技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵應(yīng)用領(lǐng)域，涉及一種凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌液體、固態(tài)發(fā)酵豆類食品及其制備方法。
背景技術(shù)：
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近幾十年來，我國(guó)科學(xué)科技發(fā)展迅速，社會(huì)風(fēng)貌和人民的生活水平都大幅提高，人們對(duì)均衡全面的攝入營(yíng)養(yǎng)有了越來越清晰的認(rèn)識(shí)，對(duì)食物的需求早已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出滿足生存和味蕾的范疇，保健養(yǎng)生的概念深入人心，且漸漸成為了一種潮流和習(xí)慣。豆類制品作為一種歷史悠久的高蛋白食物，其中所含有的植物性蛋白相比于肉類奶類中的動(dòng)物性蛋白更適合于中國(guó)人的腸道，利于吸收，溫和養(yǎng)胃且營(yíng)養(yǎng)全面。但是國(guó)內(nèi)現(xiàn)有的豆制食品看似種類繁多，其實(shí)類型單一，大致可以概括為豆?jié){制品、各類豆干類制品和油炸制品，加工粗糙、營(yíng)養(yǎng)利用率低且部分食品還存在安全衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。
益生菌是一類對(duì)宿主有益的活性微生物，將益生菌應(yīng)用在食品生產(chǎn)中，其在營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、口感風(fēng)味和保健作用等方面的優(yōu)勢(shì)日益顯著。利用益生菌生產(chǎn)的各類功能性產(chǎn)品已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)，廣為人民喜愛和接受。
凝結(jié)芽孢桿菌是乳酸菌的一種，兼性厭氧。除了具有乳酸菌的所有特點(diǎn)外，還具有抗逆性強(qiáng)、耐高溫、易儲(chǔ)存等生物學(xué)特性。凝結(jié)芽孢桿菌在食品中的利用其實(shí)有著悠久的歷史，早在1972年，日本厚生省(mhlw)就證實(shí)b.coagulans可用于處方箋，同時(shí)凝結(jié)芽孢桿菌也被美國(guó)藥品食品管理局(fda)認(rèn)定為安全有效的可食用益生菌，是目前效果最為確切的一類益生菌。中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委發(fā)布2016年第6號(hào)《關(guān)于發(fā)酵乳桿菌cect5716等3個(gè)菌種的公告》中寫明：將凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)列入《可用于食品的菌種名單》。該菌種口服進(jìn)入消化系統(tǒng)后，會(huì)消耗游離氧進(jìn)行腸道繁殖，從而有利于厭氧微生物乳酸菌和雙歧桿菌的生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)腸道內(nèi)微生物菌群的平衡，提高機(jī)體的免疫力和抗病力，減少腸道疾病的發(fā)生。同時(shí)該菌在腸道繁殖的過程中還會(huì)分泌淀粉酶和蛋白酶，促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收；其產(chǎn)生的b族維生素、氨基酸、短鏈脂肪酸等物質(zhì)能增加小腸的蠕動(dòng)速度，從而改善腸道的消化功能，其大量產(chǎn)生的抑制有害菌的凝固素(coagulin)和l-乳酸等抑菌物質(zhì)可以有效抑制多種腸道有害菌的繁殖，調(diào)節(jié)腸道酸堿平衡，對(duì)胃腸道炎癥有一定的治療作用。
納豆芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌，適宜在中性或偏酸性環(huán)境中生存，其在胃酸下4h存活率為100％，同時(shí)具有強(qiáng)力的病原菌抑制能力，是各類益菌中對(duì)環(huán)境耐受力最好的菌種之一。利用納豆芽孢桿菌制作的食品，可抵抗胃酸等物質(zhì)的殺滅作用，進(jìn)入小腸，改變?nèi)梭w腸道菌叢生態(tài)，調(diào)節(jié)腸道菌群，幫助消化道機(jī)能正?；?，同時(shí)增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)。納豆芽孢桿菌次生代謝產(chǎn)物中含有多種抑菌物質(zhì)，比如桿菌肽、多粘菌素等，對(duì)食品中常見的污染菌和致病菌具有很強(qiáng)的抑菌效果。
利用納豆芽孢桿菌單菌發(fā)酵的納豆已經(jīng)成為現(xiàn)代人成熟的保健食品，但是由于納豆芽孢桿菌發(fā)酵期間產(chǎn)生的臭氨味，納豆在中國(guó)市場(chǎng)的推廣存在著極大的阻力。而凝結(jié)芽孢桿菌在發(fā)酵過程中恰好可以利用氨類物質(zhì)，利用凝結(jié)芽孢菌和納豆芽孢桿菌混合發(fā)酵工藝一方面保留了原料豆類中的一些活性成分，如多糖、膳食纖維、生物類黃酮等對(duì)機(jī)體有保健作用的物質(zhì)，同時(shí)產(chǎn)生特色風(fēng)味物質(zhì)，很好地祛除了納豆的特殊氨味和豆類食品存在的豆腥味，在保留產(chǎn)品原有營(yíng)養(yǎng)成分的基礎(chǔ)上改善產(chǎn)品的口味，使其口感更好、更易被人體吸收，促進(jìn)消化、調(diào)理腸道。同時(shí)混菌發(fā)酵由于兩種菌種的相互促進(jìn)作用，可以使最終產(chǎn)物獲得更高的益生菌數(shù)量與菌體活性，其產(chǎn)生的有益物質(zhì)也高于單菌發(fā)酵的食品，而且混菌發(fā)酵具有不易染雜菌、穩(wěn)定性高的特征，使得發(fā)酵生產(chǎn)在工藝控制上更簡(jiǎn)便易行。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明屬于功能性食品領(lǐng)域，目的在于利用凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌對(duì)豆類進(jìn)行發(fā)酵獲得一種益生菌功能性食品。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆類液態(tài)飲料，是以大豆和黑豆中的至少一種，或大豆和黑豆中的至少一種混合其他豆類作為發(fā)酵基質(zhì)，采用凝結(jié)芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵后獲得活菌型益生菌發(fā)酵豆類液體飲料；
進(jìn)一步地，經(jīng)加熱滅活處理即得到的芽孢型益生菌發(fā)酵豆類液體飲料；
進(jìn)一步地，所述液態(tài)飲料制備方法如下：
