本發(fā)明屬于發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種通過生物轉(zhuǎn)化制備甘露醇的方法，尤其是通過布氏乳桿菌發(fā)酵-轉(zhuǎn)化-分離三者偶聯(lián)制備甘露醇的新方法。
背景技術(shù)：
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甘露醇(mannitol)，又稱D-甘露糖醇，在自然界生物體內(nèi)廣泛存在，具有多種功能，被廣泛用于食品、醫(yī)藥、輕工和化工等領(lǐng)域。由于甘露醇在人體內(nèi)代謝與體內(nèi)胰島素?zé)o關(guān)，可以作為低熱值食品和低糖食品的甜味劑，適用于糖尿病患者、肝功能障者。甘露醇的主要生產(chǎn)工藝有天然提取法和化學(xué)催化法，目前我國主要采用海帶提取法生產(chǎn)甘露醇，但其生產(chǎn)流程長，提取率低，純化成本較高，加上受限于海帶資源，價格上漲，產(chǎn)品缺乏市場競爭力。與天然提取法相比，化學(xué)催化加氫法，具有無熱源、澄清度高、好過濾等優(yōu)點，產(chǎn)品市場競爭能力強，但該方法催化氫化的條件要求較高，并產(chǎn)生大量副產(chǎn)物山梨醇，轉(zhuǎn)化率較低，且山梨醇與甘露醇分離相對困難，依賴精細的分離裝置，分離成本較高。另外，該方法生產(chǎn)甘露醇的經(jīng)濟效益還容易受到山梨醇市場需求的影響。
目前微生物發(fā)酵制備甘露醇的方法，多見諸研究報道，因為技術(shù)成熟度不足和成本較高的問題尚無產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。許多微生物被發(fā)現(xiàn)可以合成甘露醇，其中異性發(fā)酵的乳酸菌是重點研究的對象。目前的研究集中在菌種的篩選和改造方面，發(fā)酵轉(zhuǎn)化方法主要采用菌體發(fā)酵和底物轉(zhuǎn)化一體同時進行的方式，且分批操作。該方法具有諸多缺陷：首先，培養(yǎng)基和多種產(chǎn)物混合，雜質(zhì)較多，造成分離困難和成本較高；其次，菌體細胞只利用一次，造成菌體培養(yǎng)成本較高。也有少部分研究采用菌體發(fā)酵和底物轉(zhuǎn)化分開進行的方法，減少了由培養(yǎng)基帶來的雜質(zhì)的種類和含量，有利于后續(xù)分離，但是所采用的分批轉(zhuǎn)化方式，沒有實現(xiàn)甘露醇的連續(xù)制備，且產(chǎn)物中由于含有甘露醇、葡萄糖、果糖、乳酸和乙酸五種以上成分，故仍然需要精細的多組分色譜分離單元，成本較高。
針對以上問題，本發(fā)明在前期授權(quán)發(fā)明(ZL201310111633.5)篩選獲得的布氏乳桿菌菌株的基礎(chǔ)上，開發(fā)了發(fā)酵-轉(zhuǎn)化-分離三者偶聯(lián)制備甘露醇的方法，該法首先采納了菌體發(fā)酵和底物轉(zhuǎn)化分開進行的方式；其次創(chuàng)新性地將發(fā)酵、轉(zhuǎn)化和分離三者偶聯(lián)在一起，既可以實現(xiàn)分批操作，又可以實現(xiàn)連續(xù)操作，保證了菌種細胞的連續(xù)多次使用，提高了轉(zhuǎn)化效率，降低了轉(zhuǎn)化成本；第三，創(chuàng)新性地提出一種策略：針對所用菌種，優(yōu)化底物中果糖葡萄糖的比例，使得發(fā)酵-轉(zhuǎn)化-分離偶聯(lián)制備甘露醇時，能夠?qū)崿F(xiàn)果糖葡萄糖的同比例消耗，從而保證連續(xù)操作時葡萄糖和果糖含量保持在極低的水平，進而可以大大降低下底物中的葡萄糖和果糖同步耗盡，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中主要含有甘露醇、乳酸和乙酸，只需經(jīng)脫酸樹脂吸附乳酸和乙酸，即可以實現(xiàn)甘露醇和乳酸的高效快速分離，因此分離步驟變得簡單易用實現(xiàn)，同時成本相對也大大降低。
