本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，特別涉及一種產(chǎn)二十碳五烯酸的菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

EPA(Eicosapentaenoic Acid，二十碳五烯酸)對(duì)于人類(lèi)健康具有重要意義，研究表明它具有預(yù)防心血管疾病、抑制乳腺癌和結(jié)腸癌的生理功能。此外，在人體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為前列腺素、血栓素和白三烯等類(lèi)二十烷酸活性物質(zhì)。目前EPA的商業(yè)來(lái)源主要是深海魚(yú)油，但魚(yú)油的生產(chǎn)受魚(yú)類(lèi)、季節(jié)和地點(diǎn)限制，加工成本高且具有魚(yú)腥味，特別是海洋生態(tài)環(huán)境的污染和漁業(yè)資源的日益匱乏，使魚(yú)油很難滿(mǎn)足人們對(duì)EPA的需求。

微生物具有生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)需求低、代謝調(diào)控簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)。許多微生物菌株可以合成其他高附加值的代謝產(chǎn)物，如角鯊烯、植物甾醇和蝦青素等。其中，高附加值的代謝產(chǎn)物EPA和DHA(Docosahexaenoic Acid，二十二碳六烯酸)均屬于ω-3系列多不飽和脂肪酸。目前，富含DHA的微生物，如破囊壺菌(Thraustochytrium)和裂殖壺菌(Schizochytrium)均已經(jīng)被用于商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)DHA，其代表公司如美國(guó)的馬泰克(Martek)和中國(guó)的嘉必優(yōu)(Cabio)。然而，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)可用于商業(yè)化生產(chǎn)EPA的野生型高產(chǎn)菌株。

在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過(guò)程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下問(wèn)題：

EPA是人體不可缺少的重要營(yíng)養(yǎng)素。雖然人體攝入必需脂肪酸亞麻酸后可被轉(zhuǎn)化為EPA或DHA，但此反應(yīng)在人體中的速度很慢且轉(zhuǎn)化率很低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足人體對(duì)EPA的需求，尤其是嬰幼兒和中老年人。由于目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)可用于商業(yè)化生產(chǎn)EPA的野生型高產(chǎn)菌株，故獲得符合商業(yè)需求的產(chǎn)EPA的野生型高產(chǎn)菌株迫在眉睫。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有可用于商業(yè)化生產(chǎn)EPA的野生型高產(chǎn)菌株的問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種產(chǎn)二十碳五烯酸的菌株及其應(yīng)用。所述技術(shù)方案如下：

一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種產(chǎn)二十碳五烯酸的菌株，所述菌株包括：Nocardioides plantarum、Compostimonas suwonensis、Flavobacteriu momnivorum、和Shewanella baltica，其中Nocardioides plantarum于2016年3月9日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2016309，Compostimonas suwonensis于2016年6月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2016311，F(xiàn)lavobacteriu momnivorum于2016年6月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2016310，Shewanella baltica于2016年6月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M2016312。

具體地，所述保藏編號(hào)為CCTCC M2016309的菌株16Sr DNA序列如序列表中SEQ IN NO:1所示，所述保藏編號(hào)為CCTCC M2016311的菌株16Sr DNA序列如序列表中SEQ IN NO:2所示，所述保藏編號(hào)為CCTCC M2016310的菌株16Sr DNA序列如序列表中SEQ IN NO:3所示，所述保藏編號(hào)為CCTCC M2016312的菌株16Sr DNA序列如序列表中SEQ IN NO:4所示。

另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種上述菌株在產(chǎn)二十碳五烯酸中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括以下步驟：

對(duì)所述菌株進(jìn)行活化，活化條件為：0-15℃，搖床轉(zhuǎn)速為180±10rpm；對(duì)活化后的所述菌株進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵條件為：0-15℃，搖床轉(zhuǎn)速為180±10rpm。

具體地，采用液體培養(yǎng)基進(jìn)行所述菌株的活化和發(fā)酵，所述液體培養(yǎng)基包括：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、葡萄糖、可溶性淀粉、丙酮酸鈉、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂和水，其中，酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、葡萄糖和可溶性淀粉的質(zhì)量比為1:1:1:1:1，酵母提取物、丙酮酸鈉、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂和水的質(zhì)量比為5:3:3:180，酵母提取物與水的質(zhì)量比為1:2000，所述液體培養(yǎng)基的pH值為7.3±0.2。