菌種活化：凝結(jié)芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌從甘油管出發(fā)，按接種量1％分別接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化培養(yǎng)基裝液量為20％，ph自然，培養(yǎng)溫度為36-38℃，220r/min，培養(yǎng)19-20h后，按10％的接種量再次轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行二次活化，活化時(shí)間20-22h后得二級(jí)種子液；
液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：將納豆芽孢桿菌二級(jí)種子液接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行通氣有氧發(fā)酵，通氣量1：0.3(以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示(v/v·min))，36-38℃下發(fā)酵12-24h后，向發(fā)酵罐中接種凝結(jié)芽孢桿菌二級(jí)種子液，36-38℃下不通氣發(fā)酵12-24h；
發(fā)酵液處理：發(fā)酵結(jié)束后即獲得活菌型益生菌混菌發(fā)酵豆類液體飲料；增加加熱滅活的過程后，獲得的即為芽孢型益生菌發(fā)酵豆類液態(tài)飲料；
所述活化培養(yǎng)基為：將黃豆、黑豆單獨(dú)或任意比例混合清洗后，每100ml水中添加5g上述豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次；121℃，20min進(jìn)行滅菌；
所述液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為：按活化培養(yǎng)基中黃豆與黑豆的比例進(jìn)行混合，并加入總豆質(zhì)量0-60％的其他豆類清洗后，每100ml水中添加5g上述豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次；121℃，20min進(jìn)行滅菌；
所述液態(tài)發(fā)酵中，凝結(jié)芽孢桿菌的接種量為106-108cfu/ml；
所述液態(tài)發(fā)酵中，納豆芽孢菌的接種量為106-108cfu/ml；
優(yōu)選的，所述液態(tài)發(fā)酵中凝結(jié)芽孢桿菌的接種量為1×107cfu/ml；
優(yōu)選的，所述液態(tài)發(fā)酵中納豆芽孢桿菌的接種量為1×107cfu/ml；
優(yōu)選的，所述液態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)溫度為37℃；
優(yōu)選的，所述液態(tài)混菌發(fā)酵時(shí)間為納豆芽孢桿菌發(fā)酵19h，凝結(jié)芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌混合發(fā)酵24；
優(yōu)選的，加熱滅活條件為90℃、10min。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供一種凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆類固體食品，是以大豆和黑豆中的至少一種，或大豆和黑豆中的至少一種混合其他豆類作為發(fā)酵基質(zhì)，采用凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵后，干燥處理即得到益生菌發(fā)酵豆類固體食品；
制備步驟如下：
菌種活化：凝結(jié)芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌從甘油管出發(fā)，按接種量1％分別接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化培養(yǎng)基裝液量為20％，220r/min，ph自然，培養(yǎng)溫度為36-38℃，培養(yǎng)時(shí)間19-20h，作為種子液；
固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)：將納豆芽孢桿菌種子液接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，用8層紗布封口，培養(yǎng)箱鼓風(fēng)，風(fēng)速0.3m/s，進(jìn)行有氧靜置發(fā)酵，36-38℃下固態(tài)發(fā)酵12-24h后，接種凝結(jié)芽孢桿菌種子液，36-38℃下無氧靜置固態(tài)發(fā)酵12-24h即得益生菌發(fā)酵豆類固態(tài)食品；
發(fā)酵結(jié)束后可直接包裝食用，也可真空冷凍干燥，制成口感更佳的保健食品；
所述活化培養(yǎng)基為：將黃豆和黑豆中的至少一種清洗后，每100ml水中添加5g上述豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次，121℃，20min進(jìn)行滅菌；
所述固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為：按活化培養(yǎng)基中黃豆與黑豆的比例進(jìn)行混合，并加入總豆質(zhì)量0-60％的其他豆類清洗后,按料水比1：1-1.5(質(zhì)量體積比)進(jìn)行混合，4℃下浸泡8-10h制得，121℃滅菌20min；
所述固態(tài)發(fā)酵中，凝結(jié)芽孢桿菌的接種量為106-108cfu/g；
所述固態(tài)發(fā)酵中，納豆芽孢桿菌的接種量為106-108cfu/g；
優(yōu)選的，所述固態(tài)發(fā)酵中凝結(jié)芽孢桿菌的接種量為5×107cfu/g；
優(yōu)選的，所述固態(tài)發(fā)酵中納豆芽孢桿菌的接種量為5×107cfu/g；
優(yōu)選的，所述固態(tài)發(fā)酵的培養(yǎng)溫度為37℃；
優(yōu)選的，所述固態(tài)混菌發(fā)酵時(shí)間為納豆芽孢桿菌發(fā)酵24h，凝結(jié)芽孢桿菌與納豆芽孢桿菌混合發(fā)酵24h；
優(yōu)選的，所述固態(tài)發(fā)酵真空冷凍干燥條件為-70℃預(yù)凍6h后進(jìn)行真空冷凍干燥24h，至含水量不大于5％。
有益效果：
1、本發(fā)明采用豆類作為原料生產(chǎn)凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發(fā)酵的益生菌食品。經(jīng)過益生菌發(fā)酵的豆類產(chǎn)品可以產(chǎn)生多種酸類小分子物質(zhì)如l-乳酸，同時(shí)分解豆類中不易消化的成分，這賦予產(chǎn)品特有的酸香味、色澤和口感，使得食品的感官特征得到改善，凝結(jié)芽孢桿菌可以祛除納豆臭氨味和豆腥味。同時(shí)，多種酸類小分子物質(zhì)、呈香呈味物質(zhì)的存在賦予了發(fā)酵食品良好的口感，乳酸等同時(shí)也是優(yōu)質(zhì)的防腐劑，所以發(fā)酵得到的原味型固體食品和液體飲料都無需再添加各類調(diào)味劑和防腐劑成分。
