本發(fā)明屬于木質(zhì)纖維素酶解技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種以非離子表面活性劑聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作為酶解助劑，提高木質(zhì)纖維素酶解糖化得率的方法。

背景技術(shù)：

石油資源日益枯竭，環(huán)境問題日益突出，利用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)生物乙醇和化學(xué)品的研究成為近年來的研究熱點。由于木質(zhì)纖維素具有來源豐富、價格低廉、可再生等特點，為避免與人爭糧，木質(zhì)纖維素將成為生物乙醇生產(chǎn)最具潛力的原料。木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇通常包括預(yù)處理、酶解、發(fā)酵、蒸餾等工藝。但目前該工藝面臨著眾多的瓶頸問題，如預(yù)處理成本高、酶解效率低、纖維素酶利用效率低等，導(dǎo)致了生物乙醇的總生產(chǎn)成本高，制約著生物乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)。

為了達到較高的葡萄糖轉(zhuǎn)化率，先前的學(xué)者們發(fā)現(xiàn)通過添加表面活性劑可以有效地增強纖維素的水解，降低纖維素酶的用量。Castanon和Wilke通過添加Tween 80將舊報紙48h的酶解轉(zhuǎn)化率提高了14％(Eriksson et al.,2002)。Tween 20的添加可以將微晶纖維素的酶解轉(zhuǎn)化率提高35％(Ooshima et al.,1986b)。牛血清蛋白的添加可以將預(yù)處理后的玉米秸稈72h酶解效率從82％提高到92％，同時降低了β‐糖苷酶的用量(Yang&Wyman，2006)，雖然目前添加劑的使用可以降低纖維素酶的用量，提高酶解效率，但是距離實際的工業(yè)化生產(chǎn)目標仍然有一定的距離，尋找更加高效清潔的表面活性劑是研究者們的一個重要目標。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服木質(zhì)纖維素酶解工藝現(xiàn)有技術(shù)所存在的酶解效率低、可發(fā)酵糖濃度低、生產(chǎn)成本高等缺點，本發(fā)明提供了用重均分子量為2500‐100000的PVP作為酶解助劑顯著提高木質(zhì)纖維素酶解糖化得率的方法。

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作為一種合成水溶性高分子化合物，具有水溶性高分子化合物的一般性質(zhì)，膠體保護作用、成膜性、粘結(jié)性、吸濕性、增溶或凝聚作用。聚乙烯基吡咯烷酮作為高分子表面活性劑，在不同的分散體系中，可作為分散劑、乳化劑、增稠劑、流平劑、粒度調(diào)節(jié)劑、抗再沉淀劑、凝聚劑、助溶劑和洗滌劑。聚乙烯吡咯烷酮優(yōu)異的溶解性能及生理相容性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、食品加工、日用化妝品、洗滌劑等等。但是其用作木質(zhì)纖維素酶解糖化的促進劑卻未見研究和報道。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)用重均分子量為2500‐100000的PVP作為酶解助劑，可以顯著的提高木質(zhì)纖維素酶解糖化得率。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，將預(yù)處理液與木質(zhì)纖維素底物直接加緩沖液稀釋酶解糖化的方法，既可以省去木質(zhì)纖維素底物與預(yù)處理液分離的工藝，也可以回收預(yù)處理液中的單糖，實現(xiàn)木質(zhì)纖維素資源的綜合利用。

根據(jù)木質(zhì)纖維素原料和預(yù)處理條件的不同，一般在預(yù)處理液中殘留有酶解和發(fā)酵的抑制劑，酚類化合物就是其中一種，而PVP能與特定多酚化合物(如單寧)形成絡(luò)合物，減緩其對酶解和發(fā)酵的抑制作用，因而可以省去木質(zhì)纖維素底物與預(yù)處理液分離的傳統(tǒng)步驟，節(jié)約水資源，簡化操作。PVP對于木質(zhì)纖維素酶解糖化的促進有利于降低纖維素乙醇的生產(chǎn)成本，有助于推動纖維素乙醇的工業(yè)化。

