源均定位于細(xì)胞質(zhì)(圖13b)。C6700的基因組結(jié)構(gòu)為了獲得C6700的完整cDNA序列，以RCC細(xì)胞系OS-RC-2或A704為模板進(jìn)行了RT-PCR。C6700，指稱為腦信號(hào)蛋白5B，SEMA5B,定位于染色體3p21.1上。C6700具有兩個(gè)由23個(gè)外顯子組成的不同的轉(zhuǎn)錄變體，分別對(duì)應(yīng)于C6700V1和C6700V2(圖8a)。在V2的外顯子1、16和20中有可選變化，而其它外顯子是兩個(gè)變體共有的，在V2最后一個(gè)外顯子中產(chǎn)生了一個(gè)新的終止密碼子，而VI的終止密碼子在外顯子22中。產(chǎn)生了一個(gè)由32bp組成的新外顯子作為V2變體的外顯子1。V2的外顯子16比VI的外顯子16在3'末端長(zhǎng)3bp,而V2的外顯子20也比V1的外顯子20在5，末端長(zhǎng)3bp。另夕卜，外顯子21比V2的外顯子21在3'末端短131bp。C6700V1和C6700V2變體的全長(zhǎng)cDNA序列分別由4725和4494個(gè)核苦酸構(gòu)成。這些變體的ORF是在各自的外顯子1中開始的。最終，VI和V2轉(zhuǎn)錄物分別編碼1093個(gè)和1152個(gè)氨基酸。為了進(jìn)一步確認(rèn)每個(gè)變體在RCC細(xì)胞系中的表達(dá)圖式，利用識(shí)別每種變體的引物組進(jìn)行了半定量RT-PCR(見圖8b)。結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了V2變體在RCC細(xì)胞中特異性地過高表達(dá)(圖8b)。因此，對(duì)于C6700V2進(jìn)行了進(jìn)一步的功能分析。設(shè)計(jì)用于降低C6700、B7032N和B9320表達(dá)的小干擾RNA(siRNA)的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)為了評(píng)估C6700、B7032N和B9320的促生長(zhǎng)作用，通過基于哺乳動(dòng)物細(xì)胞載體的RNA干擾技術(shù)敲低了RCC細(xì)胞系中內(nèi)源性C6700、B7032N和B9320的表達(dá)，其中，對(duì)于C6700,使用OS-RC-2細(xì)胞系，其包含顯示C6700過高表達(dá)的細(xì)胞；對(duì)于B7032N,使用顯示B7032N過高表達(dá)的RXF-631L和A498;對(duì)于B9320，使用顯示B9320過高表達(dá)的Caki-2和A498(見材料與方法)。C6700、B7032N和B9320的表達(dá)水平通過半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)力口以考察。如圖9a所示，與四種對(duì)照siRNA構(gòu)建體(psiU6BX-螢光素酶，亂序,EGFP和模擬)相比，C6700特異的siRNA(sil,si6和si-弁2)抑制了C6700的表達(dá)。與對(duì)照siRNA(si-亂序和si-模擬)相比，在檢測(cè)的這些siRNA構(gòu)建體中，si^2有效地降低了SEMA5BmRNA的表達(dá)(圖9a)。在利用si-#2處理后的細(xì)胞中觀察到了細(xì)胞集落數(shù)的明顯下降(圖9c)以及MTT測(cè)定測(cè)得的活細(xì)胞數(shù)目的明顯下降(圖9b)。為了排除SEMA5B-siRNA(si^2)脫靶效應(yīng)的可能性，制備了具有3-bp替代的兩種形式的siRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在OS-RC-2細(xì)胞中，這兩種siRNA都沒有抑制SEMA5B的表達(dá)(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果提示C6700在RCC的細(xì)胞存活和/或生長(zhǎng)中有顯著的功能。如圖ll所示，與對(duì)照siRNA構(gòu)建體(si-亂序)相比，B7032N(-si弁4)抑制了該基因的表達(dá)(圖lla，llb)。利用這些siRNA構(gòu)建體進(jìn)^f亍的集落形成測(cè)定和MTT測(cè)定表明，導(dǎo)入PFKPB4-si#4抑制了RXF-631L(圖1la)和A498(圖llb)細(xì)胞的生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步確認(rèn)B7032N的促生長(zhǎng)效應(yīng)，建立了穩(wěn)定表達(dá)外源性B7032N的NIH3T3衍生細(xì)胞(B7032N-A、-B、-C和-D細(xì)胞)。