2、經(jīng)益生菌凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵后的豆類食品中活性成分含量顯著提高，總黃酮和總酚類物質(zhì)含量顯著提高，如大豆苷元、染料木素、生育酚、皂甙等，這些物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性，有抑制不飽和脂肪酸的能力，可以防止異丙基苯過氧化物導(dǎo)致的人體內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞損傷，可以強(qiáng)化血管壁、促進(jìn)腸胃消化、降低血脂、增加身體抵抗力，防止動(dòng)脈硬化和血栓的形成，預(yù)防心血管疾病、改善骨質(zhì)疏松及預(yù)防癌癥；同時(shí)對(duì)肥胖癥也有相當(dāng)?shù)挠幸孀饔?；納豆菌產(chǎn)生的堿性蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、脂酶、彈性蛋白酶、植酸酶等多種酶系、發(fā)酵大豆中的低聚糖和纖維素等活性物質(zhì)和凝結(jié)素可以幫助改善腸道微生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)腸道消化吸收功能，具有調(diào)整腸道功能幫助消化的強(qiáng)大功效；納豆芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的納豆激酶具有溶栓作用，同時(shí)還可以促進(jìn)維生素k2的吸收，大大提高人體對(duì)鈣離子的吸收，維持骨吸收和骨形成的平衡作用，防止骨質(zhì)疏松，具有多種保健功效，經(jīng)常食用可以很大程度上改善人體健康，預(yù)防疾病。
3、采用混菌發(fā)酵的豆類食品不僅口感和營(yíng)養(yǎng)成分優(yōu)于單菌發(fā)酵，凝結(jié)芽孢桿菌在繁殖過程中可以利用氨作為氮源，消耗掉了傳統(tǒng)納豆生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的氨氣，使得產(chǎn)品沒有了傳統(tǒng)納豆的臭氨味和豆類食品的豆腥味，氨氣釋放量低于10mg/kg；同時(shí)其活菌數(shù)也高于單菌發(fā)酵的產(chǎn)品。經(jīng)過納豆芽孢桿菌發(fā)酵之后，培養(yǎng)基中氧氣含量降低，極大地提高了凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢產(chǎn)量，使得活菌型食品擁有了更好的穩(wěn)定性，更多活的益生菌進(jìn)入人體腸道。經(jīng)過加熱滅活處理的發(fā)酵食品中，沒有了菌體形態(tài)的活菌，使得產(chǎn)品具有更長(zhǎng)的保質(zhì)期限，同時(shí)保留的益生菌芽孢在進(jìn)入人體腸道后會(huì)重新萌發(fā)為有益健康的腸道益生菌，幫助改善腸道環(huán)境，助力機(jī)體健康。
具體實(shí)施方式：
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明并不限于以下具體實(shí)施例子。
實(shí)施例1一種凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵豆類飲料
(1)最佳接種量的確定
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏編號(hào)為cgmccno.4731。
所選用凝結(jié)芽孢桿菌為凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏編號(hào)為cgmccno.5233。
選定豆類組合6組：
組合1：100％黃豆；組合2：100％黑豆；組合3：50％黃豆+50％黑豆；組合4：40％黃豆+混合豆類60％，其中混合豆類為綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合5：40％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類為綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合6：20％黃豆+20％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類為紅豆、綠豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；
活化培養(yǎng)基為：按上述各豆類組合中的黃豆、黑豆比例取黃豆和黑豆混合清洗，即組合1為100％黃豆；組合2為100％黑豆；組合3為50％黃豆+50％黑豆；組合4為100％黃豆；組合5為100％黑豆；組合6為50％黃豆+50％黑豆；每100ml水中添加5g豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次，121℃，20min進(jìn)行滅菌。
發(fā)酵培養(yǎng)基為：將選中的組合豆類清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次，121℃，20min進(jìn)行滅菌。
凝結(jié)芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發(fā)，按接種量1％分別接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化培養(yǎng)基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間19h，按10％的接種量再次轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基，同樣條件進(jìn)行二次活化，活化時(shí)間20h后得二級(jí)種子液；
將納豆芽孢桿菌二級(jí)種子液接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行通氣有氧發(fā)酵，通氣量1：0.3(以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示(v/v·min))，37℃下發(fā)酵19h后，接入凝結(jié)芽孢桿菌二級(jí)種子液，37℃下無氧發(fā)酵24h。發(fā)酵結(jié)束后，即獲得活菌型凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵豆類液體飲料。
接菌量分別為：
1.凝結(jié)芽孢桿菌5×106cfu/ml，納豆芽孢桿菌5×106cfu/ml；
2.凝結(jié)芽孢桿菌1×107cfu/ml，納豆芽孢桿菌1×107cfu/ml；
3.凝結(jié)芽孢桿菌5×107cfu/ml，納豆芽孢桿菌5×107cfu/ml；
4.凝結(jié)芽孢桿菌1×108cfu/ml，納豆芽孢桿菌1×108cfu/ml；
發(fā)酵結(jié)束后對(duì)所得益生菌食品中的益生菌總活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
表1豆類發(fā)酵飲料中凝結(jié)芽孢桿菌活菌及芽孢數(shù)
表2豆類發(fā)酵飲料中納豆芽孢桿菌活菌數(shù)