本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)：

聚乙烯吡咯烷酮提高木質(zhì)纖維素酶解糖化得率的方法：將木質(zhì)纖維素或預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素加入緩沖溶液中配置成酶解液，或者是將木質(zhì)纖維素連同相應(yīng)的預(yù)處理液加入緩沖溶液中配置成酶解液，再加入PVP和纖維素酶，加熱反至40～60℃反應(yīng)，得到木質(zhì)纖維素的糖化水解液；所述PVP的重均分子量為2500‐100000，所述PVP與木質(zhì)纖維素干重的質(zhì)量比為0.2‐25：100。

為進一步實現(xiàn)本發(fā)明目的，優(yōu)選地，所述緩沖溶液為醋酸‐醋酸鈉、檸檬酸‐檸檬酸鈉和磷酸鹽緩沖液中至少一種。緩沖液的作用主要是為了保證酶解液的pH在酶解前后沒有太大的變化，同時控制一定的離子強度，保證纖維素酶能有較高的活性。

優(yōu)選地，所述緩沖液的pH為4.0～6.5，離子強度為25～400mmol/L。

優(yōu)選地，所述纖維素酶的用量以木質(zhì)纖維素中的葡聚糖含量計為1～20FPU/g。

優(yōu)選地，所述反應(yīng)的時間為24～96h。

優(yōu)選地，所述木質(zhì)纖維素為濾紙纖維素、微晶纖維素(Avicel)、松木、桉木、楊木、水曲柳、沙棘、伯樹、杉木、樺木、玉米芯、玉米秸稈、麥稈、甘蔗渣、稻草、稻殼、食用菌基質(zhì)、花生殼中的至少一種。

優(yōu)選地，所述預(yù)處理液是木質(zhì)纖維素對應(yīng)的預(yù)處理方法所得到的液體，如稀酸(DA)法和酸性亞硫酸預(yù)處理(SPORL)法得到的液體，一般含有較多的的酶解和發(fā)酵抑制物，根據(jù)預(yù)處理的方式不同而不同。

優(yōu)選地，所述預(yù)處理的方式包括：生物法、機械粉碎法、擠出法、微波處理法、超聲處理法、堿處理法、酸處理法、臭氧分解法、有機溶劑法、離子液體處理法、蒸汽爆破法、水熱法、氨氣爆破法和濕氧化法中的至少一種。

優(yōu)選地，所述木質(zhì)纖維素干重與酶解液質(zhì)量比為1‐30：100。通常需要適當控制木質(zhì)纖維素干重與酶解液質(zhì)量的比，當?shù)陀?質(zhì)量％時，酶解后糖濃度很低，工業(yè)應(yīng)用的價值低，當高于30質(zhì)量％時，酶解液的粘度很大，木質(zhì)纖維素水化困難，輸送不方便。因此，將木質(zhì)纖維素的濃度控制在1‐30質(zhì)量％是適宜的，但是適當超出上述范圍也是可以的。

優(yōu)選地，所述加入PVP和纖維素酶前的酶解液的pH為4.0～6.5。進一步優(yōu)選酶解液的pH為4.8‐6.0。如果酶解液的pH低于4.0或高于6.5，纖維素的酶解糖化效率將會有較為明顯的下降，因為目前纖維素酶的最適pH在5.0附近，過高或過低都會影響纖維素酶的活性，但是只要加入PVP，還是可以提高木質(zhì)纖維素酶解糖化得率。

本發(fā)明中，PVP的分子量對木質(zhì)纖維素的酶解有較大影響，重均分子量超過100000的PVP需要較多的量才能顯著促進纖木質(zhì)纖維素的酶解糖化。

本發(fā)明中，PVP的摻量對木質(zhì)纖維素的酶解糖化有較大的影響，PVP的摻量較少時，對酶解糖化的促進作用不明顯，隨著PVP的添加量逐漸增大，對木質(zhì)纖維素的酶解糖化作用逐漸增強，當達到一定的摻量時，酶解糖化增加不明顯甚至開始下降，且生產(chǎn)成本增加。所述PVP摻量與木質(zhì)纖維素的比為0.2‐25質(zhì)量％。

