本發(fā)明涉及生物催化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種手性醇的酶催化制備方法，特別是一種環(huán)狀手性醇的酶催化制備方法。
背景技術(shù)：
手性醇是一類手性碳上連有羥基的旋光性化合物，廣泛用于手性藥物和其他手性精細(xì)化學(xué)品的合成。手性醇的合成方法主要包括物理分離法、拆分法及不對稱還原法。其中，化學(xué)拆分常用酒石酸等拆分劑進(jìn)行多次拆分，所得產(chǎn)物化學(xué)純度可達(dá)到99％以上，但其缺點就是拆分收率極低，只有不到10％；另外，手性拆分劑價格較高，大大地增加了生產(chǎn)成本；操作較為復(fù)雜，且后處理不利用環(huán)境保護(hù)。利用酮類化合物的不對稱還原合成手性醇的方法是目前生產(chǎn)手性醇的一種重要方法，其理論產(chǎn)率可高達(dá)100％，包括化學(xué)不對稱還原法和生物不對稱還原法。其中，化學(xué)不對稱還原法主要是利用手性金屬配合物作為催化劑用于羰基的不對稱還原，盡管該化學(xué)方法已部分用于工業(yè)生產(chǎn)，但是該反應(yīng)過程需要高壓加氫、手性金屬配合物合成復(fù)雜并且價格昂貴，產(chǎn)物中存在重金屬的殘留導(dǎo)致產(chǎn)物分離困難，環(huán)境污染較大，應(yīng)用受到一定的限制；而生物催化不對稱還原法不僅具有高度的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性，并且反應(yīng)條件溫和，避免了產(chǎn)物中的重金屬殘留，對環(huán)境友好，彌補了化學(xué)方法的不足，是一種綠色高效經(jīng)濟(jì)的方法。用于不對稱還原的生物催化劑主要包括微生物全細(xì)胞和氧化還原酶，如專利申請CN201510026759.1公開了一種來源于唐菖蒲伯克霍爾德氏菌(Burkholderia gladioli)ZJB-12126的羰基還原酶，并以含重組羰基還原酶基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，用于不對稱還原前手性羰基化合物之類手性醇；如專利CN201010599376.0公開了一種來源于天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)NRRLB-16638的氧化還原酶作為羰基還原酶催化劑用于不對稱還原前手性羰基化合物以制備光學(xué)活性手性醇；酶法還原具有比全細(xì)胞催化產(chǎn)物選擇性更高、反應(yīng)易處理等優(yōu)點。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種手性醇的酶催化制備方法，所述方法包括：將前手性酮化合物與酮還原酶、輔酶混合，進(jìn)行還原反應(yīng)，得到手性醇；
反應(yīng)路線如下：
其中，R1選自：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的環(huán)烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳烷基、取代或未取代的雜環(huán)基、取代或未取代的雜環(huán)烷基，或R1與其所連接的雜環(huán)形成稠環(huán)體系；
R2選自：H或氨基保護(hù)基團(tuán)；
n為0-3的整數(shù)；
m為0-5的整數(shù)，且n不等于m+1；
優(yōu)選的，R1選自：H、C1-C8的取代或未取代的直鏈烷基、C5-C10的取代或未取代的環(huán)烷基、C6-C12的取代或未取代的芳基、C5-C12的取代或未取代的雜環(huán)基，或R1與所連接的雜環(huán)形成稠環(huán)體系；更優(yōu)選的，R1選自：H、C1-C3的取代或未取代的直鏈烷基、取代或未取代的苯基、取代或未取代的吡啶基，或R1與所連接的雜環(huán)形成稠環(huán)體系；
