本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種γ-聚谷氨酸產(chǎn)生菌和一種使用同步糖化、過濾與發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
：γ-聚谷氨酸(英文名稱γ-polyglutamicacid，簡稱γ-pga)是由l-谷氨酸或d-谷氨酸通過α-氨基和γ-羧基間的酰胺鍵結(jié)合而成，具有吸水性、水溶性、帶負(fù)電荷、無毒、可生物降解、可食用等性質(zhì)，是一種優(yōu)良的環(huán)保型高分子材料，因此γ-聚谷氨酸及其衍生物已被廣泛應(yīng)用于藥物載體、水處理絮凝劑、農(nóng)業(yè)保水保肥劑、食品化妝品添加劑等多個(gè)領(lǐng)域。傳統(tǒng)工藝中，γ-聚谷氨酸主要是通過微生物發(fā)酵方法制備，葡萄糖、甘油和檸檬酸是發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的主要碳源，但是這些碳源營養(yǎng)物質(zhì)均來源于人類食物，如糧食、土豆、甘蔗等，這樣不僅導(dǎo)致γ-聚谷氨酸的成本較高，而且大規(guī)模的生產(chǎn)還會加劇人類食物的短缺。因此，伴隨著γ-聚谷氨酸需求量快速增長，尋求可替代的經(jīng)濟(jì)型碳源材料進(jìn)行γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)具有重要意義。木質(zhì)纖維素是自然界最為豐富的碳水化合物資源，目前其已成功應(yīng)用于生產(chǎn)多種生物能源和高附加值化學(xué)產(chǎn)品，如生物乙醇、乳酸、丁二醇、谷氨酸等。近年來，以木質(zhì)纖維素為原材料發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的研究已被陸續(xù)報(bào)道。如英文雜志《journalofchemicaltechnologyandbiotechnology》(2013，89(4):616–622)公開了一篇名稱為“anovelapproachforpoly-γ-glutamicacidproductionusingxyloseandcorncobfibreshydrolysateinbacillussubtillishb-1”的期刊論文，該論文指出以玉米芯水解液為主要碳源，使用枯草芽孢桿菌hb-1進(jìn)行γ-聚谷氨酸發(fā)酵；英文雜志《bioresourcetechnology》(2015，193(2015):370–376)公開了一篇名稱為“highlyefficientricestrawutilizationforpoly-(c-glutamicacid)productionbybacillussubtilisnx-2”的期刊論文，該論文公開的技術(shù)是通過兩步水解法將稻草水解，水解液經(jīng)濃縮脫毒后使用枯草芽孢桿菌nx-2進(jìn)行γ-聚谷氨酸發(fā)酵。但是，這些現(xiàn)有技術(shù)均是通過分段水解與發(fā)酵相結(jié)合的方式進(jìn)行γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)制備，不僅工藝復(fù)雜，而且能耗大，另外，這些現(xiàn)有技術(shù)均是批次發(fā)酵，即每一次發(fā)酵都需要重新培養(yǎng)一級甚至多級種子，亦即上一次發(fā)酵的細(xì)菌不會再循環(huán)利用，這樣發(fā)酵方式不僅生產(chǎn)周期長，而且發(fā)酵過程中原料和設(shè)備的投入也會相應(yīng)地增加。由此可見，目前以木質(zhì)纖維素為主要原料發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的方法還不適合γ-聚谷氨酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。ishola等人于2013年提出將同步糖化、過濾與發(fā)酵法(簡稱ssff)應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工藝中，整個(gè)工藝在兩個(gè)反應(yīng)器中進(jìn)行，即將預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料在水解反應(yīng)器中進(jìn)行酶水解，經(jīng)過膜過濾，含糖的濾出液持續(xù)泵入發(fā)酵罐中進(jìn)行微生物發(fā)酵。