本發(fā)明中，對纖維素酶沒有特定的要求，對于目前普遍使用的Celluclast 1.5L和Cellic CTec2都有很好的促進作用。

本發(fā)明中，纖維素酶添加量越多，木質(zhì)纖維素酶解糖化率越高，但是纖維素酶的成本較高，因此添加量不能過高，纖維素酶的添加量較低時，木質(zhì)纖維素酶解糖化不完全，原料中的纖維素不能充分的轉(zhuǎn)化成單糖。所以，纖維素酶的添加量以木質(zhì)纖維素中的葡聚糖含量計為1～20FPU/g。更優(yōu)選地，所述纖維素酶的添加量以木質(zhì)纖維素中的葡聚糖含量計為3～10FPU/g。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點及有益效果：

(1)本發(fā)明利用了廣泛使用的非離子表面活性劑PVP，其來源方便、價格低廉，有優(yōu)良的生理惰性，是一種綠色環(huán)保的添加劑。

(2)本發(fā)明方法中添加劑PVP相比于一般的酶解糖化促進劑，可以更顯著的提高木質(zhì)纖維素中纖維素的酶解糖化得率，添加適量的PVP，就可以使木質(zhì)纖維素中纖維素的酶解效率凈提高6.3‐69.1％。

(3)本發(fā)明所述的方法，PVP可以與預(yù)處理液中糖化和發(fā)酵抑制物多酚類物質(zhì)(單寧)絡(luò)合，可以省去木質(zhì)纖維素底物與預(yù)處理液的分離工藝，并且可以回收預(yù)處理液中的糖，實現(xiàn)木質(zhì)纖維素資源的綜合利用。

(4)本發(fā)明所述的方法中，木質(zhì)纖維素的酶解糖化在較廣的pH范圍(4.0‐6.5)內(nèi)都有較好的促進作用。

(5)本發(fā)明方法有利于降低生物乙醇的生產(chǎn)成本。

(6)本發(fā)明將PVP直接加到含有預(yù)處理液的底物中，酶解效率也有很好的提高，省去木質(zhì)纖維素底物與預(yù)處理液的分離，節(jié)約了水資源，避免了環(huán)境污染，對于降低實際生產(chǎn)成本也具有重要意義。

附圖說明

圖1是不同重均分子量的PVP對桉木‐DA的酶解促進效果對比圖。

圖2是不同重均分子量PVP對微晶纖維素的酶解促進作用效果圖，包含實施例1。

圖3是不同重均分子量PVP對桉木‐DA的酶解促進作用效果圖，包含實施例4。

圖4是不同重均分子量PVP對不同底物含量的桉木‐DA的酶解促進效果圖，包含實施例9。

圖5是SPORL法處理的桉木和相應(yīng)的預(yù)處理液一起酶解的情況下，添加PEG 4600、PVP 24000、PVP 160000后的酶解效果對比，包含實施例12。

具體實施方式

為更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。下列實施例中所用試劑均可從市場購買得到。實施例水解液中葡萄糖濃度是通過生物傳感分析儀(SBA‐40E，山東省生物科學(xué)研究院)測定的。

實施例1

取100質(zhì)量份PH101微晶纖維素，加入到5000質(zhì)量份pH為4.8，離子強度為50mmol/L的醋酸‐醋酸鈉緩沖溶液中，加入0.25質(zhì)量份PVP 24000，再加入5FPU/g的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，固液分離獲得纖維素水解液，通過生物傳感分析儀測定葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例2

取100質(zhì)量份稀酸法預(yù)處理過的桉木(桉木‐DA)，加入到5000質(zhì)量份pH為6.0，離子強度為100mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液中，加入5質(zhì)量份PVP 10000，再加入3FPU/g以木質(zhì)纖維素中的葡聚糖含量計的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，固液分離獲得木質(zhì)纖維素水解液，通過生物傳感分析儀測定葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例3

取100質(zhì)量份稀酸法預(yù)處理過的桉木，加入到5000質(zhì)量份pH為4.0，離子強度為25mmol/L的醋酸‐醋酸鈉緩沖溶液中，加入5質(zhì)量份PVP 10000，再加入3FPU/g以木質(zhì)纖維素中的葡聚糖含量計的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，固液分離獲得木質(zhì)纖維素水解液，通過生物傳感分析儀測定葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例4