Western印跡分析表明在四個(gè)衍生克隆中具有很高的外源B7032N蛋白水平(圖12a)。隨后的MTT測(cè)定顯示了四種衍生細(xì)胞系即B7032N-A,-B，-C和-D細(xì)胞，比轉(zhuǎn)染了模擬質(zhì)粒的細(xì)胞(模擬-A，-B和-C細(xì)胞)生長(zhǎng)快得多(圖12b)，表明B7032N的表達(dá)可能增強(qiáng)細(xì)胞生長(zhǎng)。這些結(jié)果暗示B7032N對(duì)RCC發(fā)生具有致癌(oncogenic)作用。如圖14所示，與對(duì)照siRNA構(gòu)建體(si-亂序)相比，B9320(si弁2)顯著地抑制了該基因的表達(dá)(圖14)。利用這些siRNA構(gòu)建體進(jìn)行的集落形成測(cè)定和MTT測(cè)定表明導(dǎo)入FBXL16特異性的siRNA抑制了Caki-2(圖14a)和A498(圖14b)細(xì)胞的生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步確認(rèn)B9320的促生長(zhǎng)效應(yīng)，建立了穩(wěn)定表達(dá)外源性B9320的NIH3T3衍生細(xì)胞(FBXL16-1，-2,-3和-4細(xì)胞)。Western印跡分析表明在四個(gè)衍生克隆中具有很高的外源B9320蛋白水平<table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>下劃線部分表示特異性siRNA序列。最近分子生物學(xué)的進(jìn)步增進(jìn)了我們對(duì)于多種人腫瘤成因的認(rèn)識(shí)。對(duì)于RCC，幾個(gè)研究組已經(jīng)報(bào)道了基于微陣列的分子模式分析(YaoM，etal.,(2005)JPathol.;205:377-87;LiouLS，etal.，(2004)BMCUrol.;4:9;TakahashiM,etal.,(2001)ProcNatlAcadSciUSA.;98:9754陽(yáng)9;BoerJM，etal.，(2001)GenomeRes.;ll:1861畫70;YoungAN，etal.,(2001)AmJPathol.;158:1639-51;HigginsJP,etal"(2003)AmJPathol.;162:925-32;SkubitzKMandSkubitzAP.(2002)JLabClinMed.;140:52-64.)。雖然這些研究突顯了一些可能用于診斷標(biāo)志的候選基因，但是由于腫瘤塊通常是多種細(xì)胞群體的混合物，除了癌細(xì)胞外還包含例如炎癥細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等，并且每種細(xì)胞類型所占的比例隨個(gè)體的不同有很明顯的變化，所以，基于從肺瘤塊中分離的mRNA的數(shù)據(jù)可能不能確切地反映腎癌發(fā)生過程中的變化。另外，RCC被認(rèn)為是來源于腎皮質(zhì)中的腎近端小管上皮細(xì)胞。因此，以前公開的微陣列數(shù)據(jù)可能受到對(duì)照制備物中細(xì)胞異質(zhì)性的顯著影響。在本發(fā)明中，進(jìn)行激光微束顯微解剖(LMM)來獲得腎癌細(xì)胞以及對(duì)照正常腎皮質(zhì)細(xì)胞的純?nèi)后w。與利用從總體(bulk)腫瘤組織中獲得的RNA通過孩t陣列獲得的一種代表性透明細(xì)胞RCC(ccRCC)表達(dá)模式數(shù)據(jù)(TakahashiM,etal.，(2003)Oncogene.;22:6810-8.)相比較，在超過75%的本發(fā)明的ccRCC信息病例中普遍上調(diào)的85個(gè)基因(表4)中，僅有4個(gè)(5%)與總體的表達(dá)模式數(shù)據(jù)相重疊(TakahashiM,etal.,(2003)Oncogene.;22:6810-8.)。這些差異是因?yàn)镽CC細(xì)胞在組織病理學(xué)上是異源的，來自總體組織的表達(dá)模式可能會(huì)由于非癌性細(xì)胞的混入而受到明顯影響。令人驚訝的是，在我們的基因列表(表4)中上調(diào)最明顯的前24個(gè)基因均不包含在以前從總體組織獲得的ccRCC表達(dá)模式的結(jié)果中(YaoM，etal.