本發(fā)明涉及生物制藥技術領域，尤其涉及一種慶大霉素C1a的制備方法。

背景技術：

慶大霉素是一種氨基糖苷類抗生素,主要用于治療細菌感染，尤其是革蘭氏陰性菌引起的感染。慶大霉素能與細菌核糖體30s亞基結合，阻斷細菌蛋白質合成。

《中國人民共和國藥典》2000年版規(guī)定慶大霉素C組分包括C1、C1a、C2a、C2，其中，慶大霉素C1a可作為合成抗菌藥物依米替星的母體。慶大霉素C1a的分子結構式如下所示：

慶大霉素C1a是合成依替米星的母體，而硫酸依替米星是我國自行研制的一種高效、低毒、抗耐藥性菌的半合成氨基糖苷類抗生素，是唯一獲得國家一類新藥證書的抗感染藥物。本品適用于對其敏感的大腸埃希桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、沙雷氏桿菌屬、長桿菌屬、不動桿菌屬、變形桿菌屬、流感嗜血桿菌、銅綠假單孢菌和葡萄球菌引起的各類感染。臨床顯示本品對以下感染較好的療效：呼吸道感染：如急性支氣管炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作、社區(qū)肺部感染等。腎臟和泌尿生殖系統(tǒng)感染：如急性腎盂腎炎、膀胱性腎盂腎炎或慢性膀胱炎急性發(fā)作等。皮膚軟組織感染包括癤、癰、急性蜂窩組織炎等。創(chuàng)傷、手術前后感染治療或預防性用藥。而且有較低的耳、腎毒性不良反應發(fā)生率，證明了硫酸依替米星是臨床應用中高效、安全的新一代半合成氨基糖苷類抗生素。

慶大霉素C1a常規(guī)的制備方法是通過小諾霉素的發(fā)酵液中分離得到。該制備方法存在諸多技術劣勢，例如，生產工藝較長，生產工藝復雜，樹脂吸附后需要使用混合溶劑經過三次洗脫、解析后才能得到慶大霉素C1a。同時，混合洗脫劑和解析劑中的乙醇采用蒸餾塔回收，因此導致生產設備比較昂貴，且需要消耗大量的蒸汽，從而導致生產成本較高。

有鑒于此，有必要對現(xiàn)有技術中的慶大霉素C1a的制備方法予以改進，以解決上述問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于公開一種慶大霉素C1a的制備方法，用以克服現(xiàn)有技術中的制備方法所存在的生產成本較高，操作繁瑣等缺陷。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種慶大霉素C1a的制備方法，包括以下步驟：

步驟(1)、將慶大霉素B產生菌進行微波誘變，然后利用化學誘變劑進行化學誘變得到慶大霉素C1a產生菌；

步驟(2)、挑選穩(wěn)定且相對高產的慶大霉素C1a產生菌，在35～40℃下斜面培養(yǎng)8～15天；

步驟(3)、挑選成熟的菌種斜面接種于種子培養(yǎng)基，在35～40℃，200～250rpm下在搖床上培養(yǎng)40～60h；然后，接種于一級種子罐中的一級種子培養(yǎng)基上，30～40℃下培養(yǎng)40～60h；然后，接種于二級種子罐中的二級種子培養(yǎng)基上，30～40℃下培養(yǎng)20～30h；