市場上的甘露醇產(chǎn)品大多是通過結(jié)晶法純化獲得，不是經(jīng)噴霧干燥獲得，而噴霧干燥級的甘露醇，相比非噴干產(chǎn)品，具有良好的流動性以及可壓縮性，可應(yīng)用于直壓壓片、口崩片、分散片等領(lǐng)域。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于提供一種通過布氏乳桿菌發(fā)酵-轉(zhuǎn)化-分離偶聯(lián)制備甘露醇的新方法，以提高果糖轉(zhuǎn)化率和甘露醇的生產(chǎn)率，同時簡化分離純化工藝，降低生產(chǎn)成本。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種發(fā)酵-轉(zhuǎn)化-分離偶聯(lián)裝置，所述裝置包括發(fā)酵裝置、微濾膜組件、脫酸層析柱和產(chǎn)物收集罐；所述發(fā)酵裝置包括發(fā)酵罐、培養(yǎng)基補料容器和底物補料容器；所述培養(yǎng)基補料容器和底物補料容器分別通過恒流泵與發(fā)酵罐相連接；所述發(fā)酵罐、微濾膜組件和脫酸層析柱依次通過恒流泵連接；所述脫酸層析柱和產(chǎn)物收集罐通過管道連接。
本發(fā)明還提供一種采用上述裝置以布氏乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)甘露醇的方法：
(1)測定轉(zhuǎn)化菌種對葡萄糖和果糖的同步消耗比例；
所述測定的方法為采用基于氨基柱的HPLC方法測定不同轉(zhuǎn)化時間點的葡萄糖和果糖含量；
(2)將種子液按10％-20％的接種量接入5L發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度37℃，100r/min條件下于發(fā)酵罐中培養(yǎng)菌株至最大濃度，啟動微濾膜組件收集菌體，濃縮5-6倍后停止微濾；
(3)將3L底物溶液泵至發(fā)酵罐中，轉(zhuǎn)化10-12h至甘露醇濃度最大，且果糖和葡糖糖耗盡，然后再次啟動微濾過濾發(fā)酵液；
所述的底物溶液是在果葡糖漿底物中添加葡萄糖或者果糖，使果糖葡萄糖含量比例達到步驟(1)所述的同步消耗比例；
進一步地所述轉(zhuǎn)化的條件為：溫度為30℃，pH為6.2，轉(zhuǎn)速為100r/min。
(4)將微濾流出的含有甘露醇、乳酸和醋酸的濾過液，經(jīng)過脫酸柱吸附乳酸和醋酸之后，流出的即為較高純度的甘露醇溶液；
脫酸柱飽和之后，濾過液切換到其他的脫酸柱繼續(xù)脫酸，而飽和的脫酸柱經(jīng)過4％NaOH溶液和水沖洗實現(xiàn)再生；
(5)發(fā)酵液經(jīng)微濾濃縮5倍后停止微濾，再將等量的比例調(diào)整后的果葡糖漿底物泵至發(fā)酵罐中，重復(fù)步驟(3)和(4)8-12次實現(xiàn)發(fā)酵分離偶聯(lián)分批制備甘露醇，果糖轉(zhuǎn)化率能達到95％以上，甘露醇的提取收率能達到95％以上；
進一步地，在轉(zhuǎn)化10-12h至甘露醇濃度最大，且果糖和葡糖糖濃度同時耗盡后，再次啟動微濾，同時以0.09-0.12/h的稀釋率連續(xù)補加比例調(diào)整后的果葡糖漿底物溶液至發(fā)酵罐中，控制膜組件濾過液的流速與果葡糖漿底物溶液流速一致，葡萄糖和果糖實時耗盡，流出的含有甘露醇和乳酸的濾過液，經(jīng)過脫酸柱吸附乳酸之后，流出的即為較高純度的甘露醇溶液。脫酸柱飽和之后，濾過液切換到其他的脫酸柱繼續(xù)脫酸，而飽和的脫酸柱經(jīng)過4％NaOH溶液和水沖洗實現(xiàn)再生；隨著時間的延長，菌體的轉(zhuǎn)化能力下降，連續(xù)轉(zhuǎn)化96-120小時后，無法維持0.09/h的稀釋率(無法使葡萄糖和果糖實時耗盡)，停止連續(xù)轉(zhuǎn)化。
進一步地，所述的生產(chǎn)菌種為布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)，保藏編號CGMCC 7300；所述葡萄糖和果糖的同步消耗比例為1.2-1.3；
進一步地，所述微濾膜組件為中空纖維濾膜，過濾孔徑為0.1-0.4μm；
進一步地，所述脫酸層析柱為離子交換樹脂柱，填充樹脂為Amberlite FPA陰離子交換樹脂；
有益效果：
本發(fā)明所述的發(fā)酵-轉(zhuǎn)化-分離三者偶聯(lián)制備甘露醇的新工藝，提高了布氏乳桿菌的轉(zhuǎn)化效率，提高了底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品收率，簡化了提取工藝，果糖轉(zhuǎn)化率能達到95％以上，甘露醇的提取收率能達到95％以上；產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，生產(chǎn)成本低，該工藝可進一步推廣至工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