，(2005)JPathol.;205:377-87;TakahashiM,etal.，(2003)Oncogene.;22:6810-8.)。這個(gè)證據(jù)提示，本發(fā)明的微陣列比其它報(bào)道的數(shù)據(jù)更可靠。該差異可能是由于腎髓質(zhì)混入用作對(duì)照的正常腎組織中，明顯干擾了此前的從總體細(xì)胞獲得的表達(dá)模式。例如，在腎皮質(zhì)的腎近端小管上皮細(xì)胞中高表達(dá)而非在腎髓質(zhì)中高表達(dá)的基因，可能被選擇作為總體組織表達(dá)模式中的下調(diào)或者無變化的基因?？紤]到以上這些因素，從外科手術(shù)樣品中利用LMM系統(tǒng)盡可能地純化癌性和正常上皮細(xì)胞的群體是非常必要的。在大多數(shù)ccRCC中表達(dá)變化的基因可以用作診斷分子標(biāo)志以及治療RCC的靶標(biāo)，或者可能是腎癌發(fā)生的原因。在上調(diào)的基因中，NNMT(煙酰胺N-曱基轉(zhuǎn)移酶)，IGFBP3(胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3),ENPP3(胞外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3)，VEGF(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子)以及VWF(VonWillebrand因子)及其它，包含在本申請(qǐng)中。已經(jīng)報(bào)道了NNMT與在其它類型的RCC中相比在ccRCC中頻繁增加，并且將其與RCC的良好預(yù)后相關(guān)聯(lián)(YaoM，etal.，(2005)JPathol.;205:377-87.)。免疫組織化學(xué)染色顯示IGFBP-3導(dǎo)致ccRCC中的IGF軸失調(diào)(TakahashiM,etal.,(2005)IntJOncol.;26:923-31;CheungCW，etal.，(2004)KidneyInt.;65:1272-9.)。還證明IGFP-3以自分泌的方式在RCC細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)中起到一些作用(TakahashiM，etal.，(2005)IntJOncol.;26:923-31;CheungCW，etal,,(2004)KidneyInt.;65:1272-9.)。胞外核香酸焦磷酸酶(ecto-nucleotidepyrophosphatase)/磷酸二酯酶-I酶(E-NPP)，剪切多種底物的磷酸二酯鍵和磷酸硫酸鍵。哺乳動(dòng)物的E-NPP是一個(gè)由三種緊密相關(guān)的蛋白E-NPP1、E-NPP2和E-NPP3構(gòu)成的蛋白家族。ENPP3的功能目前未知，但是已有報(bào)道ENPP3在腫瘤組織中的表達(dá)比在胂瘤周圍組織中高、在膽管癌(BDC)患者的血清中檢測(cè)到了特異形式的ENPP3，且ENPP3促進(jìn)細(xì)胞遷移。因此，ENPP3可能與腫瘤性BDC的浸潤(rùn)性相關(guān)，并且可以用作腫瘤標(biāo)志(YanoY,etal.,(2004)CancerLett.;207:139-47.)。血清中VEGF及vWF的水平被認(rèn)為是免疫調(diào)節(jié)劑的預(yù)測(cè)性標(biāo)志，該類免疫調(diào)節(jié)劑包括白介素2和IFN-alpha;與具有較低血清水平VEGF及vWF的患者相比，具有較高水平的這兩種蛋白的患者對(duì)于這些治療反應(yīng)不佳(BraybrookeJP,etal.,(2000)ClinCancerRes.;6:4697-704.)。此外，ABCG1(ATP結(jié)合盒，亞家族G(WHITE),成員l)及STC2(硬骨魚4丐蛋白2)ABCG1，通常介導(dǎo)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。Hernan等人報(bào)道了通過微陣列分析和差異顯示得知ABCG1在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中上調(diào)(YanoY,etal.，(2004)CancerLett.;207:139-47.)。另一方面，在下調(diào)的基因中，WT1(維爾姆斯瘤I)，CDKNIC(細(xì)胞周期蛋白依賴的激酶抑制劑1C)及GAS1(生長(zhǎng)停滯特異性l)顯示了它們?cè)谏L(zhǎng)抑制或細(xì)胞凋亡中的作用(NiuZ，etal.,(2005)JUrol.;174:1460-2;KikuchiT，etal.