與傳統(tǒng)的分步糖化發(fā)酵法(簡稱shf)相比，ssff法不僅工藝簡單，產(chǎn)物的生產(chǎn)效率高，而且采用ssff法時(shí)細(xì)胞與固態(tài)的纖維素材料處于分離狀態(tài)，發(fā)酵菌體容易回收，從而可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)批次發(fā)酵生產(chǎn)?，F(xiàn)有技術(shù)中γ-pga發(fā)酵多采用游離細(xì)胞發(fā)酵，而與游離細(xì)胞相比，固定化細(xì)胞具有方便回收、可重復(fù)多次使用、批次生產(chǎn)間隔時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，因此，申請人認(rèn)為將ssff法和固定化細(xì)胞發(fā)酵相結(jié)合可以有效的解決現(xiàn)階段使用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)γ-聚谷氨酸所存在的工藝復(fù)雜、能耗大、發(fā)酵的菌體不能循環(huán)利用等問題，對以木質(zhì)纖維素為原料發(fā)酵γ-聚谷氨酸的規(guī)模化具有重大意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的首要目的是提供一種高產(chǎn)γ-聚谷氨酸的芽孢桿菌(bacillussp.)jx-12，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)的保藏號為cgmccno.13716，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101，保藏日期為2017年3月16日。本發(fā)明所提供的芽孢桿菌(bacillussp.)jx-12，是從大醬樣品中篩選得到的芽孢桿菌。所述菌株jx-12的形態(tài)特征為：在lb培養(yǎng)基中營養(yǎng)細(xì)胞為0.7～0.9×2.0～3.0μm大小的桿菌，革蘭氏染色為陽性，37℃培養(yǎng)3～5天形成芽孢，芽孢大小0.4～0.6×0.8～1.5μm，為長圓形或圓柱形。菌株jx-12的菌落形態(tài)特征為：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)：30～40℃培養(yǎng)1天可大量生長，菌落表面凸起，光滑無褶皺，菌落透明，邊緣呈規(guī)則圓形，菌落粘性大，挑起有絲狀。e型發(fā)酵培養(yǎng)基瓊脂平板培養(yǎng)：30～40℃培養(yǎng)1d可大量生長，菌落表面凸起、中心凹陷，表面不光滑有褶皺，菌落白色半透明，邊緣不規(guī)則，菌落表面有液滴，菌落粘性大，挑起有拉絲狀。菌株jx-12的生理生化性質(zhì)如下表1所示：表1.jx-12菌部分生理生化特性表1的“+”表示反應(yīng)為陽性，“-”表示反應(yīng)為陰性。分子生物學(xué)鑒定：提取菌株全基因組dna，pcr擴(kuò)增16srdna片段，測序，測序結(jié)果在ncbi中進(jìn)行比對，比對結(jié)果顯示該菌株為芽孢桿菌(bacillussp.)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供高產(chǎn)γ-聚谷氨酸的菌株在生產(chǎn)γ-聚谷氨酸中的應(yīng)用，是一種新型的以木質(zhì)纖維素為主要原料的γ-聚谷氨酸生產(chǎn)方法，能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)同步糖化水解發(fā)酵和連續(xù)批次發(fā)酵。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的步驟如下：1)、種子培養(yǎng)：將菌株jx-12接種于無菌的活化培養(yǎng)基斜面，在30-37℃條件下培養(yǎng)24-48小時(shí)活化，將已活化的菌種接種于無菌的種子培養(yǎng)基，在30-37℃、150-250rpm的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24-48小時(shí)，即得種子液。所述的活化培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g，牛肉膏5g，nacl5g，瓊脂18～20g，ph6.8～7.4，補(bǔ)水至1000ml。所述的種子培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g，牛肉膏5g，nacl5g，ph7.0～7.4，補(bǔ)水至1000ml。