結(jié)果如表1、表2所示，豆類液體發(fā)酵飲料中，幾種不同組合進(jìn)行發(fā)酵，菌體接種量為凝結(jié)芽孢桿菌1×107cfu/g，納豆芽孢桿菌1×107cfu/g時(shí)，兩種益生菌的活菌數(shù)達(dá)到最高，此時(shí)組合2活菌數(shù)達(dá)到了凝結(jié)芽孢桿菌活菌1.43×109cfu/g，芽孢1.24×109cfu/g，納豆芽孢桿菌活菌1.45×109cfu/g，芽孢1.17×109cfu/g。
(2)最佳發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏編號(hào)為cgmccno.4731。
所選用凝結(jié)芽孢桿菌為凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏編號(hào)為cgmccno.5233。
活化培養(yǎng)基為：取黃豆清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次，121℃，20min進(jìn)行滅菌。
發(fā)酵培養(yǎng)基為：將黃豆清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次，121℃，20min進(jìn)行滅菌。
凝結(jié)芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發(fā)，按接種量1％分別接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化培養(yǎng)基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間19h，按10％的接種量再次轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基,同等條件進(jìn)行二次活化，活化時(shí)間20h后得二級(jí)種子液；
將納豆芽孢桿菌二級(jí)種子液接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行通氣有氧發(fā)酵，通氣量1∶0.3(以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示(v/v·min))37℃下發(fā)酵后,接種凝結(jié)芽孢桿菌二級(jí)種子液，37℃下無氧發(fā)酵。發(fā)酵時(shí)間為1.納豆芽孢桿菌16h，接入凝結(jié)芽孢桿菌后混菌發(fā)酵20h；
2.納豆芽孢桿菌19h，接入凝結(jié)芽孢桿菌后混菌發(fā)酵20h；
3.納豆芽孢桿菌16h，接入凝結(jié)芽孢桿菌后混菌發(fā)酵24h；
4.納豆芽孢桿菌19h，接入凝結(jié)芽孢桿菌后混菌發(fā)酵24h。
發(fā)酵結(jié)束后，即獲得活菌型凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆類液體飲料。
表3液態(tài)發(fā)酵豆類飲料中凝結(jié)芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌的活菌數(shù)
結(jié)果為：凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵豆類食品最佳培養(yǎng)時(shí)間為納豆芽孢桿菌19h，接入凝結(jié)芽孢桿菌后混菌發(fā)酵24h，測(cè)得凝結(jié)芽孢桿菌總活菌數(shù)為1.50×109cfu/g，納豆芽孢桿菌活菌數(shù)為7.93×108cfu/g。
(3)液體發(fā)酵前后活性成分變化
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏編號(hào)為cgmccno.4731。
所選用凝結(jié)芽孢桿菌為凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏編號(hào)為cgmccno.5233。
選定豆類組合6組：組合1：100％黃豆；組合2：100％黑豆；組合3：50％黃豆+50％黑豆；組合4：40％黃豆+混合豆類60％，其中混合豆類為綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合5：40％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類為綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合6：20％黃豆+20％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類為紅豆、綠豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合。
活化培養(yǎng)基為：按照上述豆類組合中黃豆和黑豆的比例取黃豆和黑豆混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次，121℃，20min進(jìn)行滅菌。
發(fā)酵培養(yǎng)基為：按上述豆類組合選中豆類清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次，121℃，20min進(jìn)行滅菌。
凝結(jié)芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發(fā)，按接種量1％分別接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化培養(yǎng)基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間19h，按10％的接種量再次轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行二次活化，活化時(shí)間20h后得二級(jí)種子液；
按1×107cfu/ml，將納豆芽孢桿菌二級(jí)種子液接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行通氣有氧發(fā)酵，通氣量1∶0.3(以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示(v/v·min))37℃下發(fā)酵19h后，按1×107cfu/ml接種凝結(jié)芽孢桿菌二級(jí)種子液，37℃下無氧發(fā)酵24h。
發(fā)酵結(jié)束后，即獲得活菌型凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆類液體飲料。
部分產(chǎn)品90℃滅菌10min得滅菌型產(chǎn)品；
利用gb/t23788-2009法測(cè)定大豆異黃酮含量；利用gb/t12143.2-89法測(cè)定氨基態(tài)氮的含量；利用高效氣相法測(cè)定乳酸含量；利用福林酚反應(yīng)測(cè)定總酚類含量；利用活氧指數(shù)法(orac)測(cè)定抗氧化物含量；利用纖維蛋白平板法測(cè)定納豆激酶的活性。
表4液態(tài)發(fā)酵食品中活性物質(zhì)的測(cè)定