取100質(zhì)量份稀酸法預(yù)處理過的桉木，加入到5000質(zhì)量份pH為4.8，離子強度為50mmol/L的醋酸‐醋酸鈉緩沖溶液中，加入5質(zhì)量份PVP 10000，再加入5FPU/g，以木質(zhì)纖維素中的葡聚糖含量計的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，固液分離獲得木質(zhì)纖維素水解液，通過生物傳感分析儀測定葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例5

取100質(zhì)量份稀酸法預(yù)處理過的桉木，加入到5000質(zhì)量份pH為4.8，離子強度為200mmol/L的醋酸‐醋酸鈉緩沖溶液中，加入5質(zhì)量份PVP 10000，再加入20FPU/g以木質(zhì)纖維素中的葡聚糖含量計的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，固液分離獲得木質(zhì)纖維素水解液，通過生物傳感分析儀測定葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例6

取100質(zhì)量份酸性亞硫酸鈉預(yù)處理過的松木，加入到5000質(zhì)量份pH為5.5，離子強度為25mmol/L的檸檬酸‐檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入5質(zhì)量份PVP 24000，再加入3FPU/g以木質(zhì)纖維素中的葡聚糖含量計的纖維素酶，在40℃溫度下反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，固液分離獲得木質(zhì)纖維素水解液，通過生物傳感分析儀測定葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例7

取100質(zhì)量份酸性亞硫酸鈉預(yù)處理過的桉木(桉木‐SPORL)，加入到5000質(zhì)量份pH為4.5，離子強度為25mmol/L的檸檬酸‐檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入5質(zhì)量份PVP 8000，再加入3FPU/g以木質(zhì)纖維素中的葡聚糖含量計的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)48h。反應(yīng)結(jié)束后，固液分離獲得木質(zhì)纖維素水解液，通過生物傳感分析儀測定葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例8

取100質(zhì)量份稀酸法預(yù)處理過的桉木，加入到2000質(zhì)量份pH為4.8，離子強度為25mmol/L的檸檬酸‐檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入5質(zhì)量份PVP 24000，再加入3FPU/g以木質(zhì)纖維素中的葡聚糖含量計的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，固液分離獲得木質(zhì)纖維素水解液，通過生物傳感分析儀測定葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例9

取100質(zhì)量份稀酸法預(yù)處理過的桉木，加入到1000質(zhì)量份pH為4.8，離子強度為50mmol/L的檸檬酸‐檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入5質(zhì)量份PVP 10000，再加入3FPU/g以木質(zhì)纖維素中的葡聚糖含量計的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，固液分離獲得木質(zhì)纖維素水解液，通過生物傳感分析儀測定葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例10

取100質(zhì)量份圣泉玉米芯殘渣，加入到5000質(zhì)量份pH為4.8，離子強度為50mmol/L的檸檬酸‐檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入5質(zhì)量份PVP 8000，再加入3FPU/g以木質(zhì)纖維素中的葡聚糖含量計的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)96h。反應(yīng)結(jié)束后，固液分離獲得木質(zhì)纖維素水解液，通過生物傳感分析儀測定葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例11

取100質(zhì)量份稀酸法預(yù)處理過的桉木和相應(yīng)的300質(zhì)量份預(yù)處理液(預(yù)處理的固液比為1：3，干重約500.00g木片原料，硫酸的用量為木片干重的1.1％，將硫酸水溶液倒于水平式旋轉(zhuǎn)蒸煮器內(nèi)，加入木片，設(shè)定蒸煮溫度為165℃，其中升溫時間為50min，保溫時間為60min，蒸煮壓力為0.8MPa，反應(yīng)完后分離得到的液體)，加入到2200質(zhì)量份pH為4.8，離子強度為50mmol/L的檸檬酸‐檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入5質(zhì)量份PVP 10000，再加入3FPU/g以木質(zhì)纖維素中的葡聚糖含量計的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，固液分離獲得木質(zhì)纖維素水解液，通過生物傳感分析儀測定葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

