本發(fā)明涉及真菌發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種提高蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草菌素產(chǎn)量的方法。

背景技術(shù)：

蛹蟲草為子囊菌亞門，麥角菌目，麥角菌科、蟲草屬的模式種。學名為Cordycepsmilitaris，又名北冬蟲夏草、北蟲草等，有部分地區(qū)亦稱為踴蟲草，世界性分布天然資源數(shù)量很少。蟲草菌素是冬蟲夏草和蛹蟲草中(尤其是核苷類)主要活性成分，也是第一個從真菌中分離出來的核苷類抗生素。蟲草素一種天然來源的藥物，具有中醫(yī)醫(yī)理中冬蟲夏草一樣的陰陽同補和雙向調(diào)節(jié)人體平衡的功能；它在護肝、保腎、潤肺方面由于成分更純效果更好，而且大補氣血，能消除現(xiàn)在不能治愈的痛經(jīng)、偏頭痛、頸椎增生等疾病。從西醫(yī)醫(yī)理角度看蟲草素具有抗腫瘤、抗衰老、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、改善新陳代謝、清除自由基等多種藥理作用，有良好的臨床應用前景。目前蟲草素的研究現(xiàn)正成為藥物化學、抗衰老、美容、保健品領(lǐng)域中一個極其活躍的領(lǐng)域。蛹蟲草的培養(yǎng)大多集中在固體培養(yǎng)的研究，對于液體培養(yǎng)涉及的比較少，且涉及到的液體培養(yǎng)產(chǎn)量低，無法滿足市場需求。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種提高蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草菌素產(chǎn)量的方法，對蛹蟲草生物量和蛹蟲草產(chǎn)蟲草素能力有顯著的促進作用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種提高蛹蟲草液體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草菌素產(chǎn)量的方法，包括菌種活化、蛹蟲草菌種制作、蛹蟲草培養(yǎng)，液體菌種制作的過程中采用孢子濃度3.0×10⁸CFU/mL或者4-5塊菌餅時制作的母種作為蛹蟲草菌種擴大培養(yǎng)中的一級種子液；蛹蟲草培養(yǎng)過程中采用的發(fā)酵培養(yǎng)基包含葡萄糖糖、土豆、魚蛋白胨、(NH₄)₂SO₄、KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、蠶蛹粉、VB₁和水。

作為本發(fā)明進一步的方案：發(fā)酵培養(yǎng)基中各成分的含量為：葡萄糖25g/L，土豆100g/L，魚蛋白胨18g/L，(NH₄)₂SO₄0.8g/L，KH₂PO₄1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，蠶蛹粉5.0g/L，VB₁18mg/L，水1L。

作為本發(fā)明進一步的方案：蛹蟲草菌種采用NS-810菌株。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

通過本發(fā)明優(yōu)化后蛹蟲草生物量和蟲草菌素總產(chǎn)量都要比未優(yōu)化的高得多，優(yōu)化后蛹蟲草生物量提高了74.51％，蟲草菌素總產(chǎn)量提高了238.52％。本發(fā)明對蛹蟲草生物量和蛹蟲草產(chǎn)蟲草素能力有顯著的促進作用。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

實施例1

本發(fā)明實施例中，為了獲得蛹蟲草液體一級種制備和液體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草菌素的最佳工藝，以蛹蟲草Cordyceps militaris(L)link.NS-810菌株為菌種，通過對接種量(孢子濃度和菌餅數(shù)量)的考察，探索不同孢子濃度和菌餅數(shù)對蛹蟲草液體一級種制作效果的影響；通過單次單因子和正交試驗，優(yōu)化蛹蟲草深層發(fā)酵產(chǎn)蟲草素的最佳培養(yǎng)基。具體描述如下：

1材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基

蛹蟲草[Cordyceps militaris(L)link.]分離自四川省甘孜藏族自治州九龍縣瓦灰山自然保護區(qū)采集的蛹蟲草鮮標本，命名為蛹蟲草NS-810，經(jīng)馴化保存于四川省高等學校特色農(nóng)業(yè)資源研究與利用重點實驗室。

菌種活化培養(yǎng)基(PDA)：葡萄糖20g，土豆200g，魚蛋白胨5g，水1L；蛹蟲草液體母種培養(yǎng)基：葡萄糖20g，土豆200g，蛋白胨5g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄.7H₂O 1.5g，水1L，112℃滅菌30min；蛹蟲草發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20g，土豆200g，蛋白胨10g，KH₂PO₄ 2g，MgSO₄.7H₂O 1.5g，水1L，112℃滅菌30min。