從圖表中可以看出，發(fā)酵產(chǎn)物中活性物質(zhì)如大豆苷元、染料木素、抗氧化物質(zhì)、總酚類和氨基態(tài)氮等物質(zhì)的含量顯著增加，這些物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性，可以強(qiáng)化血管壁、促進(jìn)腸胃消化、降低血脂、增加身體抵抗力，并可防止動(dòng)脈硬化和血栓的形成，極大地有利于機(jī)體的健康。
(4)液體混菌發(fā)酵飲料氨氣釋放量與傳統(tǒng)發(fā)酵納豆氨氣釋放量的對(duì)比
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏編號(hào)為cgmccno.4731。
所選用凝結(jié)芽孢桿菌為凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏編號(hào)為cgmccno.5233。
選定豆類組合6組：組合1：100％黃豆；組合2：100％黑豆；組合3：50％黃豆+50％黑豆；組合4：40％黃豆+混合豆類60％，其中混合豆類為綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合5：40％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類為綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合6：20％黃豆+20％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類為紅豆、綠豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合。
活化培養(yǎng)基為：按照上述豆類組合中的比例取黃豆和黑豆混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次，121℃，20min進(jìn)行滅菌。
發(fā)酵培養(yǎng)基為：將選中豆類清洗后，每100ml水中添加5g等量混合后的豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，121℃，20min進(jìn)行滅菌。
凝結(jié)芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發(fā)，按接種量1％分別接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化培養(yǎng)基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間19h，按10％的接種量再次轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行二次活化，活化時(shí)間20h后得二級(jí)種子液；
按1×107cfu/ml，將納豆芽孢桿菌二級(jí)種子液接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行通氣有氧發(fā)酵，通氣量1：0.3(以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示(v/v·min)，37℃下發(fā)酵19h后，按1×107cfu/ml接種凝結(jié)芽孢桿菌二級(jí)種子，37℃下無氧發(fā)酵24h。發(fā)酵結(jié)束后，即獲得活菌型凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆類液體飲料。
采用上述相同的發(fā)酵方法方法，將納豆芽孢桿菌從甘油管出發(fā)，按接種量1％分別接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化培養(yǎng)基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間19h，按10％的接種量再次轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行二次活化，活化時(shí)間20h后得二級(jí)種子液；
按1×107cfu/ml，將二級(jí)納豆芽孢桿菌種子液接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行通氣有氧發(fā)酵，通氣量1：0.3(以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示(v/v·min),37℃下發(fā)酵19h后，繼續(xù)無氧發(fā)酵24h。發(fā)酵結(jié)束后，即獲得單菌發(fā)酵液體狀態(tài)納豆飲品，與混菌發(fā)酵進(jìn)行對(duì)照。
利用揮發(fā)性鹽基氮的方法測(cè)定混菌發(fā)酵豆類飲料與單菌發(fā)酵納豆飲品中的氨，即臭氨味來源，進(jìn)行對(duì)比。
表5液體混菌發(fā)酵飲料氨氣釋放量與傳統(tǒng)發(fā)酵納豆氨氣釋放量的對(duì)比
綜上可以看出，經(jīng)凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發(fā)酵后的豆類液體飲料，菌體接種量為凝結(jié)芽孢桿菌1×107cfu/g，納豆芽孢桿菌1×107cfu/g時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最高，凝結(jié)芽孢桿菌活菌1.43×109cfu/g，芽孢1.24×109cfu/g，納豆芽孢桿菌活菌1.45×109cfu/g，芽孢1.17×109cfu/g；且發(fā)酵產(chǎn)物中活性物質(zhì)如大豆苷元、染料木素、抗氧化物質(zhì)、總酚類、納豆激酶和氨基態(tài)氮等物質(zhì)的含量顯著增加，這些物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性，可以強(qiáng)化血管壁、促進(jìn)腸胃消化、降低血脂、增加身體抵抗力，并可防止動(dòng)脈硬化和血栓的形成?；罹惋嬃线€具有調(diào)節(jié)腸道菌群，優(yōu)化腸道微生態(tài)的功效，而滅菌型的飲料具有保質(zhì)期更長(zhǎng)，儲(chǔ)存穩(wěn)定性更好的特點(diǎn)；同時(shí)混菌發(fā)酵液態(tài)飲料幾乎不含有構(gòu)成臭氨味的氨氣，口感舒適，利于市場(chǎng)的推廣。
實(shí)施例2一種凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵豆類食品
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌枯草為枯草芽孢桿菌亞種(bacillussubtilissubsp.subtilis)，cgmcc菌種編號(hào)為1.2163。
所選用凝結(jié)芽孢桿菌為凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)，cgmcc菌種編號(hào)為1.2407。
活化培養(yǎng)基為：取黃豆和黑豆等質(zhì)量混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次，121℃，20min進(jìn)行滅菌。
