本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)β-苯乙醇的釀酒酵母菌株及其應(yīng)用，屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

β-苯乙醇是一種具有玫瑰風(fēng)味的芳香醇，天然存在于茉莉、玫瑰等植物精油中，同時作為一種重要的香精香料成分，在化妝品、煙草及日化用品中也廣泛應(yīng)用。β-苯乙醇由微生物代謝產(chǎn)生，在黃酒、料酒、釀造食醋、醬油、白酒等發(fā)酵產(chǎn)品中含量較高，同時作為發(fā)酵產(chǎn)品中特征的風(fēng)味物質(zhì)，可以提高發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味和整體品質(zhì)。

目前，工業(yè)合成β-苯乙醇過程中會存在難以去除的副產(chǎn)物，存在致癌風(fēng)險，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量，雖然從天然植物中物理提取可以獲得無毒無害、質(zhì)量上乘的β-苯乙醇，用于食品或其他產(chǎn)品生產(chǎn)，但是生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量低、價格高，難以滿足市場需求。

通過微生物發(fā)酵能夠提高發(fā)酵食品中β-苯乙醇含量，所獲產(chǎn)品屬于天然食品。釀酒酵母在發(fā)酵過程中通過艾利希途徑和其他代謝途徑產(chǎn)生β-苯乙醇，在黃酒等發(fā)酵食品中β-苯乙醇含量可以達(dá)到100mg/l左右，雖然濃度已經(jīng)較高，但是進(jìn)一步提高β-苯乙醇對于提升黃酒風(fēng)味顯著。

雖然目前已有能夠顯著提高微生物產(chǎn)β-苯乙醇能力的措施，但是絕大多數(shù)都需要外源添加l-苯丙氨酸等前體化合物。另外，少數(shù)非釀酒酵母類的酵母如庫德里阿紫威畢赤酵母(pichiakudriavzevii)、馬克斯克魯維酵母(marxkluyveromyces)可以在不外源添加l-苯丙氨酸的情況下，產(chǎn)生一定濃度的β-苯乙醇，用于提高發(fā)酵食品中β-苯乙醇濃度，但是由于非釀酒酵母產(chǎn)乙醇能力較低，不能夠作為主要菌株用于酒類及醋的釀造。rafael等(overproductionof2-phenylethanolbyindustrialyeaststoimproveorganolepticpropertiesofbakers'products,internationaljournaloffoodmicrobiology,2014,180(1):7-12.)中報道了一株高產(chǎn)β-苯乙醇面包酵母在烘焙食品中的應(yīng)用，并未對所報酵母的產(chǎn)酒精特性做出報道，其所應(yīng)用范圍為烘焙食品。另外雖然有多個具有產(chǎn)生一定濃度的釀酒酵母應(yīng)用于釀造食品的報道，但是菌株是否具有較高的酒精生產(chǎn)能力尚不清楚。由于β-苯乙醇對酵母的脅迫能力顯著高于乙醇，高產(chǎn)β-苯乙醇的釀酒酵母產(chǎn)乙醇的能力通常會有降低，所以已有高產(chǎn)β-苯乙醇的釀酒酵母的酒精生產(chǎn)能力較低，因此在不外源添加前體化合物情況下，能夠高產(chǎn)β-苯乙醇和乙醇的釀酒酵母在釀造工業(yè)中具有較高應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一株不添加外源氨基酸而具有高產(chǎn)β-苯乙醇特性且產(chǎn)酒精特性良好的釀酒酵母菌株，及其在黃酒、料酒、釀造食醋、醬油、白酒中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個目的是提供一株高產(chǎn)β-苯乙醇的釀酒酵母菌株(saccharomycescerevisiae)，于2016年12月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為cctccno:m2016785。

本發(fā)明所述釀酒酵母菌株是從黃酒醪液篩選出的釀酒酵母作為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變后進(jìn)行對氟苯丙氨酸抗性篩選，然后篩選長勢良好的菌株接種在含有10％乙醇的ypd液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行酒精耐受性篩選以及黃酒模擬液發(fā)酵篩選，得到的β-苯乙醇產(chǎn)量相對較高的菌株作為常溫等壓等離子誘變出發(fā)菌株，對二次誘變后菌株進(jìn)行對氟苯丙氨酸抗性篩選，以及發(fā)酵特性篩選，得到高產(chǎn)β-苯乙醇釀酒酵母。