1.2試劑與儀器

蟲草菌素標準品購于美國Sigma公司；魚蛋白胨(工業(yè)級)購于上海緣肽生物技術(shù)有限公司；Agilent 1100分析型高效液相色譜儀美國安捷倫公司；50L發(fā)酵罐江蘇豐澤生物工程設(shè)備制造有限公司。

1.3方法

1.3.1供試菌株的活化

將采用打孔器(直徑D＝10mm)將蛹蟲草菌餅接于PDA培養(yǎng)皿(15mL PDA培養(yǎng)基)中央上，倒置于26℃人工氣候箱中培養(yǎng)5d，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2蛹蟲草液體菌種制備的優(yōu)化

(1)不同蛹蟲草菌餅的接種對液體菌種的影響，用打孔器在活化蛹蟲草菌體的外緣取菌餅，不同數(shù)量的菌餅接種到蛹蟲草液體種培養(yǎng)基中：2塊、3塊、4塊、5塊、6塊、7塊；(2)將NS-810菌株孢子懸液進行稀釋，在顯微鏡下通過血球計數(shù)板計數(shù)，并制作一系列不同的孢子濃度梯度。然后將蛹蟲草液體種培養(yǎng)基調(diào)到如下孢子濃度：2.0×10⁵、2.0×10⁶、2.0×10⁷、2×10⁸、2.5×10⁸、3×10⁸、3.5×10⁸、4×10⁸CFU/mL；150r/min，21℃振蕩培養(yǎng)，從第2天到5天連續(xù)觀察不同數(shù)量菌塊接種后液體一級菌種菌絲球的形態(tài)、大小、數(shù)量及發(fā)酵液的狀態(tài)變化，每個處理3個重復。

1.3.3種子液制備

將NS-810菌株孢子懸液進行稀釋，然后按孢子濃度為3×10⁸CFU/mL或者用打孔器取得蛹蟲草菌餅4-5塊接種液體母種培養(yǎng)基(裝液量為50mL/250mL)中，140r/min，21℃振蕩培養(yǎng)4d，再10％(v/v)接種量將種子液接入發(fā)酵搖瓶(裝液量為50mL/250mL)中，140r/min，21℃振蕩培養(yǎng)12d，每個處理3個重復。

13.4接種并深層發(fā)酵

同以10％的接種量轉(zhuǎn)到500mL三角瓶中，140r/min，21℃振蕩培養(yǎng)4-5d作為發(fā)酵罐接種物。50L發(fā)酵罐中培養(yǎng)基體積40L，接種量5％，發(fā)酵溫度24℃，通氣量:1.25m³/h，攪拌培養(yǎng)10d轉(zhuǎn)速為140r/min，然后再靜置培養(yǎng)2天。

1.4測定方法

將蛹蟲草液體培養(yǎng)物于低速大容量多管離心機4000r/min離心10min獲得菌絲體，用蒸餾水沖洗菌絲體3次，于干燥箱中60℃烘干至恒重，稱量；菌絲體和發(fā)酵液中蟲草菌素的測定采用HPLC色譜法，參照劉桂君等在食品科學中發(fā)表的蛹蟲草中蟲草素的研究進展中的方法并進行了優(yōu)化，HPLC色譜條件：Extend-C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動相：甲醇:水(82∶18)，流速：1.0mL/min，檢測波長：260nm，柱溫：30℃。計算公式：蟲草菌素總產(chǎn)量(mg/L)＝[胞外蟲草菌素質(zhì)量(mg)+胞內(nèi)蟲草菌素質(zhì)量(mg)]/發(fā)酵液體積(L)。每個處理3個重復，取其平均值。

1.5液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

以下各項試驗均以菌絲體的生物量和從蟲草素的產(chǎn)量為考察指標，每項試驗中的每個處理3個重復。

1.5.1速效碳源選擇

在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別采用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇作為速效碳源(速效碳源的濃度均為20g/L)，其他組分與蛹蟲草發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同，以不加速效碳源的蛹蟲草發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照。