發(fā)酵培養(yǎng)基為：按黃豆30％，黑豆30％，其他豆類40％的比例取豆清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次；其他豆類為紅豆、綠豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合，121℃，20min進(jìn)行滅菌。
凝結(jié)芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發(fā)，按接種量1％分別接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化培養(yǎng)基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養(yǎng)溫度為36℃，培養(yǎng)時(shí)間20h，按10％的接種量再次轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基同等條件進(jìn)行二次活化，活化時(shí)間22h后得二級(jí)種子液；
按照1×107cfu/ml，將二級(jí)納豆芽孢桿菌種子液接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中通氣有氧發(fā)酵12h，38℃，通氣量1：0.3(以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示(v/v·min))，之后接種凝結(jié)芽孢桿菌二級(jí)種子液，接種量1×107cfu/ml，36℃下無氧發(fā)酵12h；
發(fā)酵結(jié)束后，即獲得活菌型凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆類液體飲料。
測(cè)定所得飲料氨氣釋放量，即臭氨味來源，用同樣方法制備納豆芽孢桿菌單菌發(fā)酵液體飲品，并進(jìn)行對(duì)照。
納豆芽孢桿菌單菌發(fā)酵液體飲品方法為：納豆芽孢桿菌從甘油管出發(fā)，按接種量1％分別接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化培養(yǎng)基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養(yǎng)溫度為36℃，培養(yǎng)時(shí)間20h，按10％的接種量再次轉(zhuǎn)接入活化培養(yǎng)基同等條件進(jìn)行二次活化，活化時(shí)間22h后得二級(jí)種子液；
按照1×107cfu/ml，將納豆芽孢桿菌二級(jí)種子液接入液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中通氣有氧發(fā)酵12h，38℃，通氣量1：0.3(以每分鐘內(nèi)通過單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來表示(v/v·min))，之后36℃下無氧發(fā)酵12h；
利用揮發(fā)性鹽基氮的方法測(cè)定產(chǎn)品中的氨。
表6混菌發(fā)酵豆類飲料氨氣釋放量與傳統(tǒng)發(fā)酵單菌發(fā)酵氨氣釋放量的對(duì)比
實(shí)施例3凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵豆類食品工藝
(1)最佳接種量
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏編號(hào)為cgmccno.4731。
所選用凝結(jié)芽孢桿菌為凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏編號(hào)為cgmccno.5233。
選定豆類組合6組：組合1：100％黃豆；組合2：100％黑豆；組合3：50％黃豆+50％黑豆；組合4：40％黃豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合5：40％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合6：20％黃豆+20％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括紅豆、綠豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合。
活化培養(yǎng)基為：按上述豆類組合中的比例取黃豆和黑豆混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次，20min進(jìn)行滅菌。
固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基為：將選中的豆類組合混合清洗后,按料水比1：1.5(質(zhì)量體積比)進(jìn)行混合，4℃下浸泡8h，121℃滅菌20min。
凝結(jié)芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發(fā)，按接種量1％分別接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化培養(yǎng)基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間19h得種子液；
將納豆芽孢桿菌種子液接入固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，用8層紗布封口放置在培養(yǎng)箱中，鼓風(fēng)進(jìn)行風(fēng)速：0.3m/s，有氧發(fā)酵，37℃下發(fā)酵24h后接種凝結(jié)芽孢桿菌種子液，37℃下無氧發(fā)酵24h。發(fā)酵結(jié)束后，即獲得活菌型凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發(fā)酵豆類固態(tài)食品。
接菌量分別為：1.凝結(jié)芽孢桿菌5×106cfu/g，納豆芽孢桿菌5×106cfu/g；
2.凝結(jié)芽孢桿菌1×107cfu/g，納豆芽孢桿菌1×107cfu/g；
3.凝結(jié)芽孢桿菌5×107cfu/g，納豆芽孢桿菌5×107cfu/g；
4.凝結(jié)芽孢桿菌1×108cfu/g，納豆芽孢桿菌1×108cfu/g；
發(fā)酵后，對(duì)所得益生菌固態(tài)食品中的益生菌菌總活菌數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
表7豆類發(fā)酵食品中凝結(jié)芽孢桿菌總活菌及芽孢數(shù)
表8豆類發(fā)酵食品中納豆芽孢桿菌總活菌及芽孢數(shù)
結(jié)果如表7、8所示，豆類固態(tài)發(fā)酵食品中，幾種不同組合進(jìn)行發(fā)酵，菌體接種量為凝結(jié)芽孢桿菌5×107cfu/g，納豆芽孢桿菌5×107cfu/g時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最高，且雖然各組合活菌數(shù)有小幅度差異但都達(dá)到了較高的9次方，其中組合1活菌數(shù)達(dá)到了凝結(jié)芽孢桿菌4.37×109cfu/g，納豆芽孢桿菌4.23×109cfu/g。
(2)固體發(fā)酵最佳培養(yǎng)時(shí)間
