本發(fā)明屬于毛蕊花糖苷生物合成技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種毛蕊花糖苷生物合成途徑及其合成酶相關(guān)基因。

背景技術(shù)：

毛蕊花糖苷是苯乙醇苷類(lèi)化合物，分布在毛蕊花、地黃和肉蓯蓉等23個(gè)科的200多種植物的根、莖、葉及花中，具有抗氧化、消炎、抗腫瘤、愈合創(chuàng)傷、護(hù)肝、神經(jīng)保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)等作用。相關(guān)研究人員已經(jīng)基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記前體物喂養(yǎng)試驗(yàn)推測(cè)出毛蕊花糖苷生物合成途徑（如圖1所示），并且據(jù)此化學(xué)合成了毛蕊花糖苷（Synthesis of verbascoside:a dihydroxyphenylethyl glycoside with diverse bioactivity. Eur J Org Chem 1999,10: 2623–2632）。然而，真實(shí)的毛蕊花糖苷生物合成途徑未知，參與其酶及其相應(yīng)的基因還知之甚少。因此，急需了解其生物合成酶及其相應(yīng)的基因。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)是解決此問(wèn)題的有效技術(shù)之一（Verbascoside-A review of its occurrence, (bio) synthesis and pharmacological significance. Biotechnology Advances，2014，32：1065–1076）。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序具有通量高、成本低、靈敏度高、可以獲得低豐度的表達(dá)基因、不限于已知的基因組序列信息、適用于未知基因組序列的物種、不需要克隆步驟、操作簡(jiǎn)單和能全面解讀藥用植物基因組信息等優(yōu)點(diǎn)，是藥用植物功能基因挖掘最有效的工具。藥用植物活性成分生物合成途徑解析及關(guān)鍵酶基因的挖掘?yàn)樗幱弥参镛D(zhuǎn)錄組研究的主要目標(biāo)。用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)掘了藥用植物丹參根次生代謝物合成相關(guān)基因（基于高通量測(cè)序454GSFLX 的丹參轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（4）：524-529）、甘草甜素生物合成途徑酶基因、虎杖根參與莽草酸生物合成路徑和可能與糖苷類(lèi)次級(jí)代謝物生物合成有關(guān)的基因（中藥植物虎杖根的高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及轉(zhuǎn)錄組特性分析，中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)，2012，42（5）：398-412）、枸杞與苯丙氨酸生物合成相關(guān)基因（Identification of phenylpropanoid biosynthetic genes and phenylpropanoid accumulation by transcriptome analysis of Lycium chinense. BMC Genomics，2013，14(1): 802）、麻花艽環(huán)烯醚萜和黃酮合成途徑的基因（De novo sequencing transcriptome of endemic Gentiana straminea (Gentianaceae) to identify genes involved in the biosynthesis of active ingredients, Gene，2016,575:160–170）和厚樸甲羥戊酸途徑相關(guān)基因（厚樸MVA 途徑相關(guān)基因鑒定及生物信息學(xué)分析，中國(guó)中藥雜志，2015，40（11）：2077-2083）等。