附圖說明：
圖1本發(fā)明發(fā)酵-轉(zhuǎn)化-分離偶聯(lián)裝置示意圖
其中:1-培養(yǎng)基補料容器；2-底物補料容器；3-發(fā)酵裝置；4-中空纖維濾膜組件(用于過濾菌體，使其回流至發(fā)酵罐)；5-離子交換柱；6-甘露醇收集器；箭頭為液體流向。
具體實施方式：
下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明的具體實施方式進一步詳細描述。
實施例1布氏乳桿菌(CGMCC 7300)對葡萄糖果糖同步消耗比例的測定
(1)將斜面培養(yǎng)的布氏乳桿菌(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC 7300)，接入到種子培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)36h，然后以1.5％的接種量轉(zhuǎn)入二級種子培養(yǎng)基，37℃，200r/min培養(yǎng)36h；
(2)將培養(yǎng)好的二級種子培養(yǎng)液按照20％(v/v)的接種量，接種至裝有已滅菌的5L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度37℃，100r/min培養(yǎng)48h；將發(fā)酵罐連接中空纖維微濾膜組件，開啟循環(huán)泵收集菌體，濃縮5倍；
種子及發(fā)酵培養(yǎng)基成分(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母提取物5.0，K2HPO42.0，檸檬酸三銨2.0，乙酸鈉5.0，葡萄糖20.0，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.19，吐溫-80 1mL,pH 6.2；
(3)控制總糖濃度為100g/L,配制果糖葡萄糖不同比例的底物溶液，果糖葡萄糖比例分別為1.1、1.15、1.2、1.25、1.3、1.35、1.4、1.5。分別向7L發(fā)酵罐中注入不同比例的底物溶液進行轉(zhuǎn)化，控制轉(zhuǎn)化溫度為30℃，pH為6.2，轉(zhuǎn)速為100r/min。轉(zhuǎn)化12h，分別在3h、6h、9h和12h取樣，測定果糖和葡萄糖的含量，進而計算果糖葡萄糖的同步消耗比例；
(4)HPLC檢測方法：
色譜條件：TSK-GEL Amide-80Series色譜柱(4.6mm×100mm，5.0μm)，流動相乙腈：水＝80：20，超聲15min脫氣；檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器；流速1mL/min；柱溫為80℃；進樣量20μL。
標準曲線測定：精密稱取甘露醇、果糖、葡萄糖各1.00mg分別置于1.5mL的EP管中，加去離子水1mL溶解，精確吸取20、40、60、80、100μL的對照品溶液到1.5mL的EP管中，并用去離子水稀釋至100μL，然后吸取20μL進行測定，以標準溶液濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。在0.2～1.0mg/mL范圍內(nèi)，甘露醇、果糖、葡萄糖均有良好的線性關(guān)系。
取轉(zhuǎn)化液樣品1mL于EP管中，12000r/min離心1min，上清液經(jīng)過0.22μm濾膜處理后，HPLC法檢測發(fā)酵液中甘露醇、果糖、葡萄糖含量。
(4)同步消耗比例測定結(jié)果：HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)果糖葡萄糖比例為1.2、1.25、1.3時，轉(zhuǎn)化12小時，果糖和葡萄糖剩余量皆為0，轉(zhuǎn)化3h、6h、9h時，果糖葡萄糖雖然有剩余，但是兩者不同時間點的消耗比例平均值為1.25±0.52。當(dāng)?shù)孜锶芤汗瞧咸烟潜壤笥?.3時，轉(zhuǎn)化12小時后果糖尚有剩余，而低于1.2時葡萄糖尚有剩余，都無法實現(xiàn)同步消耗。
實施例2一種通過布氏乳桿菌發(fā)酵-轉(zhuǎn)化-分離偶聯(lián)制備甘露醇的方法