進(jìn)一步地，所述液體培養(yǎng)基還包括3μg/mL的淺藍(lán)菌素。

具體地，取活化后的所述菌株按照體積比為1％的接種量進(jìn)行發(fā)酵。

進(jìn)一步地，所述液體培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)121℃滅菌20min。

具體地，所述菌株的活化條件為：10℃。

具體地，所述菌株的發(fā)酵條件為：10℃。

具體地，所述菌株活化和發(fā)酵時(shí)搖床轉(zhuǎn)速均為180rpm。

本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果是：本發(fā)明實(shí)施例提供了一種產(chǎn)二十碳五烯酸的菌株及其應(yīng)用，該四株產(chǎn)二十碳五烯酸的菌株均為野生型菌株，能夠滿(mǎn)足人體對(duì)EPA的需要，這四種野生型高產(chǎn)菌株豐富了微生物合成EPA的資源庫(kù)，并可用于商業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)為PKS途徑的研究提供材料，為高產(chǎn)ω-3VLCPUFAs工程菌株的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)，此外，該應(yīng)用方法可進(jìn)一步提高菌株產(chǎn)二十碳五烯酸的能力，從而通過(guò)該菌株獲得更多的二十碳五烯酸。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的菌株6-42的脂肪酸組分的百分比含量與EPA甲酯標(biāo)品對(duì)比圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的菌株6-42的氣相色譜圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的EPA甲酯標(biāo)品的氣相色譜圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的瓊脂糖凝膠電泳圖。

本發(fā)明實(shí)施例提供的四種菌株均于2016年6月6日送往中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏，保藏地址：中國(guó)湖北省武漢市珞珈山武漢大學(xué)，四種菌株分類(lèi)命名分別為：Nocardioides plantarum、Compostimona ssuwonensis、Flavobact eriu momnivorum和Shewanella baltica；保藏編號(hào)分別為：CCTCC M2016309、CCTCC M2016311、CCTCC M2016310和CCTCC M2016312。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。

實(shí)施例

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種菌株在產(chǎn)二十碳五烯酸中的應(yīng)用，該應(yīng)用包括以下步驟：活化和發(fā)酵，菌株的活化條件為：0-15℃，搖床轉(zhuǎn)速為180±10rpm；菌株的發(fā)酵條件為：0-15℃，搖床轉(zhuǎn)速為180±10rpm。

本實(shí)施例選取6批菌株，6批菌株均由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(China center for type culture collection，CCTCC)提供，6批菌株均采自挪威斯瓦爾巴群島新奧爾松地區(qū)(Ny-Alesund，Svalbard Archipelago，Norway)。其中，第一批和第二批均采自該地區(qū)的冰川前端土壤，地理坐標(biāo)分別為(78°54’N，12°06’E&78°53’N，12°10’E)；第三批采自該地區(qū)的苔原凍土帶土壤，位于(78°53’N，12°09’E)；第四批和第五批均采自該地區(qū)的Stuphallet懸崖斷層，分別位于(78°57.575’N，11°36.288’E&78°57.521’N，11°36.447’E)；第六批采自該地區(qū)的MidtreLovenbreen冰川前端溶出區(qū)域，位于(78°53.704’N，12°5.262’E)。

活化：將培養(yǎng)在斜面培養(yǎng)基上的菌株接種到液體培養(yǎng)基(用于活化菌株)上進(jìn)行活化，得到原始菌株，斜面培養(yǎng)基上的菌株來(lái)源于挪威斯瓦爾巴群島新奧爾松地區(qū)提取的土壤樣品中，具體地，挑取斜面培養(yǎng)基上保存的菌株接種至含有3ml新鮮的液體培養(yǎng)基的無(wú)菌具塞試管內(nèi)，置于0-15℃轉(zhuǎn)速為180±10rpm的搖床上進(jìn)行活化。在本實(shí)施例中，活化的培養(yǎng)溫度可以為10℃，轉(zhuǎn)速可以為180rpm。