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)挖掘了地黃根環(huán)烯醚萜生物合成相關(guān)基因（Transcriptome analysis reveals putative genes involved in iridoid biosynthesis in Rehmannia glutinosa，Int. J. Mol. Sci. 2012, 13, 13748-13763）、正茬與重茬地黃塊根miRNAs的靶基因（Differential miRNA expression in Rehmannia glutinosa plants subjected to continuous cropping. BMC Plant Biology，2011，11:53）、連作障礙相關(guān)基因（Transcriptome-wide identification of the genes responding to replanting disease in Rehmannia glutinosa L. roots，Mol Biol Rep，2015，42:881–892）和激素相關(guān)基因（http://www.xzbu. com/1/view-6200742.htm）。但是，迄今未見(jiàn)地黃毛蕊花糖苷生物合成分子機(jī)制的研究報(bào)道。另外，植物毛蕊花糖苷生物合成基因有極少報(bào)道，如地黃PAL基因過(guò)表達(dá)提高地黃的毛蕊花糖苷含量（轉(zhuǎn)RgPAL1基因提高地黃中毛蕊花糖苷含量的方法，CN201410628062.7）和TyrDC基因在丁香懸浮細(xì)胞中合成毛蕊花糖苷（Production of hydroxy phenylethanol glycosides in suspension cultures of Syringa vulgaris. Phytochemistry 1983; 22:1941–1943）。但是，更多未知參與毛蕊花糖苷生物合成的基因有待研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)現(xiàn)有地黃甚至植物基因研究中缺少毛蕊花糖苷生物合成酶基因的不足，本發(fā)明提供了一種毛蕊花糖苷生物合成途徑及其合成酶相關(guān)基因，該合成途徑利用地黃多發(fā)育階段的組合塊根轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與數(shù)據(jù)處理，獲得轉(zhuǎn)錄本（Unigenes），通過(guò)功能注釋?zhuān)@得KEGG途徑；通過(guò)比對(duì)這些KEGG途徑和基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記前體物喂養(yǎng)試驗(yàn)推測(cè)的毛蕊花糖苷生物合成途徑（圖1），找到候選毛蕊花糖苷生物合成途徑，綜合分析后，建立毛蕊花糖苷生物合成途徑，發(fā)掘并用RT-PCR技術(shù)驗(yàn)證其中一些反應(yīng)所需的合成酶基因。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題采用如下技術(shù)方案，毛蕊花糖苷生物合成途徑，其特征在于具體過(guò)程為：以地黃6個(gè)不同發(fā)育階段的塊根為材料，提取和檢測(cè)其總RNA，用Illumina HiSeq2500平臺(tái)對(duì)其組合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得149.8百萬(wàn)reads，從頭組裝獲得96961個(gè)Unigenes序列；將上述Unigenes序列與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)進(jìn)行代謝通路分析，獲得280個(gè)KEGG途徑，進(jìn)而將KEGG代謝通路與基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記前體物喂養(yǎng)試驗(yàn)推測(cè)的毛蕊花糖苷合成途徑比對(duì)，篩選出5個(gè)候選KEGG途徑；比較推測(cè)的毛蕊花糖苷合成途徑和篩選出5個(gè)候選KEGG途徑，建立有19個(gè)基因編碼酶催化的毛蕊花糖苷生物合成途徑。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的毛蕊花糖苷生物合成途徑，其特征在于包括以下步驟：

步驟（1）、以基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記前體物喂養(yǎng)試驗(yàn)推測(cè)的毛蕊花糖苷合成途徑中的代謝步驟和產(chǎn)物作為參照；

步驟（2）、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，取一個(gè)地黃品種的6個(gè)不同發(fā)育階段混合根，提取總RNA，在測(cè)定其質(zhì)量和純度后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNAs，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，用Illumina HiSeq2500進(jìn)行高通量測(cè)序；

步驟（3）、序列分析與轉(zhuǎn)錄組組裝，利用Illumina自帶軟件將上述測(cè)序所得圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Basecalling轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的核苷酸序列數(shù)據(jù)，去除測(cè)序過(guò)程中低質(zhì)量序列與不確定序列，得到clear reads序列，利用組裝軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的從頭組裝，獲得contigs序列或Unigenes序列；

步驟（4）、轉(zhuǎn)錄物功能注釋與分類(lèi)，將上述Unigenes序列和Nr、Swiss-Prott、KEGG和COG蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得GO、COG功能注釋和分類(lèi)統(tǒng)計(jì)以及EGG代謝途徑；

步驟（5）、毛蕊花糖苷生物合成途徑的建立，通過(guò)比較上述KEGG途徑和基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記前體物喂養(yǎng)試驗(yàn)推測(cè)的毛蕊花糖苷生物合成途徑，找到包含有后者反應(yīng)步驟和反應(yīng)產(chǎn)物的候選KEGG途徑及其相應(yīng)途徑所需的合成酶，建立毛蕊花糖苷生物合成途徑。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述的毛蕊花糖苷生物合成酶相關(guān)基因，其特征在于：將上述的Unigenes序列與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BlastX比對(duì)，再附加ESTscan軟件功能，得到13個(gè)候選的毛蕊花糖苷生物合成酶基因ORFs的堿基序列，該合成酶基因ORFs的堿基序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示。

本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明公開(kāi)的毛蕊花糖苷生物合成途徑為闡明完整的毛蕊花糖苷生物合成途徑奠定基礎(chǔ)，為通過(guò)次生代謝工程或者合成生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)毛蕊花糖苷奠定基礎(chǔ)，為其中功能基因的利用如通過(guò)基因工程技術(shù)提高地黃毛蕊花糖苷含量提供理論支撐。

附圖說(shuō)明

圖1是基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記前體物喂養(yǎng)試驗(yàn)推測(cè)的毛蕊花糖苷生物合成途徑圖；