優(yōu)選的，所述的氨基保護(hù)基團(tuán)優(yōu)選自：Ms、Ts、甲?；?、乙酰基、鹵代乙?；鏣fa、苯甲?；oc、Cbz、Alloc、PMB、Bn、Trt、Dmb；更優(yōu)選自：Boc、Cbz、Bn、乙酰基、苯甲?；?/p>
優(yōu)選的，n為0-2的整數(shù)，更優(yōu)選為0、1、2；
優(yōu)選的，m為0-3的整數(shù)，更優(yōu)選為0、1、2、3；
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述的R1為H，n為1，m為1或2。
在本發(fā)明的一個實施例中，所述R2為H，所述的制備方法還包括氨基上保護(hù)的步驟。
優(yōu)選的，所述的酮還原酶具有：
a)如SEQ ID NO.：1或SEQ ID NO.：2所示的氨基酸序列；或，
b)與SEQ ID NO.：1或SEQ ID NO.：2所示的氨基酸序列具有至少80％，優(yōu)選至少90％，更優(yōu)選至少95％，進(jìn)一步優(yōu)選至少98％的同一性且具有酮還原酶活性的氨基酸序列；
更優(yōu)選的，b)所述的氨基酸系列可為a)所述的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或多個氨基酸后獲得的氨基酸序列或其突變體。
優(yōu)選的，所述的酮還原酶用量為0.05-1.0g/g前手性酮；更優(yōu)選為0.10-0.60g/g前手性酮；
優(yōu)選的，所述的輔酶的用量為0.001-0.030g/g前手性酮；更優(yōu)選為0.001-0.020g/g前手性酮；
優(yōu)選的，所述的還原反應(yīng)的pH為6.0-8.0；更優(yōu)選為7.0；
優(yōu)選的，所述的還原反應(yīng)的溫度為20-50℃；更優(yōu)選為20-40℃；進(jìn)一步優(yōu)選為25-35℃；
優(yōu)選的，所述的反應(yīng)時間為10-50h；更優(yōu)選為15-40h；
優(yōu)選的，所述前手性酮化合物均勻分散于緩沖液中；所述的緩沖液的pH優(yōu)選為6.0-8.0，更優(yōu)選為7.0；更優(yōu)選的，所述的緩沖液用量為10-100mL/g前手性酮；在本發(fā)明的一個實施例中，所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液；
優(yōu)選的，所述的反應(yīng)混合物中還包括輔酶再生體系；
本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，所述的輔酶再生體系用于把輔酶從氧化態(tài)再生為還原態(tài)，或從還原態(tài)再生為氧化態(tài)，從而使輔酶保持在一定的催化劑量水平，其主要包括化學(xué)、光化學(xué)、酶學(xué)和電化學(xué)等再生體系，其中酶法再生較為常用，如底物耦聯(lián)法、酶耦聯(lián)法。本發(fā)明的手性醇的制備反應(yīng)為：其中，當(dāng)采用底物耦聯(lián)法時，輔酶再生體系包括輔助底物，所述的酶Ⅱ為上述酮還原酶，即所述酮還原酶可同時催化目標(biāo)底物和輔助底物的同時轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)輔酶的再生；采用酶耦聯(lián)法時，輔酶再生體系包括酶Ⅱ和輔助底物，所述的酶Ⅱ與上述酮還原酶不同，酶Ⅱ催化輔助底物轉(zhuǎn)化的同時實現(xiàn)輔酶再生。
優(yōu)選的，所述的輔酶再生體系包括酶Ⅱ和輔助底物，所述的酶Ⅱ與上述酮還原酶相同或不同；