，(2002)Oncogene.;21:2741-9;WatanabeH，etal.,(1998)ProcNatlAcadSciUSA.;95:1392-7;EvdokiouA&CowledPA.(1998)IntJCancer.;75:568-77)。NiuZ.等人已經(jīng)報(bào)道了與相應(yīng)的正常腎組織相比，WT1的表達(dá)在RCC腫瘤中明顯下調(diào)(NiuZ,etal.,(2005)JUrol.;174:1460-2.)，盡管未指出RCC的臨床病理學(xué)特征與其mRNA水平之間有明顯的相關(guān)性。已知CDKN1C可以通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的活性來誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯。已經(jīng)報(bào)道該基因在例如結(jié)腸直腸癌，胃癌，肝細(xì)胞癌以及胰腺癌等實(shí)體腫瘤中的表觀遺傳沉默(Epigeneticsilencing)(KikuchiT,etal.，(2002)Oncogene.;21:2741-9.),提示CDKN1C作為腫瘤抑制基因起作用。GAS1也在本發(fā)明15個(gè)病例的14個(gè)中明顯下調(diào)。已經(jīng)報(bào)道誘導(dǎo)GAS1在神經(jīng)元細(xì)胞中抑制細(xì)胞的增殖和/或?qū)е碌蛲觯⑶褿AS1的表達(dá)減慢神經(jīng)膠質(zhì)的增殖(EvdokiouA&CowledPA.(1998)IntJCancer;75:568-77.)。在我們的列表的上調(diào)基因中，本發(fā)明特別關(guān)注腦信號(hào)蛋白5B(Semaphorin5B)(SEMA5B)作為RCC治療的可能分子靶標(biāo)，因?yàn)樗赗CC中頻繁地反式活化并且在發(fā)明人所考察的任何正常人組織中其表達(dá)水平均檢測(cè)不到。在本發(fā)明的上下文中，證明了通過siRNA將其表達(dá)水平敲低，特異性地顯著抑制了RCC細(xì)胞的生長(zhǎng)，表明其在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)中的重要作用。SEMA5B是一個(gè)細(xì)胞表面和分泌糖蛋白家族，這些蛋白屬于一群多種多樣的編碼生長(zhǎng)導(dǎo)向信號(hào)(growthguidancecues)的基因(KolodkinAL,etal.，(1993)Cell.;75:1389-99.)。腦信號(hào)蛋白及它們的受體，叢蛋白(plexins)，最初是在神經(jīng)系統(tǒng)中鑒定出來的，在神經(jīng)系統(tǒng)中需要它們來建立正確的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。它們的范圍已經(jīng)擴(kuò)展到幾種非神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)程包括心臟和骨骼的發(fā)育，免疫應(yīng)答以及上皮形態(tài)發(fā)生。近來，已經(jīng)指明了腦信號(hào)蛋白在肺瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的作用(TamagnoneL&ComoglioPM.(2004)EMBORep.;5:356-61.)。在本說明書中，已經(jīng)表明SEMA5B在透明細(xì)胞型RCC以及RCC細(xì)胞系中頻繁表達(dá)，意味著將SEMA5B作為靶標(biāo)可能是開發(fā)新治療藥物的一種有前途的途徑。在本報(bào)告中，通過(though)膀胱癌的準(zhǔn)確表達(dá)模式，鑒定了B7032N和B9320在RCC細(xì)胞中顯著過高表達(dá)。對(duì)于多種正常人組織和RCC細(xì)胞系進(jìn)行的Northern印跡分析顯示B7032N在除了睪丸和胰臟以外的正常人組織中的表達(dá)幾乎檢測(cè)不到，而在受檢的正常人生命組織中幾乎檢測(cè)不到B9320的表達(dá)。該結(jié)論顯示這些基因可以成為開發(fā)針對(duì)RCC的抗癌劑的有價(jià)值靶標(biāo)。此外，本發(fā)明顯示內(nèi)源B7032N和B9320的敲低導(dǎo)致了RCC細(xì)胞中細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制?？