圖2是本發(fā)明的毛蕊花糖苷生物合成的技術(shù)路線圖；

圖3是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途徑圖；

圖4是苯丙氨酸代謝途徑圖；

圖5是酪氨酸代謝途徑圖；

圖6是苯丙醇生物合成途徑圖；

圖7是異喹啉類(lèi)生物堿生物合成途徑圖；

圖8是毛蕊花糖苷生物合成途徑圖，①分支酸變位酶CM：chorismate mutase[EC:5.4.99.5]預(yù)苯酸脫水酶ADT:arogenate/prephenate dehydratase[EC:4.2.1.91] 預(yù)苯酸脫水酶PD：prephenate dehydrogenase [EC:1.3.1.12] 苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶PAT：aspartate prephenate aminotransferase[EC:2.6.1.79] 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶ASP5:aspartate aminotransferase, chloroplastic [EC:2.6.1.1]天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶GOT2：aspartate aminotransferase, mitochondrial [EC:2.6.1.1] 苯丙氨酸解氨酶PAL：phenylalanine ammonialyase[EC:4.3.1.24] 4-香豆酸輔酶A連接酶4CL:4-coumarate-CoA ligase[EC:6.2.1.12] 肉桂酸羥化酶C4H: Cinnamate-4- hydroxylase [EC:1.14.13.11] ⑩ 奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶HCT:shikimate O-hydroxycinnamoyl transferase [EC:2.3.1.133] ? 香豆酸3-羥化酶C3'H: coumaroylquinate (coumaroylshikimate) 3'-monooxygenase[EC:1.14.136] ?咖啡酰莽草酸酯酶 CSE: caffeoylshikimate esterase [EC:3.1.1.-] ?環(huán)己二烯基脫水酶Phe:cyclohexadienyl dehydratase[EC:4.2.1.51] ?預(yù)苯酸脫水酶TYRAAT:arogenate dehydrogenase [EC:1.3.1.78] ? 酪氨酸酶TYR：tyrosinase[EC:1.14.18.1] ? 酪氨酸脫羧酶TyrTDC：tyrosine decarboxylase[EC:4.1.1.25] ?多巴胺β-單加氧酶DBH: dopamine beta-monooxygenase[EC:1.14.17.1] ?伯胺氧化酶AOC3: primary-amine oxidase[EC:1.4.3.21] ?芳基乙醇脫氫酶AAD: aryl-alcohol dehydrogenase [EC:1.1.1.90]，┇┈表示酶未知；

圖9是8個(gè)參與毛蕊花糖苷生物合成途徑基因的RT-PCR驗(yàn)證圖，泳道M：Trans2K^?DNAMarker，泳道1-8：ASP5、4CL、AOC3、C4H、ADT、C3’H、HCT和GOT2，泳道9：陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

（1）搜索前人推測(cè)的毛蕊花糖苷生物合成途徑

在網(wǎng)站http://isiknowledge.com檢索相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)以前有科學(xué)家基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記前體物喂養(yǎng)試驗(yàn)，推測(cè)出毛蕊花糖苷生物合成途徑（圖1），并且有科研工作者根據(jù)此途徑化學(xué)合成了毛蕊花糖苷（Synthesis of verbascoside:a dihydroxyphenylethyl glycoside with diverse bioactivity. Eur J Org Chem 1999,10: 2623–2632）。但是，真實(shí)的毛蕊花糖苷酶促生物合成途徑未知，參與途徑的酶及其相應(yīng)的基因知之甚少；

（2）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：取適量地黃溫85-5植物的6個(gè)不同發(fā)育階段混合根，用植物總RNA提取試劑盒提取總RNA，經(jīng)過(guò)Alilent 2100 Bioanalyzer檢測(cè)，符合轉(zhuǎn)錄組RNA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（RNA總量≥6μg，OD260/280在1.8-2.1范圍，rRNA Ratio（28S:18S）≥1.5:1，RIN≥7（RNA integrity number）），并通過(guò)甲醛變性膠檢測(cè)總RNA的完整性。用帶有Oligo（dT）的磁珠從上述總RNA中富集mRNA，加入片段化buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNA聚合酶合成第二條cDNA鏈，經(jīng)過(guò)QiaQuick PCR試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復(fù)，加poly（A）并連接測(cè)序接頭，再用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段大小選擇，最后，用PCR擴(kuò)增構(gòu)建地黃根測(cè)序文庫(kù)，用Illumina HiSeq2500進(jìn)行高通量測(cè)序，獲得1.498億reads；

（3）序列分析與轉(zhuǎn)錄組組裝：利用Illumina自帶軟件將上述測(cè)序所得圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Basecalling轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的核苷酸序列數(shù)據(jù)，以fastq格式存貯，對(duì)所產(chǎn)生的原始序列文件進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)與可信度分析，去除測(cè)序過(guò)程中低質(zhì)量序列與不確定序列，得到clear reads序列。然后，利用組裝軟件進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組的從頭組裝，獲得contigs序列。結(jié)合Paired-end信息，對(duì)已經(jīng)獲得contigs序列進(jìn)行scaffold。在拼接與組裝過(guò)程中，用N填補(bǔ)部分read pairs之間的gaps，直至得到含N最少、兩端不能夠再延伸的序列，即Unigenes。結(jié)果從1.498億reads中，從頭組裝96961個(gè)UniGenes；