在本發(fā)明的一個實施方式中，所述的酶Ⅱ與上述酮還原酶不同，選自：甲酸脫氫酶FDH、葡萄糖脫氫酶GDH、醇脫氫酶ADH；更優(yōu)選為FDH或GDH；更優(yōu)選的，上述的輔酶再生體系選自：FDH和甲酸、FDH和甲酸銨、GDH和葡萄糖；優(yōu)選的，所述的酶Ⅱ的用量為0.001-0.05g/g前手性酮，和/或，所述的輔助底物的用量為1-5mol/mol前手性酮，更優(yōu)選為1-3mol/mol前手性酮；
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述的輔酶再生體系包括葡萄糖、GDH。
在本發(fā)明的另一個實施方式中，所述的酶Ⅱ與上述酮還原酶相同，即所述的酶Ⅱ為上述酮還原酶，其也可催化輔助底物反應(yīng)，實現(xiàn)輔酶再生，所述輔助底物為醇，優(yōu)選自：異丙醇、異丁醇；更優(yōu)選為異丙醇。
反應(yīng)所需輔酶為還原型輔酶，優(yōu)選為NADH或NADPH；更優(yōu)選為NADH；
但還原型輔酶如NADH，其穩(wěn)定性差，且價格貴，在本發(fā)明的一個實施例中，所述的反應(yīng)中添加氧化型輔酶如NAD+，通過輔酶再生體系如葡萄糖+葡萄糖脫氫酶循環(huán)氧化型輔酶如NAD+生成相應(yīng)的還原型輔酶如NADH，供上述手性醇的制備反應(yīng)使用。
優(yōu)選的，所述的方法還包括分離純化步驟：反應(yīng)完畢后體系用硅藻土過濾，有機(jī)溶劑萃取，有機(jī)相干燥，過濾，濃縮，純化得到手性醇產(chǎn)品；
優(yōu)選的，所述的硅藻土的用量為5-50g/g前手性酮；
優(yōu)選的，所述的有機(jī)溶劑為本領(lǐng)域萃取常用的有機(jī)溶劑，本發(fā)明對其種類不作限定，所述有機(jī)溶劑的用量為10-80mL/g前手性酮；
優(yōu)選的，所述的純化采用柱層析純化，更優(yōu)選的，所述的，所述的柱層析純化中硅膠的用量為5-20g/g前手性酮，洗脫液優(yōu)選為乙酸乙酯/石油醚＝1:20，洗脫液用量優(yōu)選為10-80mL/g前手性酮。
本發(fā)明還提供一種上述制備方法在化學(xué)合成中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供的酮還原酶是在200多種酮還原酶及乙醇脫氫酶中篩選出來的，用于由前手性酮化合物不對稱還原制備手性醇具有較高的轉(zhuǎn)化率和立體選擇性，產(chǎn)物的純度高于95.0％，ee值可高于99％。本發(fā)明提供的手性醇的酶催化制備方法，反應(yīng)步驟簡單，一步得到單一構(gòu)型的環(huán)狀手性醇化合物，提高了整體收率，縮短生產(chǎn)周期，節(jié)約生產(chǎn)成本，反應(yīng)條件溫和，收率高，工藝條件穩(wěn)定，反應(yīng)較安全，操作簡單，具備規(guī)模化生產(chǎn)的能力，對環(huán)境友好，減少了有機(jī)溶劑對環(huán)境的污染。
具體實施方式
術(shù)語解釋
在本發(fā)明中，Ms為甲磺?；鵗s是對甲苯磺?；鵅oc為叔丁氧羰基Cbz為芐氧羰基Alloc為烯丙氧羰基PMB為對甲氧基芐基Bn為芐基Tfa為三氟乙?；鵗rt為三苯甲基Dmb為2,4-二甲氧基芐基
術(shù)語“任選/任意”或“任選地/任意地”是指隨后描述的事件或情況可能發(fā)生或可能不發(fā)生，該描述包括發(fā)生所述事件或情況和不發(fā)生所述事件或情況。例如，根據(jù)下文的定義，“任選取代的烷基”是指“未取代的烷基”(未被取代基取代的烷基)或“取代的烷基”(被取代基取代的烷基)。
本文所用C1-Cn包括C1-C2、C1-C3、C1-Cn。舉例而言，所述“C1-C4”基團(tuán)是指該部分中具有1-4個碳原子，即基團(tuán)包含1個碳原子、2個碳原子、3個碳原子或4個碳原子。