步驟(4)、接種于發(fā)酵罐內的發(fā)酵培養(yǎng)基上，在30～40℃下，發(fā)酵進行至110～160h，放罐，得發(fā)酵液；

步驟(5)、對步驟(4)得到的發(fā)酵液使用微濾膜去除菌絲體及發(fā)酵液殘基；微濾透過液經過超濾膜去除蛋白質、色素和多糖；將收集的超濾透過液經過納濾膜進行常溫脫鹽、富集，脫鹽液經濃縮、干燥制得慶大霉素C1a粗品。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(1)中的微波誘變具體為：吸取2mL孢子液懸于EP管中，將EP管放于冰浴燒杯中，在微波爐中以700W、2450MHz處理10～60s，然后在20～38℃下恒溫培養(yǎng)箱中進行6～8h；所述化學誘變劑為濃度為0.4～1.0mg/mL的亞硝基胍。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(2)中的斜面培養(yǎng)基的組成為：玉米淀粉1.8～2.2g/L，KNO₃0.05～0.15g/L，NaCl0.04～0.06g/L，MgSO₄0.03～0.07g/L，K₂HPO₄0.02～0.04g/L，小麥粉1.8～2.2g/L，碳酸鈣0.09～0.11g/L，瓊脂1.7～2.3g/L，余量為水。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(3)中的搖瓶培養(yǎng)基的組成為：淀粉1.8～2.2g/L，黃豆餅粉1.8～2.2g/L，葡萄糖0.4～0.6g/L，玉米粉0.3～0.7g/L，蛋白胨0.1～0.3g/L，KNO₃0.04～0.06g/L，K₂HPO₄0.01～0.03g/L，碳酸鈣0.3～0.5g/L，余量為水。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(3)中，搖瓶培養(yǎng)基的接種量為10～15％；

所述一級種子培養(yǎng)基的組成為：淀粉0.8～1.2g/L，黃豆餅粉1.4～1.6g/L，玉米粉0.8～1.2g/L，KNO₃0.04～0.06g/L，蛋白胨0.1～0.3g/L，泡敵0.03～0.05g/L，碳酸鈣0.3～0.5g/L，余量為水，一級種子培養(yǎng)基的pH為8.0～8.4；

所述二級種子培養(yǎng)基的組成為：淀粉1.8～2.2g/L，黃豆餅粉1.4～1.6g/L，玉米粉0.4～0.6g/L，葡萄糖0.4～0.6g/L，蛋白胨0.1～0.3g/L，KNO₃0.05～0.15g/L，泡敵0.03～0.05g/L，余量為水，二級種子培養(yǎng)基的pH為8.0～8.4。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：淀粉3.8～4.2g/L，黃豆餅粉3.3～3.7g/L，葡萄糖0.4～0.6g/L，玉米粉1.4～1.6g/L，蛋白胨0.1～0.3g/L，KNO₃0.05～0.15g/L，(NH₄)₂SO₄0.04～0.06g/L，泡敵0.03～0.05g/L，碳酸鈣0.3～0.5g/L，余量為水，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.0～5.4。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(5)中使用微濾膜去除菌絲體及發(fā)酵液殘基的操作壓力為1.0～3.0bar；所述步驟(5)中使用超濾膜去除蛋白質、色素和多糖的操作壓力為1.0～6bar；所述步驟(5)中使用納濾膜進行常溫脫鹽、富集的操作壓力為6.0～10bar。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟(5)中的微濾膜選用截留分子量為20000～500000的分離膜；所述步驟(5)中的超濾膜選用截留分子量為5000～20000的分離膜；所述步驟(5)中的納濾膜選用截留分子量為200～800的分離膜。

作為本發(fā)明的進一步改進，所述微濾膜采用的膜材料為陶瓷或者金屬；超濾膜采用的膜材料為聚乙烯、聚偏氟乙烯或者聚氯乙烯；所述納濾膜采用的膜材料為聚乙烯醇、磺化聚砜膜或者醋酸纖維素。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：在本發(fā)明中，通過對慶大霉素B產生菌進行微波誘變和化學誘變，選出一個慶大霉素C1a為主要組份的新菌株，先進行微波誘變，再進行化學誘變，從而得到慶大霉素C1a的產生菌，并進行發(fā)酵培養(yǎng)，得到的發(fā)酵液通過微濾膜、超濾膜、納濾膜進行分離得到慶大霉素C1a的粗品，本發(fā)明所得到的慶大霉素C1a產生菌通過連續(xù)傳代，慶大霉素C1a產量非常穩(wěn)定，且具有生產成本較低等優(yōu)點，非常適合于產業(yè)化應用。

具體實施方式

下面結合各實施方式對本發(fā)明進行詳細說明，但應當說明的是，這些實施方式并非對本發(fā)明的限制，本領域普通技術人員根據(jù)這些實施方式所作的功能、方法、或者結構上的等效變換或替代，均屬于本發(fā)明的保護范圍之內。