（4）轉(zhuǎn)錄物功能注釋與分類(lèi)：將上述Unigenes序列和Nr、Swiss- Prott、KEGG和COG等蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTX本地批量比對(duì)，獲得最佳蛋白功能注釋信息（E-value＜le^-5），取比對(duì)結(jié)果最好的蛋白確定Unigenes的序列方向。如果不同庫(kù)之間的比對(duì)結(jié)果有矛盾，就按照Nr、Swiss-Prott和COG的優(yōu)先級(jí)確定其方向；對(duì)于與上述數(shù)據(jù)庫(kù)都比對(duì)不上的Unigenes，利用ESTScan軟件預(yù)測(cè)其編碼區(qū)，確定其序列方向。最后，分別使用Blast2GO（http://www.blast2go.de）軟件和WEGO Web（http://wego.genomics.org.cn/ cgi-bin/wego/ index. pl）工具對(duì)Unigenes序列進(jìn)行GO功能注釋和分類(lèi)統(tǒng)計(jì)。在96,961個(gè)UniGenes 中，有11,848 Unigenes注釋到280KEGG途徑，獲得了催化其中反應(yīng)酶的基因和ORFs；

（5）毛蕊花糖苷生物合成途徑的建立：通過(guò)比較上述280個(gè)KEGG途徑和基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記前體物喂養(yǎng)試驗(yàn)推測(cè)的毛蕊花糖苷生物合成途徑（圖1），找到包含有后者部分反應(yīng)步驟的5個(gè)KEGG途徑及其相應(yīng)途徑所需酶（圖3-7），把5個(gè)KEGG途徑及其相應(yīng)途徑所需酶與推測(cè)的毛蕊花糖苷生物合成途徑整合，建立了19個(gè)酶催化的毛蕊花糖苷生物合成途徑（圖8）；

（6）建立毛蕊花糖苷生物合成途徑中酶基因的驗(yàn)證：根據(jù)上述途徑中揭示出來(lái)的酶及其編號(hào)中，發(fā)現(xiàn)（5）中所述的19個(gè)酶中有9個(gè)酶有13個(gè)Congtigs或者Unigenes（基因）編碼（表1）。根據(jù)酶、ORFs和Congtigs或者Unigenes之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，查找編碼酶的基因的ORFs（表1）；根據(jù)ORFs的堿基序列，用生物信息學(xué)軟件合成引物（表2），用于RT-PCR方法驗(yàn)證候選基因（圖9）。

表1 發(fā)掘與驗(yàn)證8個(gè)毛蕊花糖苷生物合成酶及其相應(yīng)的基因

表2 RT-PCR驗(yàn)證8個(gè)基因所用引物與擴(kuò)增產(chǎn)物的大小

RT-PCR方法驗(yàn)證候選基因?qū)嶒?yàn)的具體過(guò)程如下：

（1）總RNA的提取與檢測(cè)

取適量地黃溫85-5植物塊根，用植物總RNA提取試劑盒提取總RNA。取稀釋的RNA溶液1μL，以無(wú)RNase的DDH2O作為對(duì)照，測(cè)定在A260和A280處的RNA的紫外吸收值，得相應(yīng)的OD值，當(dāng)A260/A280的數(shù)值在1.8-2.1時(shí)，純度比較高。記錄所提的RNA濃度及OD值。取RNA溶液5μL加入1μL的6×Loading Buffer點(diǎn)樣，在1×TAE緩沖液、1wt%的瓊脂糖濃度、120V電壓下電泳，電泳后將凝膠放在伯樂(lè)多功能紫外透射反射儀下觀察并照相，檢測(cè)RNA的完整性。

（2）cDNA第一鏈的制備（按試劑盒說(shuō)明書(shū)）

① 于1.5mL冰浴的無(wú)核酸酶的離心管中加入以下反應(yīng)混合物：總RNA（5μg）5μL，Oligo（dT）18 2μL，dNTP Mix（2.5mM each）2μL，補(bǔ)RNase-free ddH2O至13.5μL；

② 水浴鍋中70℃加熱5min后，冰上迅速冷卻2min。簡(jiǎn)短離心收集管反應(yīng)液；

③ 每個(gè)反應(yīng)中加入下列成分：5×First-Strand Buffer 4μL，0.1M DTT 1μL，Rnasin（40U/μL）0.5μL，M-MLV（200U/μL）1μL；