1.5.2緩效碳源選擇

在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別采用土豆(質(zhì)量濃度分別為100g/L、200g/L和300g/L)、玉米粉(質(zhì)量濃度分別為10g/L、20g/L、30g/L)和可溶性淀粉(質(zhì)量濃度分別為10g/L、20g/L、30g/L)作為緩效碳源，培養(yǎng)基中的速效碳源選用篩選出的最佳速效碳源，其他組分與蛹蟲草發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同，另以不加緩效碳源的液體培養(yǎng)基作為對照。其中，土豆去皮切成薄片，煮沸20min，經(jīng)過濾取濾液加入培養(yǎng)基中。

1.5.3有機氮源選擇

在培養(yǎng)集中分別采用魚蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏、黃豆餅粉(質(zhì)量濃度分別為10g/L、20g/L、10g/L和20g/L，氮素含量基本相同)作為有機氮源，碳源選用篩選出的最佳速效和緩效碳源，其他組分與發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基相同，以不加有機氮源的培養(yǎng)基作為對照。

1.5.4無機氮源選擇

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別采用NH₄NO₃、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、NaNO₃(質(zhì)量濃度分別為0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L和1.25g/L，氮素含量基本相同)作為無機氮源，另選用篩選出的最佳有機氮源、最佳速效和緩效碳源，其他組分與液體培養(yǎng)基相同，以不加無機氮源的液體培養(yǎng)基作為對照。

1.5.5無機鹽選擇

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入3種無機鹽2.0g/LKH₂PO₄、1.5g/LMgSO₄.7H₂O、2.0g/LNaCl并進行無機鹽的營養(yǎng)限制試驗，探討不同的無機鹽及其組合對蛹蟲草生物量的影響。以篩選出的最佳碳、氮源組合作為液體培養(yǎng)基的碳源和氮源，其他組分與液體培養(yǎng)基相同，以不加無機鹽的液體培養(yǎng)基作為對照。

1.5.6生長因子選擇

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加2g/L蠶蛹粉、2g/L玉米漿粉、2g/L L-Glu、2g/L L-Cys、0.5g/L腺嘌呤20mg/L VB₆、20mg/LVB₁、3mg/L NAA進行生長因子的篩選，其他組分為篩選出的最佳碳源、氮源和無機鹽，以不加生長因子的液體培養(yǎng)基作為對照。其中，蠶蛹粉采用繅絲蠶蛹，經(jīng)60℃烘干，粉碎機粉碎，煮沸30min，經(jīng)過濾取濾液加入。

1.5.7發(fā)酵培養(yǎng)基的正交優(yōu)化

在上述試驗優(yōu)化得到的最佳碳源、氮源、無機鹽和生長因子的基礎(chǔ)上，采用L₂₇(3¹³)正交試驗設(shè)計(表1)，以獲得發(fā)酵培養(yǎng)基配方中各成分的最佳濃度以及它們對蛹蟲草菌生物量和產(chǎn)蟲草菌素總產(chǎn)量的影響程度。

表1因素與水平設(shè)計

1.5.8優(yōu)化液體培養(yǎng)基配方的驗證

優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基在相同的培養(yǎng)條件下進行深層發(fā)酵試驗，測定發(fā)酵液中蟲草菌素產(chǎn)量和生物量，比較優(yōu)化前后發(fā)酵培養(yǎng)基對蟲草菌素產(chǎn)量和生物量的影響，以驗證優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

2結(jié)果與分析

2.1蛹蟲草液體菌種制備

不同蛹蟲草菌餅數(shù)和孢子濃度懸液接種對液體菌種的影響見表2，由表可得菌絲球的數(shù)量隨菌餅數(shù)和孢子濃度的增大而增多，但菌絲球的大小卻在減小，種子液由澄清變得渾濁且開始有一定的黏性。結(jié)果表明：接種4-5塊菌餅和孢子濃度3.0×10⁸CFU/mL時菌絲球顆粒大小均勻，直徑約為1.2mm，數(shù)量約為850個，菌絲球顏色呈淡黃色，均勻布滿三角瓶，種子液澄清、透明。從菌絲球的數(shù)量、大小、均勻程度、種子液的澄清度及能接種的體積等方面考慮，選擇4-5塊菌餅或者孢子濃度3.0×10⁸CFU/mL作為發(fā)酵母種的最佳接種濃度。