(1)將斜面培養(yǎng)的布氏乳桿菌(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC 7300)，接入到種子培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)36h，然后以1.5％的接種量轉(zhuǎn)入二級種子培養(yǎng)基，37℃，200r/min培養(yǎng)36h；
(2)采用圖1所示裝置，將培養(yǎng)好的二級種子培養(yǎng)液按照20％(v/v)的接種量，接種至裝有已滅菌的5L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度37℃，100r/min培養(yǎng)48h；將發(fā)酵罐連接中空纖維微濾膜組件，開啟循環(huán)泵收集菌體，濃縮5倍；
種子及發(fā)酵培養(yǎng)基成分(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母提取物5.0，K2HPO42.0，檸檬酸三銨2.0，乙酸鈉5.0，葡萄糖20.0，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.19，吐溫-80 1mL,pH 6.2；
(3)通過向F55型果葡糖漿中添加葡萄糖，調(diào)整果糖和葡萄糖含量的比例至1.25，向發(fā)酵罐中注入3L濃度為100g/L的比例調(diào)整后的的F55型果葡糖漿進行轉(zhuǎn)化，控制轉(zhuǎn)化溫度為30℃，pH為6.2，轉(zhuǎn)速為100r/min；
(4)轉(zhuǎn)化12h后，測定甘露醇，果糖和葡萄糖的濃度，此時甘露醇濃度達到最大，果糖葡萄糖為0，開啟微濾，菌液濃縮5倍后停止，濾出液泵入脫酸層析柱進行脫酸處理，最終獲得較高純度的甘露醇溶液，測得甘露醇濃度達到52g/L，體積產(chǎn)率達到4.33g/L/h，甘露醇相對果糖的轉(zhuǎn)化收率達到96％；
(5)再流加相同果葡糖漿底物，重復(fù)上述步驟進行分批轉(zhuǎn)化，重復(fù)5批后，甘露醇濃度保持在49g/L以上，甘露醇溶液經(jīng)真空干燥機濃縮至甘露醇濃度250-300g/L后，直接噴霧干燥獲得純度98％以上的甘露醇粉末。
實施例3一種通過布氏乳桿菌發(fā)酵-轉(zhuǎn)化-分離偶聯(lián)制備甘露醇的方法
(1)將斜面培養(yǎng)的布氏乳桿菌CGMCC 7300，接入到種子培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)36h，然后以1.5％的接種量轉(zhuǎn)入二級種子培養(yǎng)基，37℃，200r/min培養(yǎng)3h；
(2)采用圖1所示裝置，將培養(yǎng)好的二級種子培養(yǎng)液按照20％(v/v)的接種量，接種至裝有已滅菌的5L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度37℃，100r/min培養(yǎng)48h。將發(fā)酵罐連接中空纖維濾膜組件，開啟循環(huán)泵收集菌體，濃縮5倍。
種子及發(fā)酵培養(yǎng)基成分(g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母提取物5.0，K2HPO42.0，檸檬酸三銨2.0，乙酸鈉5.0，葡萄糖20.0，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.19，吐溫-80 1m L；
(3)通過向F55型果葡糖漿中添加葡萄糖，調(diào)整果糖和葡萄糖比例至1.25。向發(fā)酵罐中注入3L100g/L比例調(diào)整后的F55型果葡糖漿進行轉(zhuǎn)化，控制轉(zhuǎn)化溫度為30℃，pH為6.2，轉(zhuǎn)速為100r/min，
(4)轉(zhuǎn)化到12h時，測定甘露醇，果糖和葡萄糖的濃度，此時甘露醇濃度達到52g/L，果糖、葡萄糖濃度均為0，再次啟動微濾，同時以5mL/min的流量，即0.09/h稀釋率連續(xù)補加果葡糖漿底物溶液至發(fā)酵罐中，控制濾過液的流量與底物補加流量一致。濾過液含有甘露醇、乳酸和乙酸，經(jīng)過脫酸柱吸附乳酸和乙酸之后，獲得的即為較高純度的甘露醇溶液。連續(xù)轉(zhuǎn)化96h，甘露醇的濃度維持在約48g/L以上，甘露醇相對果糖的轉(zhuǎn)化收率在95％以上。甘露醇溶液經(jīng)真空干燥機濃縮至甘露醇濃度250-300g/L后，直接噴霧干燥獲得純度98％以上的甘露醇粉末。