2)、固定化細(xì)胞制備：將種子液離心，棄上清液，用無菌的0.9％生理鹽水沖洗3-4次，用無菌水將菌體懸浮，并稀釋至濃度為105-107cfu/ml，將菌懸液與載體材料混合均勻，交聯(lián)固化形成顆粒，用無菌水清洗固化顆粒3-4次，轉(zhuǎn)移至0.9％的生理鹽水中，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?)、木質(zhì)纖維素材料預(yù)處理：取木質(zhì)纖維素材料，用自來水清洗，然后粉碎、過40目篩、預(yù)處理、脫毒，之后在60-90℃下干燥至恒重，常溫保存?zhèn)溆?。所述木質(zhì)纖維素材料為玉米秸稈、玉米芯、小麥秸稈、水稻秸稈、高粱秸稈、油菜秸稈、甘蔗渣、木屑中的一種或多種混合。所述預(yù)處理為稀酸預(yù)處理、稀堿預(yù)處理、離子液預(yù)處理、蒸汽爆破預(yù)處理、氨纖維膨爆預(yù)處理、生物預(yù)處理中的一種，所述脫毒為水洗脫毒、過堿化處理、活性炭吸附、生物脫毒中的一種。4)、同步糖化、過濾與發(fā)酵：第一、預(yù)水解：將預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料加入水解反應(yīng)器中，用蒸餾水稀釋至固體含量5％-12％，加入纖維素酶10-35fpu/(g底物)，加入消泡劑，在50-55℃下攪拌100-200rpm，通過2m的naoh和2m的hcl維持水解反應(yīng)體系ph為4.5-5.5，在與發(fā)酵罐整合同步發(fā)酵前預(yù)水解24-48h。第二、發(fā)酵罐滅菌：發(fā)酵罐中加入不含主要碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的配方為：檸檬酸5g，谷氨酸20g，硫酸銨10g，k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，fecl3·6h2o0.02g，mnso4·h2o0.1g，cacl20.2g，補(bǔ)水至1000ml；加入消泡劑，使用蒸汽將發(fā)酵罐及培養(yǎng)基121℃滅菌20-40min，冷卻待用。第三、同步糖化、過濾與發(fā)酵：預(yù)水解后，將固定化的γ-聚谷氨酸菌株接種到培養(yǎng)基中，進(jìn)行同步糖化、過濾與發(fā)酵。使用蠕動泵將水解反應(yīng)器中木質(zhì)纖維素-酶混合物泵入錯(cuò)流膜過濾裝置中，流速為5-30l/min，滯留物泵回水解反應(yīng)器，含糖的濾出液以0.5-35ml/min的流速泵入發(fā)酵罐，供菌體發(fā)酵使用。同時(shí)發(fā)酵罐中液體以與濾出液相同的流速泵入水解反應(yīng)器中，維持體系的平衡。發(fā)酵罐中攪拌速度為400-600rpm，通氣量為1-1.5vvm，溫度為30-37℃，ph通過自動流加2mnaoh維持在5.5-7.0；發(fā)酵72-96h。第四、連續(xù)批次發(fā)酵：發(fā)酵72-96h后，取出發(fā)酵罐中的發(fā)酵液，將固定化的γ-聚谷氨酸留在發(fā)酵罐中，加入已滅菌的不含主要碳源的培養(yǎng)基，水解反應(yīng)器中補(bǔ)充木質(zhì)纖維素材料和酶，繼續(xù)進(jìn)行同步糖化、過濾與發(fā)酵48-72h，重復(fù)該操作，進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵。優(yōu)選的：所述的固定化細(xì)胞制備過程中采用的載體材料為海藻酸鈉、海藻酸鈣、聚乙烯醇、卡拉膠、聚氨酯泡沫、活性炭、陶瓷顆粒等的一種或多種。優(yōu)選的：所述同步糖化、過濾與發(fā)酵采用的設(shè)備包括水解反應(yīng)器、錯(cuò)流膜過濾裝置和通氣攪拌式發(fā)酵罐，所述水解反應(yīng)器和通氣攪拌式發(fā)酵罐中設(shè)置攪拌組件；所述水解反應(yīng)器通過第一連接管道與錯(cuò)流膜過濾裝置的進(jìn)液口連通，所述錯(cuò)流膜過濾裝置的出液口通過第二連接管道與通氣攪拌式發(fā)酵罐連通，所述通氣攪拌式發(fā)酵罐通過第三連接管道與水解反應(yīng)器連通；所述錯(cuò)流膜過濾裝置上設(shè)置回收管，所述回收管通入水解反應(yīng)器中；所述連接管道和回收管上均設(shè)置蠕動泵。優(yōu)選的：所述的錯(cuò)流膜過濾裝置中超濾膜材料為聚砜、聚砜酰胺、聚酰胺、磺化聚砜、聚丙烯腈、聚氯乙烯、偏聚氯乙烯、聚醚砜或聚醚酮或無機(jī)陶瓷膜的一種，膜的孔徑為0.22-0.45μm，有效面積0.025-0.25m2。本發(fā)明具有以下有益效果：1、生產(chǎn)成本低。