其中，采用液體培養(yǎng)基進(jìn)行菌株的活化和發(fā)酵，液體培養(yǎng)基包括：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、葡萄糖、可溶性淀粉、丙酮酸鈉、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂和水，其中，酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、葡萄糖和可溶性淀粉的質(zhì)量比為1:1:1:1:1，酵母提取物、丙酮酸鈉、磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂和水的質(zhì)量比為5:3:3:180，酵母提取物與水的質(zhì)量比為1:2000，液體培養(yǎng)基的pH值為7.3±0.2。具體地，在本實(shí)施例中，液體培養(yǎng)基具體包括：酵母提取物0.5g，蛋白胨0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，丙酮酸鈉0.3g，磷酸氫二鉀0.3g，七水硫酸鎂0.049g，水1L，pH值為7.3±0.2，121℃滅菌20min。

此外，液體培養(yǎng)基還可以包括3μg/mL的淺藍(lán)菌素(由美國(guó)Sigma-Aldrich公司提供)。3μg/mL的淺藍(lán)菌素通過(guò)將淺藍(lán)菌素溶解于無(wú)水乙醇中獲得，置于-20℃保存。

發(fā)酵：將原始菌株接種至液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)(用于發(fā)酵)至菌株生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，得到菌液。具體地，將活化好的菌液(原始菌株)按照1％(V/V)接種量轉(zhuǎn)接至含100mL新鮮液體培養(yǎng)基的250mL搖瓶?jī)?nèi)。培養(yǎng)溫度為0-15℃，轉(zhuǎn)速為180±10rpm。在本實(shí)施例中，發(fā)酵的培養(yǎng)溫度可以為10℃，轉(zhuǎn)速可以為180rpm。

菌株篩選

將菌液經(jīng)過(guò)脂肪酸組分測(cè)定，獲得產(chǎn)二十碳五烯酸的菌株。具體方法包括：在與脂肪酸組分測(cè)定條件相同的情況下，以EPA(Eicosapentaenoic Acid，二十碳五烯酸)甲酯標(biāo)品(購(gòu)置于瑞典Larodan公司)作為對(duì)照，根據(jù)EPA甲酯標(biāo)品在脂肪酸氣相色譜上的出峰時(shí)間挑選出可能產(chǎn)EPA的菌株，再對(duì)可能產(chǎn)EPA的菌株進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析，根據(jù)EPA甲酯標(biāo)品的質(zhì)譜圖判斷該菌液中的菌體是否產(chǎn)EPA，當(dāng)EPA甲酯標(biāo)品的質(zhì)譜圖與菌液的質(zhì)譜圖相同時(shí)，則判斷該菌液中的菌株產(chǎn)EPA。

脂肪酸組分測(cè)定：

將菌液真空干燥后研磨制成菌體干粉，將菌體干粉置于玻璃瓶?jī)?nèi)，向玻璃瓶?jī)?nèi)加入鹽酸甲醇溶液和二十一烷酸并進(jìn)行漩渦振蕩，密封玻璃瓶并置于80℃水浴2h，冷卻至室溫后向玻璃瓶?jī)?nèi)加入氯化鈉水溶液和正己烷并進(jìn)行漩渦振蕩，靜置后取上清液，將上清液離心，獲得含有甲酯化脂肪酸的上清液，將含有甲酯化脂肪酸的上清液用氮?dú)獯蹈珊蠹尤牍柰榛噭?，硅烷化試劑的體積與含有甲酯化脂肪酸的上清液的體積相等，于90℃反應(yīng)1h，冷卻至室溫后可直接用于氣相色譜分析。

本實(shí)施例采用安捷倫7890A氣相色譜儀，氫離子火焰化檢測(cè)器(Flame Ionization Detector，F(xiàn)ID)；HP-FFAP(30m×0.25mm×0.25m)色譜柱；載氣為高純氮?dú)?，進(jìn)樣口壓力為25psi，進(jìn)樣量1L，分流比30:1；升溫程序：初始溫度150℃保持1min，然后以5℃/min升溫至230℃并保持8min，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別保持在250℃和280℃。采用面積歸一法計(jì)算脂肪酸的相對(duì)百分含量。GC-MS(氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用)采用相同的儀器、分離柱和分離條件，質(zhì)譜型號(hào)為安捷倫5975C。