本發(fā)明的釀酒酵母，具有如下特性：

(1)應(yīng)用于黃酒發(fā)酵體系，發(fā)酵所得黃酒中β-苯乙醇含量可達(dá)410mg/l，乙酸-2-苯乙酯含量為56μg/l，酒精度14％(v/v)；

(2)應(yīng)用于料酒發(fā)酵體系，發(fā)酵所得料酒中β-苯乙醇含量可達(dá)450mg/l，乙酸-2-苯乙酯含量為50μg/l，酒精度13％(v/v)；

(3)在釀造食醋發(fā)酵中的應(yīng)用，使用本發(fā)明的釀酒酵母代替酒母，所得酒醪再經(jīng)醋酸發(fā)酵，釀造食醋中β-苯乙醇含量為300mg/l，乙酸-2-苯乙酯含量為45μg/l；

(4)在醬油中的應(yīng)用，將所述釀酒酵母接種于醬油發(fā)酵體系，發(fā)酵所得醬油中β-苯乙醇含量為200mg/l；

(5)在白酒中的應(yīng)用，將所述釀酒酵母接種于白酒發(fā)酵體系，蒸餾白酒中β-苯乙醇含量為110mg/l，乙酸-2-苯乙酯含量為64μg/l，酒精度可達(dá)60％(v/v)。

(6)菌落為白色，圓形或者橢圓形，邊緣整齊。

本發(fā)明的第二個目的是提供所述含有所述釀酒酵母cctccno:m2016785菌株的微生物菌劑。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述微生物菌劑含有釀酒酵母cctccno:m2016785菌體的活細(xì)胞、冷凍干燥得到的釀酒酵母cctccno:m2016785干菌體、固定化的釀酒酵母cctccno:m2016785細(xì)胞、釀酒酵母cctccno:m2016785的液體菌劑、釀酒酵母cctccno:m2016785的固體菌劑，或者以其他任何形式存在的釀酒酵母cctccno:m2016785菌株。

本發(fā)明的第三個目的是提供所述釀酒酵母菌株或者微生物菌劑的應(yīng)用。

在一種實施方式中，所述應(yīng)用是指用于釀造技術(shù)領(lǐng)域。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種釀造食品，所述釀造食品是釀酒酵母cctccno:m2016785為發(fā)酵劑或者主要發(fā)酵劑發(fā)酵得到的。

在一種實施方式中，所述釀造食品為酒類、食醋或醬油。所述酒類包括但不限于黃酒、料酒、白酒等。

在一種實施方式中，所述釀造食品為黃酒，使用所述的釀酒酵母作為酒母。

在一種實施方式中，所述黃酒的釀造是將所述釀酒酵母作為酒母，按照5％-10％的添加量添加到蒸煮或糊化好的原料中，經(jīng)發(fā)酵、壓榨、煎酒、陳釀、過濾、滅菌灌裝得到黃酒。

在一種實施方式中，所述黃酒的釀造具體是：先將所述釀酒酵母培養(yǎng)制備酒母，然后按照總體積4％加入麥曲、按總體積10％加入酒母到高溫糊化好的糯米中，攪拌均勻，然后經(jīng)發(fā)酵、壓榨、煎酒、陳釀、過濾、滅菌灌裝得到黃酒。