本發(fā)明采用木質(zhì)纖維材料為碳源生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，顯著降低了γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)成本，使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的秸稈等固態(tài)廢棄物得到高效利用，達(dá)到了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。2、工藝簡單，生產(chǎn)效率高。本發(fā)明采用同步糖化、過濾和發(fā)酵工藝，實(shí)現(xiàn)了木質(zhì)纖維素材料水解和γ-聚谷氨酸發(fā)酵同步進(jìn)行，與現(xiàn)有技術(shù)中分步水解與發(fā)酵的方法相比，大大簡化了生產(chǎn)工藝。且水解過程中生產(chǎn)的糖及時(shí)被菌體消耗，避免了纖維素水解酶的產(chǎn)物抑制，提高了生產(chǎn)效率。同時(shí)，本發(fā)明將木質(zhì)素水解反應(yīng)和γ-聚谷氨酸發(fā)酵分別置于不同反應(yīng)器中，與現(xiàn)有技術(shù)相比，水解反應(yīng)與菌體發(fā)酵均是在其最適環(huán)境中進(jìn)行的，進(jìn)一步提高了生產(chǎn)效率，增加了木質(zhì)纖維素的利用率。3、能夠連續(xù)批次發(fā)酵。本發(fā)明采用的固定化細(xì)胞進(jìn)行γ-聚谷氨酸發(fā)酵，與現(xiàn)有的游離細(xì)胞發(fā)酵相比，發(fā)酵液和菌體更容易分離，實(shí)現(xiàn)了菌體的重復(fù)利用。在一次發(fā)酵完成后，分離出發(fā)酵液并重新加入培養(yǎng)基就可進(jìn)行下一次發(fā)酵，節(jié)約了不同批次間種子培養(yǎng)的成本，縮短了發(fā)酵時(shí)間，進(jìn)一步提高了γ-聚谷氨酸的生產(chǎn)效率。對以木質(zhì)纖維素為碳源生產(chǎn)γ-聚谷氨酸的工業(yè)放大具有重要意義。此外，本發(fā)明采用的錯(cuò)流膜過濾裝置中濾膜孔徑為0.22-0.45μm，具有除菌的效果。這樣不需要在水解反應(yīng)器中采取無菌操作，就可以使泵入發(fā)酵罐的含糖濾出液為無菌液體，進(jìn)一步簡化了工藝，也減少了能耗。附圖說明圖1為本發(fā)明同步糖化、過濾與發(fā)酵采用設(shè)備的結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施方式如圖1所示的同步糖化、過濾與發(fā)酵采用的設(shè)備，包括水解反應(yīng)器1、錯(cuò)流膜過濾裝置2和通氣攪拌式發(fā)酵罐3，所述水解反應(yīng)器1和通氣攪拌式發(fā)酵罐3中設(shè)置攪拌組件。這里的攪拌組件可以通過多種結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)其攪拌功能，例如所述攪拌組件是一根由電機(jī)驅(qū)動的攪拌軸，所述攪拌軸的末端固定有攪拌葉，或者所述攪拌組件包括一個(gè)磁力攪拌器和多個(gè)攪拌子，所述磁力攪拌器位于水解反應(yīng)器1和通氣攪拌式發(fā)酵罐3的底部，攪拌子位于水解反應(yīng)器1和通氣攪拌式發(fā)酵罐3內(nèi)部，在磁力作用下完成攪拌。如圖1所示，所述水解反應(yīng)器1通過第一連接管道與錯(cuò)流膜過濾裝置2的進(jìn)液口連通，所述第一連接管道的作用是將水解后的混合物由水解反應(yīng)器1向錯(cuò)流膜過濾裝置2輸送。所述錯(cuò)流膜過濾裝置2的出液口通過第二連接管道與通氣攪拌式發(fā)酵罐3連通，所述第二連接管的作用是由錯(cuò)流膜過濾裝置2向通氣攪拌式發(fā)酵罐3輸送含糖濾出液。所述通氣攪拌式發(fā)酵罐3通過第三連接管道與水解反應(yīng)器1連通，所述第三連接管道的作用是由通氣攪拌式發(fā)酵罐3向水解反應(yīng)器1輸送發(fā)酵液。所述錯(cuò)流膜過濾裝置2上設(shè)置回收管，所述回收管通入水解反應(yīng)器1中，回收管的作用是由錯(cuò)流膜過濾裝置2向水解反應(yīng)器1輸送未通過過濾裝置的滯留物。所述連接管道和回收管上均設(shè)置蠕動泵5，所述蠕動泵5為各個(gè)管道的輸送提供動力。進(jìn)一步的，所述的錯(cuò)流膜過濾裝置2中超濾膜材料為聚砜、聚砜酰胺、聚酰胺、磺化聚砜、聚丙烯腈、聚氯乙烯、偏聚氯乙烯、聚醚砜或聚醚酮或無機(jī)陶瓷膜的一種，膜的孔徑為0.22-0.45μm，有效面積0.025-0.25m2。這樣的膜孔徑具有除菌的效果，可省去在水解反應(yīng)器中采取無菌操作，使泵入發(fā)酵罐的含糖濾出液為無菌液體，進(jìn)一步簡化了工藝，也減少了能耗。