④ 在水浴鍋中于42℃溫浴50min；

⑤ 在水浴鍋中于95℃加熱5min終止反應(yīng)；

⑥用RNase-free ddH2O將反應(yīng)體系稀釋到50μL，置冰上進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)或冷凍保存；

⑦PCR擴(kuò)增反應(yīng)，在25μL反應(yīng)體系中含雙蒸水14.1μL，10×buffer（不含Mg²⁺）2.5μL，dNTP Mixture 2.5μL（各2.5mmol/L），Mg²⁺ 2.5μL（25mmol/L），Taq酶0.4μL（5U/μL），引物各1μL（10μmol/L），1μL的模板cDNA（表3）。將上述反應(yīng)液放在PCR試管中，94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min，4℃保存。

表3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

⑧取5μL PCR產(chǎn)物與適量的上樣緩沖液混合，取10μL混合液，點(diǎn)樣，進(jìn)行1.5wt%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

以上實(shí)施例描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征及優(yōu)點(diǎn)，本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明原理的范圍下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南師范大學(xué)

<120> 毛蕊花糖苷生物合成途徑及其合成酶相關(guān)基因

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> SEQ ID NO:1

<211> 432

<212> CDNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:1

atgcacggct cgaaactccg cgtcgcctac caaggcgtcc ccggcgcgta cagcgaagcc 60

gccgccggaa aggcttaccc gaattgcgag gccatcccct gcgaccaatt cgaagttgca 120

ttccaagccg tggagctctg gatagctgat agagccgttt tgccggtgga gaattcctta 180

ggcggctcaa tccaccggaa ctacgacctc ctcctccgcc accgcctcca catagtcgga 240

gaagtccaac tccccgtcca ccactgcctc ctagctctcc caggcgtcag aaaagagtac 300

ctcacgcgcg tcatcagcca cccacaagcc ctctcccaat gcgagcacac actcaccaaa 360

atggggctaa acgttgcccg cgaagcggtc gacgacaccg ccggcgcggc ggagtacatc 420

gcgacgaaca at 432

<210> SEQ ID NO:2

<211> 498

<212> CDNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:2

atggagcttc tgatcgctca gtcttacagt aaaaatttgg ggctctatgc agaaaggatt 60

ggagcaatta atgttgtttg ttcgacatct gaagttgcaa aaagggtaaa aagccaattg 120

aaaaggattg cacggccaat gtactcaaat cctcccatac atggagctag gattgtcgca 180

aatgttgtgg ggaattcaga tctcttcaat gaatggaaag aggagatgga attgatggct 240

ggaaggataa tgagtgtcag aaagaaacta tatgatagtc tgagtgccaa ggacaacagt 300

gggaaggact ggtcctttat tctcaaacag atcggcatgt tctcatttac aggcttgaac 360

aaagctcaga ctgagaacat gaccagcaag tggcacgtat acatgaccaa ggatggaaga 420

atatccttag ccggattatc ttcagccaag tgtgaatacc ttgctgatgc tattattgat 480

tcattccata acgttagc 498

<210> SEQ ID NO:3

<211> 618

<212> CDNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:3

atgatagctg acataaaggc agctccagaa ggaagttttg tgttacttca tggttgtgcg 60

cacaacccaa ctggcattga tcccactcca gcacaatggg aaagaatcgc tgatgtcatt 120

cagaaaaaga gtcatattcc gttctttgat tttgcctatc agggttttgc atgtgggtgc 180

cttgacaaag atgcattatc gatgagattg tttgctgcac gtggcatgga gcttctgatc 240

gctcagtctt acggtaaaaa tatggggctc tacgcagaaa ggattggagc acttaatgtt 300

gtttgttcgt catctgaaga tgcaaaaagg gtaaaaagcc aattgaaaag gattgcacgg 360

gcaacgtact caagtcctcc agtacatgga gctaggattg tcgcgaatgt tgtggggaat 420

ccagatctct tcaatgaatg gaaagaggag atggaattga tggctggaag gataatgagt 480

gtcagaaaga aactatatga tagtctgatt gccaaggaca acagtgggaa ggactggtcc 540

tttattctca aacacatcgg catgttctca tttacaggct tgacagaagc acagattgag 600

aacatgacca gcaagtgg 618

<210> SEQ ID NO:4