在一種實施方式中，所述釀造食品為料酒。

在一種實施方式中，所述料酒的釀造是先利用所述釀酒酵母作為酒母釀造得到黃酒，再利用得到的黃酒制備成料酒。

在一種實施方式中，所述釀造食品為食醋。

在一種實施方式中，所述食醋的釀造是先利用所述釀酒酵母作為酒母釀造得到黃酒，再利用得到的黃酒作為醋酸發(fā)酵原料來釀造食醋。

在一種實施方式中，所述食醋是采用固態(tài)發(fā)酵或者液態(tài)發(fā)酵的方法釀造。

在一種實施方式中，所述釀造食品為醬油。

在一種實施方式中，所述醬油的釀造是采用高鹽稀態(tài)發(fā)酵或者低鹽固態(tài)發(fā)酵制備醬油。

在一種實施方式中，所述高鹽稀態(tài)發(fā)酵制備醬油具體是：將豆粕和小麥混勻蒸熟，接種米曲霉，加入鹽水使醬醪含鹽量為18％、含水量為65％，攪拌混勻；然后將培養(yǎng)好的cctccno:m2016785酵母接入部分蒸熟冷卻后的豆粕和小麥中，加入清水，培養(yǎng)制成cctccno:m2016785酒母，等待加入醬醪中；當(dāng)醬醅溫度在發(fā)酵過程中升高到20℃時接入cctccno:m2016785酒母；發(fā)酵時間為5個月；發(fā)酵結(jié)束后的醬醪經(jīng)過壓榨、過濾、澄清，得到醬油。

一種實施方式中，所述低鹽固態(tài)發(fā)酵制備醬油具體是：豆粕和小麥混勻蒸熟，接種米曲霉量，加入鹽水使醬醪含鹽量為7％、含水量為40％，攪拌混勻；然后將培養(yǎng)好的cctccno:m2016785酵母接入部分蒸熟冷卻后的豆粕和小麥中，加入清水，培養(yǎng)制成cctccno:m2016785酒母，接入醬醪發(fā)酵體系，品溫控制在40℃；發(fā)酵時間為15d；發(fā)酵結(jié)束后的醬醪去除雜質(zhì)和沉淀、過濾澄清得到醬油。

一種實施方式中，所述釀造食品為白酒。

一種實施方式中，所述白酒的釀造，是在白酒發(fā)酵入池發(fā)酵時額外添加所述釀酒酵母。

一種實施方式中，所述白酒釀造時釀酒酵母額外添加量為1％。

本發(fā)明的優(yōu)點和效果：

(1)本發(fā)明獲得了一株不添加外源氨基酸而具有高產(chǎn)β-苯乙醇特性且產(chǎn)酒精特性良好的釀酒酵母菌株。

(2)本發(fā)明的釀酒酵母菌株可以用于黃酒、料酒、食醋、醬油、白酒的釀造；應(yīng)用于這些產(chǎn)品的釀造時，不僅可以產(chǎn)生高濃度的β-苯乙醇、具有較高的酒精生產(chǎn)能力，而且可有效提高其他風(fēng)味成分或者有益成分的含量，比如乙酸-2-苯乙酯、甘油的含量。

生物材料保藏

一株釀酒酵母菌株，分類學(xué)命名為釀酒酵母byc3saccharomycescerevisiaebyc3，于2016年12月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為cctccno:m2016785。

附圖說明

圖1是實施例1中出發(fā)酵母菌株生長曲線；

圖2是實施例1中出發(fā)酵母菌株紫外照射致死率曲線；

圖3是實施例1中出發(fā)菌株對氟苯丙氨酸致死率曲線；

圖4是實施例2中黃酒發(fā)酵酒精度變化曲線；

圖5是實施例2中黃酒發(fā)酵酸度變化曲線；

圖6是實施例2中黃酒發(fā)酵ph變化曲線；

圖7是實施例2中byc3釀酒酵母菌落形態(tài)；

圖8是實施例2中釀酒酵母菌株在ypd中β-苯乙醇產(chǎn)量。

具體實施方案

下面是對本發(fā)明進(jìn)行具體描述。

實施例1：紫外誘變與篩選

ypd液體培養(yǎng)基：酵母提取物10g/l、魚粉蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l。

ypd固體培養(yǎng)基：酵母提取物10g/l、魚粉蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l，營養(yǎng)瓊脂20g/l。

1、誘變出發(fā)菌株的獲得

(1)從甘油保藏管中取由本實驗室從黃酒醪液篩選的釀酒酵母菌液200ul，涂布ypd平板，30℃培養(yǎng)24h。

(2)用接種環(huán)挑取單菌落到含100mlypd液體培養(yǎng)基的搖瓶，30℃、200r/min培養(yǎng)24h。

(3)取5ml所得菌液，接種到含100mlypd液體培養(yǎng)基的搖瓶，30℃、200r/min培養(yǎng)，每隔1h測定菌液的od600，酵母指數(shù)增長期結(jié)束后每隔3h測定od600，每次取三個樣品。繪制生長曲線，確定出發(fā)菌株指數(shù)增長中期時間即是紫外誘變開始時間，此時的菌株即為誘變出發(fā)菌株。