本發(fā)明同步糖化、過濾與發(fā)酵采用的設(shè)備在使用時(shí)，先將木質(zhì)纖維素加入水解反應(yīng)器1中進(jìn)行預(yù)處理，并向通氣攪拌式發(fā)酵罐3中加入不含主要碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基。將固定化的菌株jx-12接種到培養(yǎng)基中，然后打開各個(gè)管道上的蠕動泵5，使水解反應(yīng)器1中的混合物通過第一連接管道進(jìn)入錯(cuò)流膜過濾裝置2中，通過錯(cuò)流膜過濾裝置2的濾出液經(jīng)第二連接管道進(jìn)入通氣攪拌式發(fā)酵罐3中，滯留物經(jīng)回收管回到水解反應(yīng)器1中。同時(shí)，通氣攪拌式發(fā)酵罐3中的發(fā)酵液通過第三連接管道進(jìn)入水解反應(yīng)器1中，形成完整的循環(huán)，維持體系平衡。下面具體提供優(yōu)選的實(shí)施例，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更加清楚本發(fā)明的技術(shù)方案和效果，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例一以玉米秸稈為主要原料生產(chǎn)γ-聚谷氨酸：1)、種子培養(yǎng)：將低溫凍存的解淀粉芽孢桿菌jx-12接種于無菌的活化培養(yǎng)基斜面，活化培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g，牛肉膏5g，nacl5g，瓊脂19g，ph7.0～7.4，補(bǔ)水至1000ml，在121℃滅菌30min。在37℃條件下培養(yǎng)24小時(shí)活化，將已活化的菌種接種于無菌的種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g，牛肉膏5g，nacl5g，ph7.0～7.4，補(bǔ)水至1000ml，在121℃滅菌30min。在30℃、200rpm的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24小時(shí)，即得種子液。2)、固定化細(xì)胞制備：將種子液在5000rpm、4℃條件下離心20min，棄上清液，用無菌的0.9％生理鹽水沖洗3次，用無菌水將菌體懸浮，并稀釋至濃度為106cfu/ml。取3％海藻酸鈉溶液200ml，與50ml上述細(xì)胞懸液混合，使用滴管將混合溶液逐滴加入無菌的50g/l的cacl2溶液中，即可形成3-5mm固定化凝膠顆粒，30min后棄cacl2溶液，使用無菌水清洗凝膠顆粒4次，加入無菌的0.9％的生理鹽水，4℃保存?zhèn)溆谩?)、木質(zhì)纖維素材料預(yù)處理：將玉米秸稈用自來水清洗，干燥后粉碎、過40目篩，加入2.0％的h2so4溶液，至固體含量為10％，121℃蒸煮3h,迅速冷卻，使用自來水清洗4次，直至洗出的液體為中性，60℃干燥至恒重。4)、同步糖化、過濾與發(fā)酵：第一、預(yù)水解：將500g預(yù)處理的玉米秸稈粉加入水解反應(yīng)器1中，加入5l蒸餾水、纖維素酶20fpu/(g底物)、5ml消泡劑，在50℃、150rpm下攪拌24h，體系ph維持在4.5-5.5。第二、發(fā)酵罐滅菌：向5l通氣攪拌式發(fā)酵罐3中加入3l不含主要碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：檸檬酸15g，谷氨酸60g，硫酸銨30g，k2hpo43g，mgso4·7h2o1.5g，fecl3·6h2o0.06g，mnso4·h2o0.3g，cacl20.6g，補(bǔ)水至3l；加入6ml消泡劑，使用蒸汽將發(fā)酵罐及培養(yǎng)基121℃滅菌30min，冷卻待用。第三、同步糖化、過濾與發(fā)酵：預(yù)水解后，將150g固定化的菌株jx-12接種到3l培養(yǎng)基中，打開各個(gè)管道上的蠕動泵，將水解反應(yīng)器1與通氣攪拌式發(fā)酵罐3連接在一起。使水解反應(yīng)器1中木質(zhì)纖維素-酶混合物泵入錯(cuò)流膜過濾裝置2中，錯(cuò)流膜過濾裝置2中設(shè)置孔徑0.22μm的陶瓷膜，有效面積為0.25㎡，流速為30l/min，滯留物泵回水解反應(yīng)器1，含糖的濾出液以35ml/min的流速泵入通氣攪拌式發(fā)酵罐3。同時(shí)通氣攪拌式發(fā)酵罐3中液體以35ml/min的流速泵入水解反應(yīng)器1中，維持體系的平衡。發(fā)酵罐中攪拌速度為400rpm，通氣量為12vvm，溫度為30℃，ph通過自動流加2mnaoh維持在7.0,發(fā)酵96h。取發(fā)酵液，過濾除菌，加入3倍體積的乙醇，離心提純γ-聚谷氨酸，110℃真空酸水解24h,衍生后，通過高效液相色譜測定γ-聚谷氨酸產(chǎn)量。