除非說明書中有特殊說明，本發(fā)明中的各個實施例中的組分、原料均采用分析純級別。另外，各實施例中的“g”為重量單位“克”；“h”為時間單位“小時”；“ml”為體積單位“毫升”；“室溫”為23℃；“接種量”為“移入培養(yǎng)基的體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例”；“s”為時間單位“秒”；“mg”為重量單位“毫克”；“rpm”為搖瓶培養(yǎng)的轉速單位“轉/分鐘”；“bar”為壓力單位“巴”，1bar＝0.1兆帕(Mpa)。

實施例一：

該慶大霉素C1a的制備方法包括以下步驟。

步驟(1)、將慶大霉素B(棘孢小單孢菌的突變體)產生菌進行微波誘變，吸取2mL孢子液懸于EP管中，將EP管放于冰浴燒杯中，在微波爐中以700W、2450MHz處理10s；然后利用化學誘變劑進行化學誘變，化學誘變劑為亞硝基胍，誘變劑使用濃度為0.4mg/mL，在20℃下，恒溫培養(yǎng)箱中進行6h的恒溫培養(yǎng)。篩選得到慶大霉素C1a產生菌。

步驟(2)、挑選穩(wěn)定且相對高產的慶大霉素C1a產生菌，在斜面培養(yǎng)基中進行斜面培養(yǎng)。該斜面培養(yǎng)基中的組分為(單位：g/L)：玉米淀粉1.8，KNO₃0.05，NaCl0.04，MgSO₄0.03，K₂HPO₄0.02，小麥粉1.8，碳酸鈣0.09，瓊脂1.7，余量為水。該斜面培養(yǎng)基的pH自然(pH7±0.2)。35℃下，培養(yǎng)8天。

步驟(3)、挑選成熟的菌種斜面接種于搖瓶培養(yǎng)基，接種量為10％，在搖床上進行培養(yǎng)。搖瓶培養(yǎng)基中的組分為(單位：g/L)：淀粉1.8，黃豆餅粉1.8，葡萄糖0.4，玉米粉0.3，蛋白胨0.1，KNO₃0.04，K₂HPO₄0.01，碳酸鈣0.3，余量為水。該搖瓶培養(yǎng)基的pH自然(pH7±0.2)。搖瓶在35℃，200rpm下，培養(yǎng)40h。然后，接種于一級種子罐中的一級種子培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，接種量為10％。

該一級種子培養(yǎng)基中的組分為(單位：g/L)：淀粉0.8，黃豆餅粉1.4，玉米粉0.8，KNO₃0.04，蛋白胨0.1，泡敵0.03，碳酸鈣0.3，余量為水。一級種子培養(yǎng)基的pH為8.0。在30℃下，罐壓為0.03Mpa，培養(yǎng)40h，移種于二級種子罐中的二級種子培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

該二級種子培養(yǎng)基中的組分為(單位：g/L)：淀粉1.8，黃豆餅粉1.4，玉米粉0.4，葡萄糖0.4，蛋白胨0.1，KNO₃0.05，泡敵0.03，余量為水。該二級種子培養(yǎng)基的pH為8.0。接種量為10％，在30℃下，罐壓為0.1Mpa，培養(yǎng)20h。

步驟(4)、接種于發(fā)酵罐內的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，接種量為10％。該發(fā)酵培養(yǎng)基中的組分為(單位：g/L)：淀粉3.8，黃豆餅粉3.3，葡萄糖0.4，玉米粉1.4，蛋白胨0.1，KNO₃0.05，(NH₄)₂SO₄0.04，泡敵0.035，碳酸鈣0.3，余量為水。該發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.0，發(fā)酵在30℃下進行，發(fā)酵進行至110h放罐。

(5)對步驟(4)得到的發(fā)酵液使用微濾膜去除菌絲體及發(fā)酵液殘基，在1.0bar的操作壓力下，微濾膜選用截留分子量為20000的陶瓷膜，收集微濾膜透過液。