<211> 345

<212> CDNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:4

atgccttatt tttctcaaat ggttttgact aatataagat cctcaagttt caaatgctgg 60

actgcatatg gtccattaat tgtatgtaag gagcatatgc taattatatt actccattct 120

ggttcatatg atctttttgt ccctggcctt tacatctttc aatggctatt tatcctagtt 180

cccagaggca aatttccaca tgttgctttc tggcatgcga cattgttgtc cagcctcaca 240

aaccttgtcc aatcatccga tgcgattagc tattatgcta cattatatct gcagaaagag 300

gttcaatcct atttttttat ttttttttgt aattacggct ttgat 345

<210> SEQ ID NO:5

<211> 636

<212> CDNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:5

atgtacctaa gccaccctgc acaaccttcc atgcntaaaa tgacatgcct gttctccgtc 60

aggctcgccn ccgaccgcga atcgcatcac gtagacgccc accaaccacc gcgtgggtca 120

tgtaaatctt ancccgattc gtttatcgtc tccaacagnc ttcgcgttga gattgttcgc 180

cgcgtcctcc gacngagacg atctggtggt ttccggcgaa ctccgccggn nnnnnnnnnn 240

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300

nnnnnnnnnn nnnnnnttgt aatcgacgac ctgtttcgtt tccgaggctt tgtttctcaa 360

atactctgga tatgtcngat agcgctttta ccagagctcc agggtccttc acccaaaggc 420

aacagcaatc taaagtcngt caaaaaccac ttatgcgcgt taaagctgaa cgagtgcgct 480

ttctcgnact ccgtcgagan aaatggcggt actcggggca gatacacgcg cttccggcgt 540

acgccgcgnt cgacgtgcac cncagatccc gtactcctcc gccacgtcac acagcgggcc 600

cagcggatcc naccgcggtg gacgacgtcg ttccaa 636

<210> SEQ ID NO:6

<211> 306

<212> CDNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:6

atgcatatat ccacggccct gttcttcgtg ttnatacacg agttttctac cacgccggct 60

gcatattctc aaattcaatg gacattcctt caanttggtg tagcgtctcg acccagtact 120

tttcgaccga tgagaacccg attttggagg tatgnaatca tctttgttct cttcggacat 180

ctgaatttaa tcgctacaaa ccatctcgat gccggntcca atcgtaccta ctcctaccgc 240

tatagcctga gtcaccaata tcaccgtagt cgaccanctt gtaatccgac tcccctgtgc 300

aaaacg 306

<210> SEQ ID NO:7

<211> 2335

<212> CDNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:7

atggccacaa ctgcgaaaaa ggcgacgctt cctgctccga agacggctgc ttgttgcgct 60

cccgcggccg ccggcgattc agccgccgta gtccgccgtg agtctgcatc tgccaccgct 120

gctgcagact ggaaggtttc acccgtcgcc gcggaagatc agcagagcaa gaaagctgct 180

gccgttgcgt ccttaattag accggagcct tcttccaatg ccaccactaa agggatccag 240

atcatgacaa gggcgcaaac gaaacatcct ttggatcctt tatctgctac tgaaatctct 300

gtggctgtgg gaacagttag agcagctgga gccacccctg aggtcagaga tagcatgaga 360

tttattgaag ttgttctgtt ggaaccagag aagaatgtgg tggcactggc agatgcttat 420

ttctttcccc cttttcaacc atcattgttg cttagaacga aaggaggacc ttcaattcct 480

agcaagctcc caccgaggag agccagacta gttgtctaca ataagaagtc caatgagact 540

agtttgtgga ttgttgagtt gacggaagta catgcaacaa cacgaagtgg acatcatcga 600

ggaaaagtca tttcctctac aattgtccct gatgttcagc caccaatgga tgctgcagaa 660

tatgccgaat gtgaagctgt tgtcaaagat taccctccat ttattgaggc aatgaagaag 720

aggggtattg atgatatgga cttagtcatg gttgatcctt ggtgtgttgg ttaccacagt 780

gaggctgatg ctcctagtcg cagacttgca aaaccactta tattttgccg gacggagagt 840

gactgcccac tggaaaatgg ttatgcgcga cccgttgaag gaatttatgt gcttgttgat 900

atgcagaata tggtggtaat tgagtttgaa gatcgtaagc ttgttccttt gccgccagct 960