第四、連續(xù)批次發(fā)酵：發(fā)酵96h后，取出通氣攪拌式發(fā)酵罐3中的發(fā)酵液，將固定化的γ-聚谷氨酸留在通氣攪拌式發(fā)酵罐3中，加入3l已滅菌的不含主要碳源的培養(yǎng)基，水解反應(yīng)器1中補(bǔ)充200g經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸稈和4000fpu的纖維素酶，繼續(xù)進(jìn)行同步糖化、過濾與發(fā)酵72h，如此重復(fù)三個(gè)批次，測定每批次中γ-聚谷氨酸產(chǎn)量。檢測結(jié)果如下表2所示：。表2.以玉米秸稈為主要原料同步糖化、過濾與發(fā)酵連續(xù)批次生產(chǎn)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量批次γ-聚谷氨酸產(chǎn)量(g/l)115.4218.8319.2418.5實(shí)施例二以玉米秸稈為主要原料生產(chǎn)γ-聚谷氨酸：1)、種子培養(yǎng)：將低溫凍存的解淀粉芽孢桿菌jx-12接種于無菌的活化培養(yǎng)基斜面，活化培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g，牛肉膏5g，nacl5g，瓊脂19g，ph7.0～7.4，補(bǔ)水至1000ml，在121℃滅菌30min。在37℃條件下培養(yǎng)24小時(shí)活化，將已活化的菌種接種于無菌的種子培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g，牛肉膏5g，nacl5g，ph7.0～7.4，補(bǔ)水至1000ml，在121℃滅菌30min。在30℃、200rpm的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24小時(shí)，即得種子液。2)、固定化細(xì)胞制備：將種子液在5000rpm、4℃條件下離心20min，棄上清液，用無菌的0.9％生理鹽水沖洗3次，用無菌水將菌體懸浮，并稀釋至濃度為106cfu/ml。將聚氨酯泡沫裁剪成1cm3左右的小塊，取400ml10％聚乙烯醇溶液，與80ml上述菌懸液混合，將100粒聚氨酯泡沫浸入聚乙烯醇菌株混合溶液，待混合溶液充分浸入泡沫的縫隙中后，將帶有菌液的聚氨酯泡沫轉(zhuǎn)移到飽和硼酸溶液中，于4℃冰箱中交聯(lián)固化20h，用無菌水洗滌4次，將固定化細(xì)胞顆粒浸在0.9％的生理鹽水，4℃冰箱中保存待用。3)、木質(zhì)纖維素材料預(yù)處理：將玉米秸稈用自來水清洗，干燥后粉碎、過40目篩，加入2.0％的h2so4溶液，至固體含量為10％，121℃蒸煮3h,迅速冷卻，使用自來水清洗4次，直至洗出的液體為中性，60℃干燥至恒重。4)、同步糖化、過濾與發(fā)酵：第一、預(yù)水解：將500g預(yù)處理的玉米秸稈粉加入水解反應(yīng)器1中，加入5l蒸餾水、纖維素酶20fpu/(g底物)、5ml消泡劑，在50℃、150rpm下攪拌24h，體系ph維持在4.5-5.5。第二、發(fā)酵罐滅菌：向5l通氣攪拌式發(fā)酵罐3中加入3l不含主要碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：檸檬酸15g，谷氨酸60g，硫酸銨30g，k2hpo43g，mgso4·7h2o1.5g，fecl3·6h2o0.06g，mnso4·h2o0.3g，cacl20.6g，補(bǔ)水至3l；加入6ml消泡劑，使用蒸汽將發(fā)酵罐及培養(yǎng)基121℃滅菌30min，冷卻待用。第三、同步糖化、過濾與發(fā)酵：預(yù)水解后，將60粒聚乙烯醇-聚氨酯固定化的菌株jx-12接種到3l培養(yǎng)基中，打開各個(gè)管道上的蠕動泵，將水解反應(yīng)器1與通氣攪拌式發(fā)酵罐3連接在一起。使水解反應(yīng)器1中木質(zhì)纖維素-酶混合物泵入錯(cuò)流膜過濾裝置2中，錯(cuò)流膜過濾裝置2中設(shè)置孔徑0.22μm的陶瓷膜，有效面積為0.25㎡，流速為30l/min，滯留物泵回水解反應(yīng)器1，含糖的濾出液以35ml/min的流速泵入通氣攪拌式發(fā)酵罐3。同時(shí)通氣攪拌式發(fā)酵罐3中液體以35ml/min的流速泵入水解反應(yīng)器1中，維持體系的平衡。發(fā)酵罐中攪拌速度為400rpm，通氣量為12vvm，溫度為30℃，ph通過自動流加2mnaoh維持在7.0,發(fā)酵96h。取發(fā)酵液，過濾除菌，加入3倍體積的乙醇，離心提純γ-聚谷氨酸，110℃真空酸水解24h,衍生后，通過高效液相色譜測定γ-聚谷氨酸產(chǎn)量。