實施例12

取100質(zhì)量份酸性亞硫酸鈉預(yù)處理過的桉木和相應(yīng)的300質(zhì)量份預(yù)處理液(預(yù)處理的固液比為1：3，干重約500.00g木片原料，硫酸的用量為木片干重的1.1％，亞硫酸氫鈉用量為木片干重的4％，將硫酸水溶液倒于水平式旋轉(zhuǎn)蒸煮器內(nèi)，加入木片，再加入亞硫酸氫鈉，設(shè)定蒸煮溫度為165℃，其中升溫時間為50min，保溫時間為60min，蒸煮壓力為0.8MPa，反應(yīng)完后分離得到的液體)，加入到4700質(zhì)量份pH為4.8，離子強度為50mmol/L的醋酸‐醋酸鈉緩沖溶液中，加入5質(zhì)量份PVP 24000，再加入3FPU/g以木質(zhì)纖維素中的葡聚糖含量計的纖維素酶，在50℃溫度下反應(yīng)72h。反應(yīng)結(jié)束后，固液分離獲得木質(zhì)纖維素水解液，通過生物傳感分析儀測定葡萄糖含量，統(tǒng)計結(jié)果如表1所示。

以上實施例同時做了添加了相同質(zhì)量份PEG 4600(將實施例中的PVP換成等質(zhì)量份數(shù)的常用的纖維素酶解助劑PEG 4600，其他條件不變)和空白(將實施例中的PVP換成相應(yīng)的等質(zhì)量份數(shù)的緩沖液，其他條件不變)對比例，與采用本發(fā)明方法的實施例進行木質(zhì)纖維素酶解糖化得率的比較。

表1各實施例和對比例木質(zhì)纖維素酶解糖化得率的比較

以上實施例中纖維素酶是目前被廣泛使用的Cellic CTec2。木質(zhì)纖維素酶解糖化得率如表1所示。相對于沒有加入PVP空白對比例，本發(fā)明實施例的酶解糖化得率都有顯著的增加。對于不同的木質(zhì)纖維素底物，改變酶解的pH、緩沖液的類型、離子強度、底物的固含量、酶載量，適宜濃度的不同重均分子量的PVP對木質(zhì)纖維素的酶解糖化都有很好的促進作用，與空白相比，酶解糖化得率凈增加6.3％‐69.1％，與目前普遍使用的添加劑PEG 4600，酶解糖化得率也有明顯提高。

圖1是在pH 4.8，酶載量3FPU/g葡聚糖條件下，1g/L不同分子量的PVP對桉木‐DA的酶解效果對比，可看到當PVP的重均分子量在8000‐40000的時候，對酶解的促進作用最為明顯，隨著PVP的重均分子量增加到160000，對酶解的促進作用有下降的趨勢，當PVP重均分子量增加到360000，酶解促進效果有明顯的下降。

圖2和圖3(包含實施例1和實施例4)分別是pH 4.8，酶載量5FPU/g葡聚糖條件下，不同重均分子量的PVP對微晶纖維素和桉木‐DA的酶解促進效果隨濃度的變化趨勢，可以看到當PVP的重均分子量較低時，在較低的濃度下就可以促進微晶纖維素和木質(zhì)纖維素的酶解，當PVP的重均分子量達到1300000時，需要更大的濃度才能明顯的促進微晶纖維素和木質(zhì)素纖維素的酶解。

圖4(包含實施例9)是在pH 4.8，酶載量3FPU/g葡聚糖的條件下，不同底物固含的條件下，PEG 4600和PVP 10000對桉木‐DA的酶解效果的對比，可以看到PVP10000在不同固含量的條件下對桉木‐DA的酶解促進效果均比PEG 4600要好。

圖5(包含實施例12)是在pH 4.8，酶載量3FPU/g葡聚糖的條件下，在添加了預(yù)處理液的條件下，添加1g/L PEG 4600、PVP 24000和PVP 160000對桉木‐SPORL酶解的促進作用，可以看到重均分子量為24000的PVP對添加了預(yù)處理液的底物的酶解促進作用比重均分子量為160000的PVP和PEG 4600都要更明顯。

實施例11～12是沒有分離預(yù)處理液直接進行的酶解實驗，避免了預(yù)處理液的分離，不僅節(jié)約水資源，保護環(huán)境，對于降低實際生產(chǎn)成本也具有重要意義。

上述實施例僅僅為說明本發(fā)明，本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。