將微濾膜透過液經過超濾膜，在1.0bar操作壓力條件下去除蛋白質、色素和多糖等大分子雜質，超濾膜選用截留分子量為5000的聚偏氟乙烯膜，收集超濾膜透過液。

將超濾膜透過液在6.0bar操作壓力條件下經過截留分子量為200的醋酸纖維素膜(一種納濾膜)進行常溫脫鹽、富集，脫鹽液經濃縮、干燥制得含量60％的固態(tài)慶大霉素C1a粗品。

實施例二：

該慶大霉素C1a的制備方法包括以下步驟。

步驟(1)、將慶大霉素B產生菌進行微波誘變，吸取2mL孢子液懸于EP管中，將EP管放于冰浴燒杯中，在微波爐中以700W、2450MHz處理30s；然后利用化學誘變劑進行化學誘變，化學誘變劑為亞硝基胍，誘變劑使用濃度為0.7mg/mL，在30℃下恒溫培養(yǎng)箱中進行7h的恒溫培養(yǎng)。篩選得到慶大霉素C1a產生菌。

步驟(2)、挑選穩(wěn)定且相對高產的慶大霉素C1a產生菌，進行斜面培養(yǎng)。斜面培養(yǎng)基中的組分為(單位：g/L)：玉米淀粉2.0，KNO₃0.1，NaCl0.05，MgSO₄0.05，K₂HPO₄0.03，小麥粉2.0，碳酸鈣0.10，瓊脂2.0，余量為水。該斜面培養(yǎng)基的pH自然(pH7±0.2)。38℃下，培養(yǎng)10天；

步驟(3)、挑選成熟的菌種斜面接種于搖瓶培養(yǎng)基，接種量為12％，在搖床上進行培養(yǎng)。該搖瓶培養(yǎng)基中的組分為(單位：g/L)：淀粉2.0，黃豆餅粉2.0，葡萄糖0.5，玉米粉0.5，蛋白胨0.2，KNO₃0.05，K₂HPO₄0.02，碳酸鈣0.4，余量為水。該搖瓶培養(yǎng)基的pH自然(pH7±0.2)。搖瓶在38℃，220rpm下培養(yǎng)50h。然后，接種于一級種子罐中的一級種子培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，接種量為12％。

該一級種子培養(yǎng)基中的組分為(單位：g/L)：淀粉1.0，黃豆餅粉1.5，玉米粉1.0，KNO₃0.05，蛋白胨0.2，泡敵0.04，碳酸鈣0.4，余量為水。該一級種子培養(yǎng)基的pH為8.2。在35℃下，罐壓為0.04Mpa，培養(yǎng)50h，移種于二級種子罐中的二級種子培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)。

該二級種子培養(yǎng)基中的組分為(單位：g/L)：淀粉2.0，黃豆餅粉1.5，玉米粉0.5，葡萄糖0.5，蛋白胨0.2，KNO₃0.1，泡敵0.04，余量為水。該二級種子培養(yǎng)基的pH為8.2，接種量為12％。在35℃下，罐壓為0.15Mpa，培養(yǎng)25h。

步驟(4)、接種于發(fā)酵罐內的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，接種量為12％。該發(fā)酵培養(yǎng)基中的組分為(單位：g/L)：淀粉4.0，黃豆餅粉3.5，葡萄糖0.5，玉米粉1.5，蛋白胨0.2，KNO₃0.1，(NH₄)₂SO₄0.05，泡敵0.04，碳酸鈣0.4，余量為水。該發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.2，發(fā)酵在35℃下進行，發(fā)酵進行至135h放罐。

步驟(5)、對步驟(4)得到的發(fā)酵液使用微濾膜去除菌絲體及發(fā)酵液殘基，在2.0bar的操作壓力下，微濾膜選用截留分子量為200000的陶瓷膜，收集微濾膜透過液。

將微濾膜透過液經過超濾膜在3.0bar操作壓力條件下去除蛋白質、色素和多糖等大分子雜質，超濾膜選用截留分子量為10000的聚乙烯膜，收集超濾透過液。

將收集的超濾膜透過液在8.0bar操作壓力條件下經過截留分子量為500的磺化聚砜膜(一種納濾膜)進行常溫脫鹽、富集，脫鹽液經濃縮、干燥制得含量72％的固態(tài)慶大霉素C1a粗品。