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏編號(hào)為cgmccno.4731。
所選用凝結(jié)芽孢桿菌為凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏編號(hào)為cgmccno.5233。
活化培養(yǎng)基為：取黃豆清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次，20min進(jìn)行滅菌。
固態(tài)培養(yǎng)基為：將黃豆按料水比1：1.5(質(zhì)量體積比)進(jìn)行混合，4℃下浸泡8h，121℃滅菌20min。
凝結(jié)芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發(fā)，按接種量1％分別接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化培養(yǎng)基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間19h得種子液；
按5×107cfu/g，將納豆芽孢桿菌種子液接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，用8層紗布封口放置在培養(yǎng)箱中，鼓風(fēng)風(fēng)速：0.3m/s，進(jìn)行有氧發(fā)酵，37℃下發(fā)酵一段時(shí)間后，按5×107cfu/g接種凝結(jié)芽孢桿菌種子液，37℃下無氧發(fā)酵。
發(fā)酵結(jié)束后，即獲得活菌型發(fā)酵豆類食品。
發(fā)酵時(shí)間為1.納豆芽孢桿菌19h，接凝結(jié)芽孢桿菌后混菌發(fā)酵20h；
2.納豆芽孢桿菌24h，接凝結(jié)芽孢桿菌后混菌發(fā)酵20h；
3.納豆芽孢桿菌19h，接凝結(jié)芽孢桿菌后混菌發(fā)酵24h；
4.納豆芽孢桿菌24h，接凝結(jié)芽孢桿菌后混菌發(fā)酵24h。
發(fā)酵結(jié)束后，分別對(duì)固態(tài)發(fā)酵后的產(chǎn)物進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。
表9固態(tài)發(fā)酵豆類食品中凝結(jié)芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌的活菌數(shù)
結(jié)果為：混合益生菌發(fā)酵豆類食品最佳培養(yǎng)時(shí)間為納豆芽孢桿菌24h，凝結(jié)芽孢桿菌24h，測(cè)得凝結(jié)芽孢桿菌總活菌數(shù)為1.04×1010cfu/g，納豆芽孢桿菌總活菌數(shù)7.98×109cfu/g。
(3)固體發(fā)酵前后活性成分變化
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏編號(hào)為cgmccno.4731。
所選用凝結(jié)芽孢桿菌為凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏編號(hào)為cgmccno.5233。
選定豆類組合6組：組合1：100％黃豆；組合2：100％黑豆；組合3：50％黃豆+50％黑豆；組合4：40％黃豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合5：40％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合6：20％黃豆+20％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括紅豆、綠豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合。
活化培養(yǎng)基為：按上述豆類組合中黃豆和黑豆的比例混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次，20min進(jìn)行滅菌。
固態(tài)培養(yǎng)基為：將選中的豆類組合混合清洗后,按料水比1：1.5(質(zhì)量體積比)進(jìn)行混合，4℃下浸泡8h，121℃滅菌20min。
凝結(jié)芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發(fā)，按接種量1％分別接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化培養(yǎng)基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間19h得種子液；
按5×107cfu/g，將納豆芽孢桿菌種子液接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，用8層紗布封口放置在培養(yǎng)箱中，鼓風(fēng)風(fēng)速：0.3m/s，進(jìn)行有氧發(fā)酵，37℃下發(fā)酵24h后，按5×107cfu/g接種凝結(jié)芽孢桿菌種子液，37℃下無氧發(fā)酵24h。
發(fā)酵結(jié)束后，即獲得活菌型發(fā)酵豆類食品。測(cè)定固態(tài)發(fā)酵物中各活性成分含量的變化。
將固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物-70℃預(yù)凍6h后進(jìn)行真空冷凍干燥24h，至含水量不大于5％得凝結(jié)豆類固態(tài)發(fā)酵食品。
利用gb/t23788-2009法測(cè)定大豆異黃酮含量；利用gb/t12143.2-89法測(cè)定氨基態(tài)氮的含量；利用高效氣相法測(cè)定乳酸含量；利用福林酚反應(yīng)測(cè)定總酚類含量；利用活氧指數(shù)法(orac)測(cè)定抗氧化物含量；利用纖維蛋白平板法測(cè)定納豆激酶的活性。
表10固態(tài)發(fā)酵食品中活性物質(zhì)的測(cè)定
從圖表中可以看出，發(fā)酵產(chǎn)物中活性物質(zhì)如大豆苷元、染料木素、抗氧化物質(zhì)、總酚類、納豆激酶和氨基態(tài)氮等物質(zhì)的含量顯著增加，這些物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性，可以強(qiáng)化血管壁、促進(jìn)腸胃消化、降低血脂、增加身體抵抗力，并可防止動(dòng)脈硬化和血栓的形成，極大地有利于機(jī)體的健康。
(4)固態(tài)混菌發(fā)酵豆類食品中氨氣釋放量與傳統(tǒng)發(fā)酵納豆氨氣釋放量的對(duì)比
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)tk-1，保藏編號(hào)為cgmccno.4731。
所選用凝結(jié)芽孢桿菌為凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)tq33，保藏編號(hào)為cgmccno.5233。