本文單獨或組合使用的術(shù)語“烷基”是指任選取代的直鏈或任選取代的支鏈的脂肪族烴類。本文的“烷基”優(yōu)選可具有1-20個碳原子，例如具有1-10個碳原子，具有1-8個碳原子，或1-6個碳原子，或1-4個碳原子或1-3個碳原子。本文單獨或組合使用的術(shù)語“烷氧基”是指烷基醚基(O-烷基)，烷氧基的非限定性實施例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基和叔丁氧基等。
本文單獨或組合使用的術(shù)語“鹵代”或“鹵素取代”是指任選被取代的基團(tuán)(如烷基、烯基和炔基)的其中一個或多個氫原子被替換成氟、氯、溴、碘原子或其組合。
本文單獨或組合使用的術(shù)語“芳香基/芳基”是指任選取代的芳香烴基，其具有6至20個，如6-12個或6-10個成環(huán)碳原子。其可以是稠合芳環(huán)或非稠合芳環(huán)。
本文單獨或組合使用的術(shù)語“雜芳基”是指任意取代的一價雜芳基，其包含5至20個，如5至12個或5至10個骨架成環(huán)原子，其中一個或多個(如1-4個、1-3個、1-2個)成環(huán)原子為雜原子，所述雜原子獨立地選自氧、氮、硫、磷、硅、硒和錫中的雜原子，但不限于此。所述基團(tuán)的環(huán)不包含兩個相鄰的O或S原子。雜芳基包括單環(huán)雜芳基或多環(huán)雜芳基(例如雙環(huán)雜芳基、三環(huán)雜芳基等)。
本文單獨或組合使用的術(shù)語“雜環(huán)”或“雜環(huán)基”是指非芳香雜環(huán)，包括雜環(huán)烷基和雜環(huán)烯基。其中一個或者多個(如1-4個、1-3個、1-2個)成環(huán)的原子是雜原子，如氧、氮或硫原子。雜環(huán)基可以包括單環(huán)雜環(huán)基(雜環(huán)基具有一個環(huán))或多環(huán)雜環(huán)基(例如，雙環(huán)雜環(huán)基(雜環(huán)基具有兩個環(huán))、三環(huán)雜環(huán)基等)。
本文單獨或組合使用的術(shù)語“碳環(huán)基”是指非芳香族的碳環(huán)，包括環(huán)烷基和環(huán)烯基。環(huán)烷基可以是單環(huán)環(huán)烷基或多環(huán)環(huán)烷基(例如，有2、3或4個環(huán)；如雙環(huán)環(huán)烷基)，其可以是螺環(huán)或橋環(huán)。碳環(huán)基可以具有3至20碳原子，例如具有3-15個成環(huán)碳原子或3-10個成環(huán)碳原子或3-6個成環(huán)碳原子，并可以具有0、1、2或3個雙鍵和或0、1或2個三鍵。例如具有3-8個或3-6個成環(huán)碳原子的環(huán)烷基。
“鹵素”是指氟、氯、溴、碘，優(yōu)選氟、氯和溴。氰基是指“-CN”；羥基是指“-OH”；巰基是指“-SH”；氨基是指“-NH2”。
術(shù)語“被取代的”意思是在一個特定的原子上一個或更多的氫被指定的基團(tuán)所替代，如果指定的原子的正?；蟽r在現(xiàn)有的情況下沒有超出，那么取代后結(jié)果是一個穩(wěn)定的化合物。
通過利用本發(fā)明的上述具有高度立體選擇性的酮還原酶得到的其修飾物、功能等同物、功能片段或變體且可以用于不對稱還原合成手性純度較高的醇類化合物的，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實施例1
(1)投料：向5L反應(yīng)釜中，加入125g主原料N-芐氧羰基-3-吡咯烷酮，2.25L磷酸鹽緩沖液(100mmol/L，pH＝7.0)，N-芐氧羰基-3-吡咯烷酮均勻分散于磷酸鹽緩沖液中；
(2)加酮還原酶：向5L反應(yīng)釜中，加入2g輔酶NAD+，290g葡萄糖，25g酮還原酶主酶GcKR和0.125g葡萄糖脫氫酶GDH，體系pH＝7.0；
(3)反應(yīng)：體系于25℃反應(yīng)，攪拌反應(yīng)36h；