本實(shí)施例采用上述方法共獲得了四株產(chǎn)EPA的菌株，如表1所示，該四株菌株分別編號(hào)為1-1、2-37、2-42和6-42，其中，四株菌株16Sr DNA序列分別如序列表中SEQ IN NO:1、序列表中SEQ IN NO:2、序列表中SEQ IN NO:3和序列表中SEQ IN NO:4所示。其中，菌株6-42的脂肪酸組分的百分比含量如圖1所示，菌株6-42的氣相色譜圖如圖2所示，EPA甲酯標(biāo)品的氣相色譜圖如3所示，由于菌株6-42的氣相色譜和EPA甲酯標(biāo)品的氣相色譜的出峰時(shí)間，則認(rèn)為菌株6-42產(chǎn)EPA，其他三株同理判斷。

表1為產(chǎn)EPA的四株菌株

由表1可知，四株菌株1-1、2-37、2-42和6-42測(cè)定的EPA占總脂肪酸百分比依次為1.1％、2.3％、0.9％和4.9％。

菌株的分類(lèi)地位

本實(shí)施例采用16S rDNA序列分析來(lái)鑒定所篩選的菌株的分類(lèi)地位。

鑒定：提取原始菌株的總DNA，具體地，取活化后的菌株種子液(原始菌株)接種至新鮮的液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于10℃搖床180rpm培養(yǎng)。按照細(xì)菌基因組提取試劑盒(Minibest Bacterial Genomic DNA Extraction Kit，日本Takara公司)使用說(shuō)明來(lái)提取菌液的總DNA。取3μL提取的總DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，剩余總DNA樣品置于-20℃保存。

以總DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；具體地，反應(yīng)體系為50μL，具體的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如表2所示：

表2為PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

其中，正向引物序列如表SEQ IN NO:5所示，反向引物序列如表SEQ IN NO:6所示。

表3為PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

反應(yīng)程序參照Phusion High-Fidelity DNA Polymerase使用說(shuō)明書(shū)。取3μL擴(kuò)增產(chǎn)物按照表3所示的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，得到16S rDNA片段；待PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)正確后，使用純化回收試劑盒(Minibest DNA Fragment purification Kit，日本Takara公司)回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，具體操作步驟參照使用說(shuō)明書(shū)。

將16S rDNA片段連接到質(zhì)粒上，得到連接產(chǎn)物；采用PCR平末端克隆試劑盒(Zero Blunt PCR Cloning Kit，美國(guó)Life公司)將回收的16S rDNA片段連接到Top 0質(zhì)粒(購(gòu)置于美國(guó)Life公司)上。反應(yīng)體系為6μL，具體如表4所示：

表4為連接體系的成分

將配置好的連接體系置于室溫下連接10min，連接后反應(yīng)液可直接用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，離心后去除部分上清液并進(jìn)行重懸，得到重懸液，將重懸液涂布在卡那霉素固體培養(yǎng)基上；具體方法如下：

(1)將-70℃保存的DH5α感受態(tài)細(xì)胞置于冰上溶解，將6μL連接反應(yīng)液加入溶解后的感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，輕輕混勻后冰上靜置30min，得到混合產(chǎn)物；

(2)將混合產(chǎn)物加入離心管內(nèi)置于42℃水浴鍋中熱擊60s，注意操作過(guò)程中動(dòng)作輕柔；

(3)熱擊完成后將離心管靜置于冰上2min，隨后加入500μL新鮮卡那霉素固體培養(yǎng)基(LB固體培養(yǎng)基)，37℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)1h；其中，卡那霉素固體培養(yǎng)基包括：酵母提取物、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂，其中，酵母提取物、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂的質(zhì)量比為5:10:10:18，卡那霉素固體培養(yǎng)基的pH值為7.0。在本實(shí)施例中，酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化鈉10g，瓊脂18g，pH值為7.0，121℃滅菌20min，用于大腸桿菌的培養(yǎng)。