表2接種不同菌塊數(shù)和孢子濃度對蛹蟲草液體菌種的影響

2.2液體發(fā)酵生產(chǎn)蟲草菌素的最佳工藝

2.2.1發(fā)酵培養(yǎng)基中的速效碳源

分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇作為發(fā)酵培養(yǎng)基的速效碳源。從表3可見發(fā)酵培養(yǎng)基不添加碳源菌絲體生長量和蟲草菌素總產(chǎn)量都很少，說明碳源對蛹蟲草的生長起著非常重要的作用，以蔗糖和葡萄糖為速效碳源的蟲草菌素總產(chǎn)量最大，分別達到了548.93g/L和547.44g/L，從成本和發(fā)酵生產(chǎn)方面考慮，選擇20g/L葡萄糖糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的速效碳源。

表3發(fā)酵培養(yǎng)基中不同速效碳源對蟲草菌素總產(chǎn)量及生物量的影響

注：表中不同小寫字母代表P≤0.05水平上差異顯著，大寫字母代表P≤0.01水平上差異顯著。

2.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基中的緩效碳源

發(fā)酵培養(yǎng)基中添加100g/L土豆為速效碳源的蟲草菌素總產(chǎn)量最大，達到了644.08g/L。因此，選擇100g/L土豆作為發(fā)酵培養(yǎng)基的緩效碳源,選擇葡萄糖和土豆作為復合碳源。

表4發(fā)酵培養(yǎng)基中不同緩效碳源對蟲草菌素總產(chǎn)量及生物量的影響

2.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基中的有機氮源

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加魚蛋白胨、酵母粉、牛肉浸膏和黃豆餅粉作為有機氮源，對蟲草菌素產(chǎn)量和生物量的影響見表5。當培養(yǎng)基中添加魚蛋白胨時，蟲草菌素總產(chǎn)量最大，達到了634.36g/L，選擇10g/L魚蛋白胨作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的有機氮源。

表5發(fā)酵培養(yǎng)基中不同有機氮源對蟲草菌素總產(chǎn)量及生物量的影響

注：表中不同小寫字母代表P≤0.05水平上差異顯著，大寫字母代表P≤0.01水平上差異顯著。

2.2.4發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機氮源

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加NH₄NO₃、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、NaNO₃作為無機氮源，對蟲草菌素產(chǎn)量和生物量的影響見表6，添加(NH₄)₂SO₄時蟲草菌素產(chǎn)量和菌絲體的生長量均高于對照。因此，選擇1.0g/L(NH₄)₂SO₄作為發(fā)酵培養(yǎng)基的無機氮源。

表6發(fā)酵培養(yǎng)基中不同無機氮源對蟲草菌素總產(chǎn)量及生物量的影響

注：表中不同小寫字母代表P≤0.05水平上差異顯著，大寫字母代表P≤0.01水平上差異顯著。

2.2.5發(fā)酵養(yǎng)基中的無機鹽

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O、NaCl作為無機鹽，通過無機鹽選擇和營養(yǎng)限制試驗，可以尋找到蟲草菌素產(chǎn)量和生物量的最佳無機鹽組合。從表7可以看出，2.0g/L KH₂PO₄+1.5g/L MgSO₄·7H₂O組合的蟲草菌素總產(chǎn)量和生物量最高，分別為709.54mg/L和22.37g/L。因此，選擇2.0g/L KH₂PO₄+1.5g/L MgSO₄·7H₂O作為發(fā)酵培養(yǎng)基的無機鹽組分。

表7發(fā)酵培養(yǎng)基中的不同無機鹽組合對蟲草菌素總產(chǎn)量及生物量的影響

注：表中不同小寫字母代表P≤0.05水平上差異顯著，大寫字母代表P≤0.01水平上差異顯著。

2.2.6發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長因子

發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加不同的生長因子對蟲草菌素產(chǎn)量和生物量的影響見表8，從表5可以看出蠶蛹粉、VB6、VB₁、L-Glu、NAA、腺嘌呤對蛹蟲草NS-810菌株產(chǎn)蟲草素的能力都有一定的促進作用。其中，蠶蛹粉對蛹蟲草生產(chǎn)蟲草菌素能力最強(蟲草菌素總產(chǎn)量907.64mg/L)，VB₁次之，達863.10mg/L，說明適量的蠶蛹粉和VB₁能更好地促進蟲草菌素的積累。