傊鹏薜懒薆7032N和B9320在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中顯示出促生長(zhǎng)活性，并且通過siRNA將其表達(dá)敲低抑制了膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。開發(fā)拮抗B7032N和B9320功能的藥物可能是癌癥治療的一種合理的策略。雖然對(duì)B7032N和B9320功能的進(jìn)一步分析是必要的，但已經(jīng)提出的數(shù)據(jù)應(yīng)該對(duì)加深RCC癌發(fā)生的理解以及開發(fā)RCC的新療法有所貢獻(xiàn)。總體來說，通過本發(fā)明的準(zhǔn)確RCC表達(dá)模式鑒定的上調(diào)基因會(huì)使我們對(duì)腎癌發(fā)生有更好的理解，并且為發(fā)展用于RCC治療及腫瘤診斷標(biāo)志的新分子靶標(biāo)提供有用信息。工業(yè)實(shí)用性本說明書記載的通過聯(lián)用激光捕獲解剖與全基因組cDNA微陣列獲得的腎細(xì)胞癌基因表達(dá)分析鑒定了作為癌癥預(yù)防和治療靶標(biāo)的特異性基因?；谶@些差異表達(dá)的基因的子集的表達(dá)，本發(fā)明為鑒定或檢測(cè)腎細(xì)胞癌提供了分子診斷標(biāo)志。本說明書記載的方法也可用于鑒定預(yù)防、診斷以及治療腎細(xì)胞癌的其它分子靶標(biāo)。本說明書報(bào)道的數(shù)據(jù)增加了對(duì)于腎細(xì)胞癌的全面了解，促進(jìn)了新診斷策略的開發(fā)，并且為鑒定用于治療藥物或者預(yù)防藥物的分子靶標(biāo)提供了線索。該信息對(duì)更深刻的理解腎細(xì)胞癌的形成做出了貢獻(xiàn)，并且為開發(fā)診斷、治療以及最終預(yù)防腎細(xì)胞癌的新策略提供了啟示。如本說明書所示，通過特異性靶向基因C6700、B7032N或B9320基因的小干擾RNA(siRNA)能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，新的siRNA是開發(fā)抗癌藥物的有用靶標(biāo)。例如，阻遏C6700、B7032N或B9320表達(dá)或者抑制其活性的物質(zhì)可以作為抗癌劑、特別是作為治療腎癌例如腎細(xì)胞癌的抗癌劑，用于治療用途。本說明書提及的所有專利、專利申請(qǐng)和出版物皆全文并入本說明書作為參考。另外，盡管已經(jīng)詳細(xì)地并且參考本發(fā)明的具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但可理解的是上述說明書實(shí)際上是例示性和解釋性的，意欲闡明本發(fā)明及其優(yōu)選實(shí)施方案。通過常規(guī)的實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地認(rèn)識(shí)到，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和》,飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明并不意欲受到上述說明的限定，而由如下權(quán)利要求及其等同物限定。權(quán)利要求1.一種診斷受試者中的RCC或發(fā)生RCC的傾向性的方法，該方法包括測(cè)定源自患者的生物樣品中RCC相關(guān)基因的表達(dá)水平，其中，所述基因在所述樣品中的表達(dá)水平與正常對(duì)照水平相比上升或下降表示該受試者患有RCC或存在發(fā)生RCC的危險(xiǎn)。151015GlyProProAspThrProAlaGinGinLeuArgCysGlyTrpThrVal202530GlyGlyTrpLeuLeuSerLeuValArgGlyLeuLeuProCysLeuPro354045ProGlyAlaArgThrAlaGluGlyProlieMetValLeuAlaGlyPro505560LeuAlaValSerLeuLeuLeuProSerLeuThrLeuLeuValSerHis65707580LeuSerSerSerGinAspValSerSerGluProSerSerGluGinGin859095LeuCysAlaLeuSerLysHisProThrValAlaPheGluAspLeuGin100105110ProTrpValSerAsnPheThrTyrProGlyAlaArgAspPheSerGin115120125LeuAlaLeuAspProSerGlyAsnGinI>eulieValGlyAlaArgAsn130135140TyrLeuPheArgLeuSerLeuAlaAsnValSerLeuLeuGinAlaThr145150155160GluTrpAlaSerSerGluAspThrArgArgSerCysGinSerLysGly165170175LysThrGluGluGluCysGinAsnTyrValArgValLeulieValAla180185190GlyArgLysValPheMetCysGlyThrAsnAlaPheSerProMetCys195200205ThrSerArgGinValGlyAsnLeuSerArgThrlieGluLyslieAsn210215220GlyValAlaArgCysProTyrAspProArgHisAsnSerThrAlaVal225230235240lieSerSerGinGlyGluLeuTyrAlaAlaThrVallieAspPheSer245250255GlyArgAspProAlalieTyrArgSerLeuGlySerGlyProProLeu260265270ArgThrAlaGinTyrAsnSerLysTrpLeuAsnGluProAsnPheVal275280285AlaAlaTyrAsplieGlyLeuPheAlaTyrPhePheLeuArgGluAsn290295300AlaValGluHisAspCysGlyArgThrValTyrSerArgValAlaArg305310315320ValCysLysAsnA印ValGlyGlyArgPheLeuLeuGluAspThrTrp325330335ThrThrPheMetLysAlaArgLeuAsnCysSerArgProGlyGluVal340345350ProPheTyrTyrAsnGluLeuGinSerAlaPheHisLeuProGluGin355360365AspLeulieTyrGlyValPheThrThrAsnValAsnSerlieAlaAla370375380SerAlaValCysAlaPheAsnLeuSerAlalieSerGinAlaPheAsn385390395400GlyProPheArgTyrGinGluAsnProArgAlaAlaTrpLeuProlie405410415AlaAsnProlieProAsnPheGinCysGlyThrLeuProGluThrGly420425430ProAsnGluAsnLeuThrGluArgSerLeuGinAspAlaGinArgLeu435440445PheLeuMetSerGluAlaValGinProValThrProGluProCysVal450455460ThrGinAspSerValArgPheSerHisLeuValValAspLeuValGin465470475480AlaLysAspThrLeuTyrHisValLeuTyrlieGlyThrGluSerGly485490495ThrlieLeuLysAlaLeuSerThrAlaSerArgSerLeuHisGlyCys500505510TyrLeuGluGluLeuHisValLeuProProGlyArgArgGluProLeu515520525ArgSerLeuArglieLeuHisSerAlaArgAlaLeuPheValGlyLeu530535540ArgAspGlyValLeuArgValProLeuGluArgCysAlaAlaTyrArg545550555560SerGinGlyAlaCysLeuGlyAlaArgAspProTyrCysGlyTrpAsp565570575GlyLysGinGinArgCysSerThrLeuGluAspSerSerAsnMetSer580585590LeuT卬ThrGinAsnlieThrAlaCysProValArgAsnValThrArg595600605AspGlyGlyPheGlyProTrpSerProTrpGinProCysGluHisLeu610615620AspGlyAspAsnSerGlySerCysLeuCysArgAlaArgSerCysAsp625630635640SerProArgProArgCysGlyGlyLeuAspCysLeuGlyProAlalie645650655HislieAlaAsnCysSerArgAsnGlyAlaTrpThrProTrpSerSer660665670TrpAlaLeuCysSerThrSerCysGlylieGlyPheGinValArgGin675680685ArgSerCysSerAsnProAlaProArgHisGlyGlyArgliePheVal690695700GlyLysSerArgGluGluArgPheCysAsnGluAsnThrProCysPro705710715720ValProliePheTrpAlaSerTrpGlySerTrpSerLysCysSerSer725730735AsnCysGlyGlyGlyMetGinSerArgArgArgAlaCysGluAsnGly740745750AsnSerCysLeuGlyCysGlyGluPheLysThrCysAsnProGluGly755760765CysProGluValArgArgAsnThrProTrpThrProTrpLeuProVal770775780AsnValThrGinGlyGlyAlaArgGinGluGinArgPheArgPheThr785790795■CysArgAlaProLeuAlaAspProHisGlyLeuGinPheGlyArgArg805810815ArgThrGluThrArgThrCysProAlaAspGlySerGlySerCysAsp820825830ThrAspAlaLeuValGluValLeuLeuArgSerGlySerThrSerPro835840845HisThrValSerGlyGlyTrpAlaAlaTrpGlyProTrpSerSerCys850855860SerArgAspCysGluLeuGlyPheArgValArgLysArgThrCysThr865870875880AsnProGluProArgAsnGlyGlyLeuProCysValGlyAspAlaAla885890895GluTyrGinAspCysAsnProGinAlaCysProValArgGlyAlaTrp900905910SerCysTrpThrSerTrpSerProCysSerAlaSerCysGlyGlyGly序列表第31/77頁(yè)915920925HisTyrGinArgThrArgSerCysThrSerProAlaProSerProGly930935940GluAsplieCysLeuGlyLeuHisThrGluGluAlaLeuCysAlaThr945950955960GinAlaCysProGlyTrpSerProTrpSerGluTrpSerLysCysThr965970975AspAspGlyAlaGinSerArgSerArgHisCysGluGluLeuLeuPro980985990GlySerSerAlaCysAlaGlyAsnSerSerGinSerArgProCysPro99510001005TyrSerGlulieProVallieLeuProAlaSerSerMetGluGlu101010151020AlaThrAspCysAlaGlyLysArgAsnArgThrTyrLeuMetLeu102510301035ArgSerSerGinProSerSerThrProLeuGinSerLeuAspSer104010451050PheHislieLeuLeuGinThrAlaLysLeuCysTrpGlyProHis105510601065CysPheGluMetGlySerlieSerSerThrTrpTrpProArgAla107010751080SerProAlaSerTrpAlaLeuGlySer10851090<210>65<211>4494<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220〉〈221〉CDS<222>(71)..(3526)<400>65gggaaccgggcacctgcacccgcctctgggagtgagtggctccagctggtgcctggcctg60tgtctcttggatgccctgtggcttcagtccgtctcctgttgcccaccac109MetProCysGlyPheSerProSerProValAlaHisHis1510etcgtccctgggccgcctgataccccagcccaacagetaaggtgtgga157LeuValProGlyProProAspThrProAlaGinGinLeuArgCysGly152025tggacagtagggggctggcttetcteactggtcaggggtcttetcccc205TrpThrValGlyGlyTrpLeuLeuSerLeuValArgGlyLeuLeuPro30354045tgtct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