選定豆類組合6組：組合1：100％黃豆；組合2：100％黑豆；組合3：50％黃豆+50％黑豆；組合4：40％黃豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合5：40％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括綠豆、紅豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；組合6：20％黃豆+20％黑豆+混合豆類60％，其中混合豆類包括紅豆、綠豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合。
活化培養(yǎng)基為：按上述豆類組合中的比例取黃豆和黑豆混合清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次，20min進(jìn)行滅菌。
固態(tài)培養(yǎng)基為：將選中的豆類組合混合清洗后,按料水比1：1.5(質(zhì)量體積比)進(jìn)行混合，4℃下浸泡8h，121℃滅菌20min。
凝結(jié)芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發(fā)，按接種量1％分別接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化培養(yǎng)基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間19h得種子液；
按5×107cfu/g，將納豆芽孢桿菌種子液接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行，用8層紗布封口放置在培養(yǎng)箱中，鼓風(fēng)風(fēng)速：0.3m/s，進(jìn)行有氧發(fā)酵，37℃下發(fā)酵24h后，按5×107cfu/g接種凝結(jié)芽孢桿菌種子液，37℃下無氧發(fā)酵24h。
發(fā)酵結(jié)束后，即獲得活菌型發(fā)酵豆類食品。將固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物-70℃預(yù)凍6h后進(jìn)行真空冷凍干燥24h，至含水量不大于5％得凝結(jié)豆固態(tài)發(fā)酵食品。
其他條件均相同，僅將凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌混菌發(fā)酵改為納豆芽孢桿菌單菌發(fā)酵，發(fā)酵階段接菌量為5×107cfu/g，發(fā)酵階段總時(shí)長(zhǎng)相同，即24h+24h＝48h；
發(fā)酵結(jié)束后，即獲得單菌發(fā)酵傳統(tǒng)納豆食品，與混菌發(fā)酵產(chǎn)品做對(duì)比。
利用揮發(fā)性鹽基氮的方法測(cè)定混菌發(fā)酵豆類食品與單菌發(fā)酵納豆中的氨，即臭氨味來源，進(jìn)行對(duì)比。
表11固態(tài)發(fā)酵豆類食品氨氣釋放量與傳統(tǒng)發(fā)酵納豆氨氣釋放量的對(duì)比
綜上可以看出，經(jīng)凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌發(fā)酵后的豆類固態(tài)食品，菌體接種量為凝結(jié)芽孢桿菌5×107cfu/g，納豆芽孢桿菌5×107cfu/g時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到最高，達(dá)到了凝結(jié)芽孢桿菌4.37×109cfu/g，納豆芽孢桿菌4.23×109cfu/g；且發(fā)酵產(chǎn)物中活性物質(zhì)如大豆苷元、染料木素、抗氧化物質(zhì)、總酚類和氨基態(tài)氮等物質(zhì)的含量都有所增加，對(duì)人體有著極大的益處；混菌發(fā)酵的豆類食品與傳統(tǒng)納豆相比，沒有了令人不愉快的特殊氨味，使人們更容易接受，利于市場(chǎng)的推廣；同時(shí)固態(tài)食品，不論是真空包裝的濕豆還是經(jīng)干燥加工的干豆食品，都具有加工操作簡(jiǎn)單、成本低、儲(chǔ)藏和運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)，有利于降低成本。
實(shí)施例4一種凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵豆類食品
所選用納豆芽孢桿菌，即枯草芽孢桿菌枯草為枯草芽孢桿菌亞種(bacillussubtilissubsp.subtilis)，cgmcc菌種編號(hào)為1.2163。
所選用凝結(jié)芽孢桿菌為凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)，cgmcc菌種編號(hào)為1.2407。
活化培養(yǎng)基為：取等量黃豆和黑豆清洗后，每100ml水中添加5g豆子打漿均質(zhì)，均質(zhì)溫度65℃、壓力20.0mpa，均質(zhì)一次，121℃，20min進(jìn)行滅菌。
固態(tài)培養(yǎng)基為：按黃豆30％，黑豆30％，其他豆類40％的比例取豆清洗后，將豆子按料水比1：1(質(zhì)量體積比)進(jìn)行混合，4℃下浸泡10h，121℃滅菌20min；其中混合豆類包括紅豆、綠豆、白蕓豆、花蕓豆、鷹嘴豆和小扁豆等量混合；
凝結(jié)芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌從甘油管出發(fā)，按接種量1％分別接入活化培養(yǎng)基進(jìn)行活化，活化培養(yǎng)基三角瓶裝液量為20％，搖床220r/min，ph自然，培養(yǎng)溫度為36℃，培養(yǎng)時(shí)間20h得種子液；
按5×107cfu/g的接種量，將納豆芽孢桿菌種子液接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中用8層紗布封口放置在培養(yǎng)箱中，鼓風(fēng)風(fēng)速：0.3m/s，進(jìn)行有氧發(fā)酵，36℃下發(fā)酵12h后，按5×107cfu/g接種凝結(jié)芽孢桿菌種子液進(jìn)行混菌發(fā)酵，38℃下無氧發(fā)酵12h。發(fā)酵結(jié)束后，即獲得活菌型發(fā)酵豆類食品。
其他條件均相同，僅將凝結(jié)芽孢桿菌混合納豆芽孢桿菌混菌發(fā)酵改為納豆芽孢桿菌單菌發(fā)酵，發(fā)酵階段接菌量為5×107cfu/g，發(fā)酵階段總時(shí)長(zhǎng)相同，即12h+12h＝24h；
發(fā)酵結(jié)束后，即獲得單菌發(fā)酵傳統(tǒng)納豆食品，測(cè)定所得發(fā)酵豆類食品氨氣釋放量，即臭氨味來源，與混菌發(fā)酵產(chǎn)品做對(duì)比。
利用揮發(fā)性鹽基氮的方法測(cè)定氨。
表13混菌發(fā)酵豆類食品氨氣釋放量與傳統(tǒng)單菌發(fā)酵納豆氨氣釋放量的對(duì)比
上述參照實(shí)施例對(duì)該益生菌發(fā)酵豆類食品及其制備方法進(jìn)行的詳細(xì)描述，是說明性的而不是限定性的，可按照所限定范圍列舉出若干個(gè)實(shí)施例，因此在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的變化和修改，應(yīng)屬本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。