(4)將離心管取出于4000rpm離心1min，去除部分上清液后進(jìn)行重懸，得到重懸液，將重懸液涂布于50μg/mL的LB固體平板培養(yǎng)基上，隨后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。通過(guò)重懸的方式濃縮感受態(tài)細(xì)胞。

挑取LB固體平板培養(yǎng)基(其組分與LB固體培養(yǎng)基組分相同)上的單菌落進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，以M13F/M13R為引物(M13F的序列如表SEQ IN NO:7所示，M13R的序列如表SEQ IN NO:8所示)，采用Taq酶進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系及條件參照說(shuō)明書(shū)。隨后取3μL的PCR反應(yīng)液用于瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)目的條帶大小是否正確，結(jié)果如圖4所示，在圖4中，M為DNA maker，1、2、3、4分別代表菌株1-1、2-37、2-42和6-42，其中，四個(gè)菌株的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物大小均約為1.5Kb，可見(jiàn)本實(shí)施例提供的四種菌株的條帶大小正確。

挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序(武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司)，確定測(cè)序結(jié)果的一致性后將獲得的16S rDNA序列在NCBI(National Center of Biotechnology Information，美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，基本局部比對(duì)搜索工具)同源性比對(duì)，四個(gè)菌株分別和Nocardioidesplantarum、Compostimonassuwonensis、Flavobacteriumomnivorum和Shewanellabaltica同源性較高，從而認(rèn)定四株菌株分別屬于Nocardioidesplantarum、Compostimonassuwonensis、Flavobacteriumomnivorum和Shewanellabaltica，進(jìn)而確定了四株菌株的分類(lèi)地位。

溫度對(duì)菌株

本發(fā)明實(shí)施例提供了溫度對(duì)菌株6-42的影響，將活化的溫度和培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的溫度同時(shí)設(shè)置為0℃、5℃、10℃、15℃和20℃，其他培養(yǎng)條件相同，將所獲得的產(chǎn)二十碳五烯酸的菌株分別進(jìn)行脂肪酸組分測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表5所示：

表5為溫度對(duì)菌株6-42產(chǎn)EPA含量的影響

注：表5中數(shù)據(jù)用mean±SD(n＝3)表示；下同。

由表5可知，隨著溫度的降低EPA占總脂肪酸的百分比由20℃時(shí)的3.4％逐步升高到0℃時(shí)的8.8％，相應(yīng)的菌體干重由2.2mg/g升到6.2mg/g。同時(shí)由于溫度的降低其生物量也隨之由初始的0.5g/L降到0.3g/L，可見(jiàn)EPA的產(chǎn)量(單位體積培養(yǎng)基含量)在10℃時(shí)最高達(dá)2.2mg/L，因此，本實(shí)施例將活化的溫度和培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的溫度均設(shè)置為10℃，從而提高四種菌體產(chǎn)EPA的能力。

進(jìn)一步分析其脂肪酸各組分的變化，如表5所示。

表6為溫度對(duì)菌株6-42的脂肪酸組分的影響

由表6可知，隨著溫度的降低直鏈飽和脂肪酸中短鏈脂肪酸C12:0和C14:0含量增加，中長(zhǎng)鏈脂肪酸C16:0、C17:0和C18:0含量減少，直鏈飽和脂肪酸總量先增后減。各支鏈飽和脂肪酸隨著溫度的降低變化規(guī)律不一，且變化幅度不大，支鏈飽和脂肪酸總量先減后增。綜合直鏈和支鏈飽和脂肪酸的含量變化，結(jié)果顯示飽和脂肪酸總量隨著溫度的降低而減少。單不飽和脂肪酸C16:1含量隨著溫度降低而增加而C18:1變化趨勢(shì)相反，總量變化趨勢(shì)不明顯；多不飽和脂肪酸EPA含量隨著溫度的降低呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。整體來(lái)看，隨著溫度的降低，不飽和脂肪酸總量增加而飽和脂肪酸總量減少。