實施例三：

該慶大霉素C1a的制備方法包括以下步驟。

步驟(1)、將慶大霉素B產生菌進行微波誘變，吸取2mL孢子液懸于EP管中，將EP管放于冰浴燒杯中，在微波爐中以700W、2450MHz處理60s；然后利用化學誘變劑進行化學誘變，化學誘變劑為亞硝基胍，誘變劑使用濃度為1.0mg/mL，在38℃下恒溫培養(yǎng)箱中進行8h的恒溫培養(yǎng)。篩選得到慶大霉素C1a產生菌。

步驟(2)、挑選穩(wěn)定且相對高產的慶大霉素C1a產生菌，進行斜面培養(yǎng)，斜面培養(yǎng)基中的組分為(單位：g/L)：玉米淀粉2.2，KNO₃0.15，NaCl0.06，MgSO₄0.07，K₂HPO₄0.04，小麥粉2.2，碳酸鈣0.11，瓊脂2.3，余量為水。該斜面培養(yǎng)基的pH自然(pH7±0.2)。40℃下培養(yǎng)15天。

步驟(3)、挑選成熟的菌種斜面接種于搖瓶培養(yǎng)基，接種量為15％，在搖床上進行培養(yǎng)。搖瓶培養(yǎng)基中的組分為(單位：g/L)：淀粉2.2，黃豆餅粉2.2，葡萄糖0.6，玉米粉0.7，蛋白胨0.3，KNO₃0.06，K₂HPO₄0.03，碳酸鈣0.5，余量為水。該種子培養(yǎng)基的pH自然(pH7±0.2)。搖瓶在40℃，250rpm下培養(yǎng)60h。然后，接種于一級種子罐中的一級種子培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，接種量為15％。

該一級種子培養(yǎng)基中的組分為(單位：g/L)：淀粉1.2，黃豆餅粉1.6，玉米粉1.2，KNO₃0.06，蛋白胨0.3，泡敵0.05，碳酸鈣0.5，余量為水。該一級種子培養(yǎng)基的pH為8.0～8.4。在40℃下，罐壓為0.05Mpa，培養(yǎng)60h，移種于二級種子罐的二級種子培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

該二級種子培養(yǎng)基中的組分為(單位：g/L)：淀粉2.2，黃豆餅粉1.6，玉米粉0.6，葡萄糖0.6，蛋白胨0.3，KNO₃0.15，泡敵0.05，余量為水。該二級種子培養(yǎng)基的pH為8.4，接種量為15％。在40℃下，罐壓為0.2Mpa，培養(yǎng)30h。

步驟(4)、接種于發(fā)酵罐內的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，接種量為15％。該發(fā)酵培養(yǎng)基中的組分為(單位：g/L)：淀粉4.2，黃豆餅粉3.7，葡萄糖0.6，玉米粉1.6，蛋白胨0.3，KNO₃0.15，(NH₄)₂SO₄0.06，泡敵0.05，碳酸鈣0.5，余量為水。該發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為5.4。發(fā)酵在40℃下進行，發(fā)酵進行至160h放罐。

步驟(5)、對步驟(4)得到的發(fā)酵液使用微濾膜去除菌絲體，發(fā)酵液殘基，在3.0bar的操作壓力下，微濾膜選用截留分子量為400000微濾膜，該微濾膜的膜材料為金屬。收集微濾膜透過液。

將微濾膜透過液經過超濾膜在6.0bar操作壓力條件下去除蛋白質、色素和多糖等大分子雜質，超濾膜選用截留分子量為20000的聚氯乙稀膜，收集超濾膜透過液。

將收集的超濾膜透過液在10bar操作壓力條件下經過截留分子量為800的聚乙烯醇膜(一種納濾膜)進行常溫脫鹽、富集，脫鹽液經濃縮、干燥制得含量65％的固態(tài)慶大霉素C1a粗品。

上文所列出的一系列的詳細說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實施方式的具體說明，它們并非用以限制本發(fā)明的保護范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實施方式或變更均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發(fā)明內。

此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。