gatccactga gaaattatac tcctggtgaa acaaggggag gggtagatag aagtgatgtg 1020

aaaccccttc aaattattca gcctgaaggt ccaagctttc gaatcaacgg acattatgtt 1080

gagtggcaga agtggaactt tcgcattggc ttcactccga gggagggttt ggtcatccat 1140

tctgttgcct atgttgatgg cagtcggggt aggagaccta tagcccatag gttgagtttc 1200

gtggagatgg ttgtgcccta tggggatcct aatgaacctc attacaggaa aaatgcattt 1260

gatgctgggg aagatggatt ggggaaaaat gctcattctc ttaagaaggg atgtgattgt 1320

ttgggttata taaaatactt cgatgctcat tttacaaact tcactggagg agttgaaact 1380

attgaaaact gtgtatgctt gcatgaagaa gattatggaa ttctatggaa gcatcaagac 1440

tggagaactg gcctcgctga agttcgaaga tcaaggcgtc tcactgtttc tttcatttgc 1500

actgtggcta attatgaata tggattttac tggcactttt atcaggatgg gaaaattgaa 1560

gcggaagtta aacttactgg aattcttagt ttaggggctc tgcaacctgg agaatataga 1620

aaatatggta caacaattgc accaggacta tatgccccag ttcatcaaca cttttttgtt 1680

gctcgcatgg atatgtcagt cgactgtaaa cctggagaaa tgcacaatca ggttgttgaa 1740

gtgaatgtta gaatcgaaga acctggaaag gacaatgttc acaataatgc attctatgct 1800

gaggaaactt tacttagatc tgaattagaa gccatgcgtg attgtgatcc gttatcagcc 1860

cgtcattgga ttataaggaa cactagaacc gtcaatcgga gtggacaact gacaggctac 1920

aaattggtac ctggttcgaa ttgtttgccg ttggctggtc ccgaggctaa atttctgaga 1980

agagctgcct ttttgaagca taatctatgg gttacacaat atgcacgcgg ggaggatttt 2040

cctggaggag agtttcccaa tcagaatcca cgtgctgggg aagggttggt ttcatgggtg 2100

aaacagaatc gccctctcga agaaaatgac atagttctct ggtatgtttt tggcattaca 2160

catgttcctc gactggaaga ctggcctgtt atgcccgttg aacacatagg gtttgtgctt 2200

cagccgcatg gattcttcaa ttgttctcct gctgttgatg ttccgccgag tacttgcgac 2260

atggatgcaa aagagaatga tgtgaaagag aatggggtcg ccaagccgag ttcgtctggt 2320

ctaatagcaa agctc 2335

<210> SEQ ID NO:8

<211> 381

<212> CDNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:8

atgatgtaca ataatatgta ccggattatg ttcgacagaa ggtttgagag tgaagatgat 60

cctttgtttt tgaagttaaa ggcgttgaat ggagagagga gtcgattggc tcagagcttt 120

gagtataatt atggtgattt tattccaatt ttgaggccct ttttgagagg gtatctcaag 180

atctgcaagg aggtgaagga gaagaggtta cagctgttca aggactattt tgttgatgag 240

agaaagaagc ttgcaagcac aaaggcaacc gacaacgata gcctaaaatg tgctattgat 300

cacattcttg aagcccaaca gaagggagag atcaatgagg acaatgttct gtacattgtt 360

gagaacatca atgttgctgc a 381

<210> SEQ ID NO:9

<211> 723

<212> CDNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:9

atggtcactg ctgatcaaga ttttgctggg gaaatgcaca attcatttct gtgtgttttg 60

cctatgttcc atgtgtttgg tctggcggtg atcatgtatg cgcagctgca gcgtggcaat 120

tccgttgttt cgatgtcgaa attcgatttg gaattgattt tgaagacggt ggagaagtac 180

ggtgtctcac atatgtgggt tgtgccgcca attatactgg gcttggctaa aagtcctgtg 240

gtcaagaagt ataatttatc ctctttgagg cagattggat caggggcggc ccctcttgga 300

agggaattga tgcaggannn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 360

nctcgacatt ctggttcgac tggaatgctt gttccaggag tggagagtca gattgttagt 420

gttgagaaac tgaagcctct tcctcctggc cagttggggg aaatatgggt acgagggccc 480

aatatgatgc aaggttattt caacaannnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnt gagggtcagc 540