(4)后處理：體系用1kg硅藻土過濾，2L乙酸乙酯萃取，靜置分液，有機(jī)相經(jīng)干燥，過濾，濃縮得到粗品，經(jīng)柱層析純化，用500g硅膠，2L洗脫液乙酸乙酯:石油醚＝1:20淋洗，純化得到106.16g純度較高的產(chǎn)品，純度95.37％，收率81％，ee值99.2％，MS(M+H)+＝222.10。
實施例2
(1)投料：向500mL錐形瓶中，加入12.5g主原料N-芐氧羰基-3-吡咯烷酮，225mL磷酸鹽緩沖液(100mmol/L，pH＝7.0)，N-芐氧羰基-3-吡咯烷酮均勻分散于磷酸鹽緩沖液中；
(2)加酮還原酶：向500mL錐形瓶中，加入0.2g輔酶NAD+，29g葡萄糖，2.5g酮還原酶主酶KRED(來源如下表所示)和12.5mg葡萄糖脫氫酶GDH，體系pH＝7.0；
(3)反應(yīng)：體系于30℃反應(yīng)，攪拌反應(yīng)36h；
(4)后處理：體系用100g硅藻土過濾，200mL乙酸乙酯萃取，靜置分液，經(jīng)氣相檢測。
檢測結(jié)果如表1所示，使用上述酮還原酶的反應(yīng)體系中剩余大量原料，沒有產(chǎn)品生成，轉(zhuǎn)化率均為0，可見并非所有酮還原酶均適用于本發(fā)明的手性醇制備反應(yīng)。
表1酮還原酶的來源及轉(zhuǎn)化率結(jié)果
實施例3
(1)投料：向200L反應(yīng)釜中，加入2kg主原料N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮，120L磷酸鹽緩沖液(100mM，pH＝7.0)，N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮均勻分散于磷酸鹽緩沖液中；
(2)加酮還原酶：向200L反應(yīng)釜中，加入15.0g的輔酶NAD+，2.2kg的葡萄糖，1kg酮還原酶主酶ZrKRs和0.02kg葡萄糖脫氫酶GDH，體系pH＝7.0；
(3)反應(yīng)：體系于30℃反應(yīng)，攪拌反應(yīng)24h；
(4)后處理：體系用60kg硅藻土過濾，120L乙酸乙酯萃取，靜置分液，有機(jī)相經(jīng)干燥，過濾，濃縮得到粗品，經(jīng)柱層析純化，用20kg硅膠，100L洗脫液乙酸乙酯:石油醚＝1:20淋洗，純化得到1.726kg純度較高的產(chǎn)品，純度95.0％，收率82％，ee值99.5％，MS(M+H)+＝201.14。
實施例4
(1)投料：向250ml錐形瓶中，加入2g主原料N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮和6ml的異丙醇，40ml磷酸鹽緩沖液(50mmol/L，pH＝7.0)，使底物均勻分散于緩沖液中；
(2)加酮還原酶：繼續(xù)向錐形瓶中加入0.01g的輔酶NAD+，0.3g酮還原酶GcKR，體系pH＝7.0；
(3)反應(yīng)：體系于200rpm搖床中反應(yīng)，并于30±3℃保溫20h；
(4)后處理：體系用40g硅藻土過濾，60ml二氯甲烷萃取，靜置分液，有機(jī)相經(jīng)干燥，過濾，濃縮得到粗品，再經(jīng)柱層析純化得到1.82g純度較高的產(chǎn)品(S)-1-叔丁氧羰基-3-羥基哌啶，純度93.26％，收率84.86％，ee值>99％，MS(M+H)+＝201.14。
由此可見，本發(fā)明中公開的酮還原酶可將酮類化合物還原，得到較高ee值的手性醇產(chǎn)品，ee值可達(dá)95％-99.5％，收率高于80％，合成方法采用的工藝條件穩(wěn)定，反應(yīng)條件溫和，整個生產(chǎn)過程中操作簡單、污染較低，為不對稱還原酮類化合物獲得環(huán)狀手性醇提供了一種新的思路和方法。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。