第四、連續(xù)批次發(fā)酵：發(fā)酵96h后，取出通氣攪拌式發(fā)酵罐3中的發(fā)酵液，將固定化的γ-聚谷氨酸留在通氣攪拌式發(fā)酵罐3中，加入3l已滅菌的不含主要碳源的培養(yǎng)基，水解反應(yīng)器1中補(bǔ)充200g經(jīng)過預(yù)處理的玉米秸稈和4000fpu的纖維素酶，繼續(xù)進(jìn)行同步糖化、過濾與發(fā)酵72h，如此重復(fù)三個(gè)批次，測定每批次中γ-聚谷氨酸產(chǎn)量。檢測結(jié)果如下表3所示：。表3.以玉米秸稈為主要原料使用聚乙烯醇和聚氨酯泡沫固定化細(xì)胞同步糖化、過濾與發(fā)酵連續(xù)批次生產(chǎn)γ-聚谷氨酸產(chǎn)量批次γ-聚谷氨酸產(chǎn)量(g/l)121.3223.5320.4421.7核苷酸或氨基酸序列表sequencelisting<110>中國科學(xué)院成都生物研究所<120>高產(chǎn)γ-pga菌株及應(yīng)用其生產(chǎn)γ-pga的方法<160>1<210>1<211>1495<212>dna<213>芽孢桿菌(bacillussp.)<400>1cctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatgg60gagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgta120agactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggt180tcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctag240ttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggc300cacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccg360caatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaa420agctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacct480aaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcg540ttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaag600cccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggaga660gtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaag720gcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggatta780gataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgcccc840ttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaa900ctcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaa960cgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtcccct1020tcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttggg1080ttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactct1140aaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgcccc1200ttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgag1260gttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgt1320gaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggcct1380tgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacct1440ttaaggagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgtaacaag1495當(dāng)前第1頁12