淺藍(lán)菌素對(duì)菌株的影響

本發(fā)明實(shí)施例中的液體培養(yǎng)基可以包括淺藍(lán)菌素，淺藍(lán)菌素的加入量分別設(shè)置為0、1、2、3、4、5μg/mL各濃度在10℃下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。各濃度下EPA的產(chǎn)量如表7所示。

表7為淺藍(lán)菌素對(duì)EPA的影響

由表7可知，淺藍(lán)菌素處理后菌株產(chǎn)EPA的量均有所提高，其中淺藍(lán)菌素濃度為3μg/mL時(shí)達(dá)到最大，EPA占總脂肪酸百分比、菌體干重和單位體積培養(yǎng)基含量分別達(dá)到7.6％、4.5mg/g和3.6mg/L。對(duì)比10℃時(shí)靜置和振蕩兩種培養(yǎng)條件，可以看出靜置時(shí)EPA占總脂肪酸百分比和菌體干重較高，但振蕩培養(yǎng)生物量較高因此EPA單位體積培養(yǎng)基產(chǎn)量高于靜置培養(yǎng)，因此，本實(shí)施例中的液體培養(yǎng)基中的淺藍(lán)菌素為3μg/mL。

進(jìn)一步分析淺藍(lán)菌素對(duì)脂肪酸各組分的變化，如表8所示。

表8為淺藍(lán)菌素對(duì)菌株6-42的脂肪酸組分的影響

由表8可以看出當(dāng)加入淺藍(lán)菌素后，碳鏈長(zhǎng)度在15碳及其以下的直鏈飽和脂肪酸含量增加而15碳以上含量減少，支鏈飽和脂肪酸中C13:0含量增加而C15:0和C17:0含量減少，直鏈和支鏈飽和脂肪酸總量均增加但后者變化較小。羥基脂肪酸整體變化不大，而單不飽和脂肪酸含量均減少，相反EPA含量先增后減。整體來(lái)說(shuō)，淺藍(lán)菌素使菌株6-42的短鏈脂肪酸含量增加，單不飽和脂肪酸含量減少，羥基脂肪酸含量不變而EPA含量增加。

同時(shí)，結(jié)合溫度與淺藍(lán)菌素對(duì)菌株6-42進(jìn)行綜合實(shí)驗(yàn)，在0℃和10℃下分別加入3μg/mL的淺藍(lán)菌素來(lái)培養(yǎng)菌體6-42。其結(jié)果如表9所示。

表9為溫度和淺藍(lán)菌素對(duì)菌株6-42產(chǎn)EPA含量的影響

注：表9中*表示振蕩培養(yǎng)，其它為靜置培養(yǎng)。

由表9可以看出0℃下加入3μg/mL的淺藍(lán)菌素靜置培養(yǎng)，EPA占總脂肪酸百分比和菌體干重含量達(dá)到最大，分別為11.5％和6.7mg/g，相比10℃振蕩培養(yǎng)(不添加淺藍(lán)菌素)的條件下分別提高到2.3和2.2倍；在10℃下加入3μg/mL的淺藍(lán)菌素振蕩培養(yǎng)，單位體積培養(yǎng)基中EPA含量最高，達(dá)到3.6mg/L，其EPA產(chǎn)量相比于0℃靜置培養(yǎng)(不添加淺藍(lán)菌素)增加到1.8倍。

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種從極端環(huán)境篩選、鑒定、優(yōu)化產(chǎn)二十碳五烯酸的細(xì)菌菌株及其應(yīng)用，該四株產(chǎn)二十碳五烯酸的菌株均為野生型產(chǎn)生菌株，其中兩株為首次發(fā)現(xiàn)能夠合成EPA。這四種野生型產(chǎn)生菌株豐富了微生物合成EPA的菌株和基因資源庫(kù)，并有潛力用于商業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)為PKS途徑的研究提供材料，為高產(chǎn)ω-3VLCPUFAs工程菌株的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)，此外，該應(yīng)用方法可進(jìn)一步提高菌株產(chǎn)二十碳五烯酸的能力，從而通過(guò)該菌株獲得更多的二十碳五烯酸。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。