表8發(fā)酵培養(yǎng)基中的不同生長因子對蟲草菌素總產(chǎn)量及生物量的影響

注：表中不同小寫字母代表P≤0.05水平上差異顯著，大寫字母代表P≤0.01水平上差異顯著。

2.2.7發(fā)酵培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

正交試驗結(jié)果見表9，采用SAS9.0數(shù)據(jù)分析軟件進行方差分析，分析結(jié)果見表10。從表9-10可以看出，葡萄糖、魚蛋白胨、VB₁、蠶蛹粉和KH₂PO₄對發(fā)酵生產(chǎn)菌體生物量的影響達到顯著水平，另外3個因素影響不顯著。從表9可以得出，最優(yōu)水平為A₃B₂C₂D₁E₂F₂G₁H₁，即葡萄糖25g/L，土豆100g/L，魚蛋白胨20g/L，(NH₄)₂SO₄0.6g/L，KH₂PO₄1.5g/L，MgSO₄·7H₂O1.0g/L，蠶蛹粉3.0g/L，VB₁18mg/L，水1L；而對發(fā)酵生產(chǎn)蟲草菌素總產(chǎn)量的影響達到顯著水平的因素是葡萄糖、KH₂PO₄和蠶蛹粉，最優(yōu)水平為A₃B₂C₁D₂E₁F₁G₂H₁，即葡萄糖25g/L，土豆100g/L，魚蛋白胨18g/L，(NH₄)₂SO₄0.8g/L，KH₂PO₄1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，蠶蛹粉5.0g/L，VB₁18mg/L，水1L。

表9發(fā)酵培養(yǎng)基各組分配比優(yōu)化的正交試驗結(jié)果

注：A：葡萄糖/(g/L)，B：土豆/(g/L)，C：魚蛋白胨/(g/L)，D：(NH₄)₂SO₄/(g/L)，E：KH₂PO₄/(g/L)，F(xiàn)：MgSO₄·7H₂O/(g/L)，G：蠶蛹粉/(g/L)，H：VB₁/(mg/L)。

表10液體培養(yǎng)基各組分對菌絲體干重影響的SAS分析

2.2.8采用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方對蛹蟲草的液體培養(yǎng)驗證

在深層發(fā)酵條件下，采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方，蛹蟲草生物量和蟲草菌素總產(chǎn)量都要比未優(yōu)化的高得多，優(yōu)化后生物量提高了74.51％，蟲草菌素總產(chǎn)量提高了238.52％。說明優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方對蛹蟲草生物量和蛹蟲草產(chǎn)蟲草素能力有顯著的促進作用。

表11發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基與優(yōu)化后的培養(yǎng)基驗證結(jié)果比較

3討論

在高等真菌深層發(fā)酵過程中，種子的制備、培養(yǎng)基和發(fā)酵操作條件是三個主要影響因素，其中種子的制備是生物量的產(chǎn)生和次生代謝產(chǎn)物積累的基礎(chǔ)。目前，液體菌種在蛹蟲草人工栽培中得到廣泛的應用，與傳統(tǒng)的固體接種相比，液體菌種的優(yōu)勢是有生產(chǎn)自動化和集約化程度高，縮短發(fā)菌時間，降低菌種污染率，菌種生產(chǎn)成本低，菌種質(zhì)量有較大提高。在真菌液體菌種尤其是一級種的制作過程中，接種孢子的濃度或者菌餅的塊數(shù)對種子液的狀態(tài)都有直接的影響，而種子液的狀態(tài)又是決定發(fā)酵生產(chǎn)成功與否的重要因素。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在50mL一級種子培養(yǎng)液中接種孢子濃度3.0×10⁸CFU/ml或者菌餅為4-5塊時，菌絲球的數(shù)量、大小、均勻程度、種子液的澄清度均處在最佳的狀態(tài)，且具有最大的有效接種體積，因此，這兩種接種濃度時制作的母種最適合作為蛹蟲草菌種擴大培養(yǎng)中的一級種子液。

蛹蟲草可以很好的利用單糖、二糖，本發(fā)明結(jié)果也證明這一點，篩選出的產(chǎn)蟲草素發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳速效碳源為葡萄糖和蔗糖。在工業(yè)生產(chǎn)中葡萄糖被淀粉水解糖所代替，淀粉質(zhì)原料作為微生物工業(yè)常用的原料之一，經(jīng)糖化所制得的糖液即為淀粉水解糖，它所含主要成分就是葡萄糖，從以后工業(yè)化生產(chǎn)方面考慮，選擇葡萄糖作為深層發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。此外，將土豆作為緩效碳源添加到發(fā)酵培養(yǎng)基培中，可以有效地提高蛹蟲草的生物量和胞外蟲草素的產(chǎn)量，使蟲草素總產(chǎn)量提高近20％。土豆浸汁容易獲得，成本低且營養(yǎng)較豐富，可在發(fā)酵后期為蛹蟲草NS-810菌株提供充足的碳源，延長了產(chǎn)生蟲草素的過程。因此，土豆作為該菌株深層發(fā)酵培養(yǎng)基中的緩效碳源，達到了降低成本和提高蟲草素產(chǎn)量的目的。

魚蛋白胨為魚蛋白酶解或微生物發(fā)酵法而成的短肽鏈、小分子多肽(胨氮含量高)(小分子肽含量高于骨蛋白胨)和各種氨基酸等，及氨基氮的粉末狀產(chǎn)品，其中小分子肽含量高于骨蛋白胨，有較好的水溶性，易于微生物吸收，可為微生物發(fā)酵提供高含量優(yōu)質(zhì)有機氮源。蛹蟲草作為蟲生真菌，動物蛋白對其生長發(fā)育更為有利。所以本發(fā)明選用魚蛋白胨作為氮源，發(fā)現(xiàn)能有效提高蟲草素的產(chǎn)量，魚蛋白胨成本廉價且來源廣泛，作為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源可以大大降低生產(chǎn)成本，這對于菌株NS-810在蟲草素產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)方面具有重要的意義。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，添加無機氮源NH₄⁺對蟲草素的生成起促進作用。銨鹽是一種低廉的、效果很好的無機氮源，NH₄⁺被蛹蟲草細胞用來合成谷氨酰胺，谷氨酰胺在生物合成反應中充當?shù)墓w，也是核苷的間接前體，并生成核苷，而蟲草素是核苷的衍生物，這可能是發(fā)酵培養(yǎng)中添加NH₄⁺會提高蟲草素含量的原因。

本發(fā)明證明無機鹽在蛹蟲草的生長和蟲草菌素的產(chǎn)生過程中起著非常重要的作用，添加KH₂PO₄、MgSO₄·7H₂O均能較大的提高菌體生物量和蟲草菌素產(chǎn)量，其中，KH₂PO₄對蟲草菌素產(chǎn)量影響顯著，低濃度的KH₂PO₄優(yōu)于高濃度的KH₂PO₄，這可能是高濃度KH₂PO₄會造成細胞質(zhì)的滲透壓增加，從而抑制蛹蟲草分泌產(chǎn)生蟲草菌素；鎂是許多酶的激活劑而且它可影響基質(zhì)的氧化和蛋白質(zhì)的合成，這可能是MgSO₄·7H₂O促進菌體生長和產(chǎn)生蟲草素的原因。而添加NaCl作為無機鹽時則抑制菌體的生長和蟲草素的產(chǎn)生。

蠶蛹是蠶絲業(yè)的主要副產(chǎn)物，極具營養(yǎng)價值，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪酸、維生素(包括維生素A、維生素B2、維生素D及麥角甾醇等)及微量元素等。本試驗在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加蠶蛹粉作為生長因子，結(jié)果表明蠶蛹粉在蟲草菌素合成累積方面表現(xiàn)出了明顯優(yōu)勢，特別是對胞外蟲草菌素的產(chǎn)量影響最顯著。另外，蠶蛹中的油脂含量很高，占蠶蛹干質(zhì)量的25％-30％，蠶蛹粉的浸提液表面漂浮由少量的蠶蛹油，它既可以促進蛹蟲草菌絲體生長及蟲草素的分泌，又可以在深層發(fā)酵中起到消泡的作用。VB1作為生長因子對發(fā)酵液中蟲草菌素合成累積也有較好的促進作用。

本發(fā)明通過單因素和正交試驗確定了蛹蟲草菌株NS-810產(chǎn)蟲草素的最佳深層發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖25g/L，土豆100g/L，魚蛋白胨18g/L，(NH₄)₂SO₄0.8g/L，KH₂PO₄1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，蠶蛹粉5.0g/L，VB₁18mg/L，水1L。采用此培養(yǎng)基，蛹蟲草菌絲生物量約為31.93g/L，蛹蟲素的總產(chǎn)量高達1597.11mg/L，發(fā)酵原料來源廣泛、價格便宜，發(fā)酵液清澈、質(zhì)量穩(wěn)定，這對工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)蟲草菌素和優(yōu)質(zhì)菌絲體，提高經(jīng)濟效益有著重要的意義。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。