tttttgttgt tgaccgtatt aaagagctca tcaagtacaa aggttttcag gttgctccag 600

cggagcttga agggctgctt gtgtctcacc ctgagatttc agatgctgtt gttatcccgt 660

ttcctgatgc tgaagctggt gaagtcccgg ctgcttatgt tgtccgctcc cctaatagct 720

cac 723

<210> SEQ ID NO:10

<211> 528

<212> CDNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:10

atgaaaatta ttgatatcga aactggtgcg tctttagggc gtaaccaacc tggagaaatt 60

tgtattagag gtgaccaaat tatgaaaggt tatttgaacg atccagaatc gacagagagc 120

acaatagaca aaaatggatg gttacacacg ggtgatatag gtttcattga tggtgatgat 180

gagctattca tcgttgatcg gttgaaggaa ataataaagt acaaaggctt ccaagttgca 240

cctgctgagc tcgaggccct cctcctcaac cacccttacg tctctgatgc tgcagttgtc 300

tccatgaaag atgagcaagc aggagaagta cccgttgctt ttgttgtgag atcaaataat 360

ggttccacca tcactgagga tgaaatcaag caatttatct ccaagcaggt ggttttctac 420

aagagaataa accgtgtgtt tttcattgat gccattccca agtctccatc gggcaaaata 480

ttgagaaaag atttgagagc aagattagca tctggtgatg ttacaaat 528

<210> SEQ ID NO:11

<211> 300

<212> CDNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:11

atggcgctcc tccagaactg cgctgaattt gttttcattt tcatgggagc ttcgatgatt 60

ggggcgatta ccaccaccgc gaatcctttc tgcactgcca aagaaatttt caagcaattc 120

aatgcctcca aatcaaaatt aatcgtcacg caatcgcagt acgtggataa gctccgcgat 180

acaggggata attccgtggt gtttggcgag gatttctccg tcgtcacgat cgacaatccg 240

ccggatggat gcttgcattt ctcggtgctt tcggaagcaa acgagaagga tgcgccggcg 300

<210> SEQ ID NO:12

<211> 843

<212> CDNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:12

atgcaacacc atgtggccga cggcttctcc ggcctccatt tcatcaacac atggtccgat 60

atggcccgcg ggctcgacat caccgtcccg ccattcatcg accgtaccct cctccgagcg 120

cgcgacccgc ccctgccgca attcaaacac atcgaatacc agcccgcgcc cgccatgaaa 180

accaacacca acgccaacaa aatccccgaa acagccgtct cgatattcaa gctaacgcgc 240

gatcagctca acgccctcaa ggccaagtcg aaggagaacg gcaacacggt cacgtacagc 300

tcgtacgaga tgctagccgg gcacgtctgg cgctcggcct gcatggctcg cgccctgccc 360

gaggaccagg acacgaagct ctacatcgcg actgatggcc ggtccaggct taggccgtcg 420

ctccctcagg ggtactttgg gaacgtgatc tttacggcca cgcctatcgc cgtgtcgggc 480

gatctcgagt cgaagcccgt ttggtacgcg gcgagtaaga tccacgacgc gttggcgcga 540

atggacaacg agtacttgag atcggcgctg gattatttgg agctccagcc cgatctcaag 600

gcgctcgtcc gcggggccca cacgtttcgg tgcccgaacc tcgggatcac gagttgggtc 660

aggcttccga tccatgatgc tgatttcgga tggggccggc ccatttttat ggggccgggt 720

gggattgctt atgaagggtt gagctttgtg ttgccaagcc caacaaatga tgggagctta 780

tcggttgcta tttcattgca aagtgagcat atgaaggttt tcgagaagtt gctttatgac 840

att 843

<210> SEQ ID NO:13

<211> 849

<212> CDNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO:13

atggccgagc atatcccatg gctgcgttgg atgttcccgc tggacgaaga ggcatttgcc 60

aaacatggag cacgtagaga tcgtcttaca cgggatataa tggaagagca caccattgct 120

cgccaaaaaa gtggaggagc caaacaacac ttttttgatg ctttgctgac actgcaagat 180

aaatatgatc taagtgagga caccataatc ggccttcttt gggacatgat cactgcagga 240

atggacacaa ctgcaatatc cgttgaatgg gccatggcag agttgatcaa gaatccaagg 300

gtccaaaaaa aggcacagga cgagctagac cgtgtaatcg gacacgaacg tgtattgacc 360

gaactcgact tctcaagcct tccctatctg caatgtgtag ccaaagagtc tttgagattg 420

catcctccga cccctctaat gctccctcat cgtgccaacg ccaacgttaa gattggtggg 480

tacgacgtcc ccaagggttc aaacgtgcac gtcaacgtgt gggccatagc acgtgaccct 540

gcggtatgga agaatccctc agaatttagg ccagaaaggt tcctcgagga ggatgtggat 600

atgaagggac atgattatcg acttcttccg tttggtgccg ggagaagagt gtgtccaggt 660

gcacaactag gcatcaattt ggccacatct atgattggcc accttttgca ccacttcgat 720

tgggtgagta cacaagagat tgacatggga gagaatcctg gtttagttac ttacatgagg 780

actccattgg aggcggtacc tactcctaga ttacccgcga atctgtatag gcgtatggcc 840

gtcgacatg 849