實驗結(jié)果如附圖1中所示：培養(yǎng)到3-5h時酵母od600值增長顯著，此時酵母生長處于指數(shù)生長期，而搖床培養(yǎng)4h時野生菌株處于指數(shù)生長中期。因此選擇搖床培養(yǎng)4h的酵母作為誘變出發(fā)菌株。

2、紫外誘變時間的確定

(1)如步驟1，獲得誘變出發(fā)酵母菌株菌液。

(2)取10ml誘變出發(fā)菌株菌懸液，6000r/min離心5min后去上清，加入50ml生理鹽水震蕩混勻，6000r/min離心5min后去上清，加入50ml生理鹽水震蕩混勻得到菌懸液。

(3)紫外線照射：先將紫外燈打開預(yù)熱20min，以穩(wěn)定光波。用5ml無菌移液管移取上述菌懸液4.5ml于無菌的直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中加入無菌大頭針。將裝有菌懸液的培養(yǎng)皿放置于磁力攪拌器上，垂直放置于紫外燈下，照射20s，黑暗條件下打開皿蓋(確保紫外燈照射均勻)，暴露紫外光下照射(15w紫外燈，距離30cm)，時間為40s、60s、80s、100s、120s。

(4)照射完畢后，在紅光燈下或者黑暗條件下，將誘變后的酵母菌懸液以10倍稀釋法稀釋4個梯度10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，每個梯度各取200μl涂布ypd平板，用錫紙包好以避光。每個照射時間下三個平行，30℃培養(yǎng)48h。

(5)未經(jīng)誘變的酵母菌懸液以10倍稀釋法稀釋5個梯度10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5，每個梯度各取200μl涂布ypd平板，作為對照。對照組做三個平行，30℃培養(yǎng)48h。

(6)平板計數(shù)，記錄表格，計算致死率，繪制致死率曲線。分別確定紫外致死率為70％-80％、80％-90％、90％-100％時紫外照射時間。致死率＝(對照組菌落數(shù)一誘變組菌落數(shù))/對照組菌落數(shù)。

實驗結(jié)果：誘變出發(fā)菌株進(jìn)行紫外誘變，涂布不同濃度梯度菌懸液到y(tǒng)pd平板，根據(jù)生長菌落數(shù)，繪制致死率曲線，結(jié)果如附圖2。根據(jù)致死率曲線圖，致死率70-80％、80-90％、90-100％時照射時間分別為110s、130s、150s。

3、對氟苯丙氨酸最低全部致死濃度的確定

ynbp固體培養(yǎng)基：6.7％ynb、20g/l葡萄糖、10g/l脯氨酸，額外的加入對氟苯丙氨酸，濃度分別為0(對照組)、0.04g/l、0.05g/l、0.06g/l、0.07g/l、0.08g/l、0.09g/l、0.1g/l。

(1)指數(shù)增長中期菌懸液，10倍稀釋法稀釋4個梯度10^-1、10^-2、10^-3、10^-4，取10^-4梯度菌懸液200μl涂布ynbp平板。

(2)30℃培養(yǎng)48-72h。記錄菌落數(shù)，繪制對氟苯丙氨酸致死率曲線。

致死率＝(對照組菌落數(shù)一誘變組菌落數(shù))/對照組菌落數(shù)

實驗結(jié)果：對氟苯丙氨酸致死率曲線如附圖3，隨著ynbp平板上對氟苯丙氨酸濃度的增加，酵母致死率不斷增加，對氟苯丙氨酸濃度增加到0.09g/l時酵母全部致死，因此對氟苯丙氨酸最低全部致死濃度確定為0.09g/l。

4、紫外誘變

如步驟2獲得紫外誘變出發(fā)菌株并對其進(jìn)行紫外照射，紫外誘變總時間分別為110s、130s、150s。

5、對氟苯丙氨酸抗性篩選和酒精耐受性篩選

(1)對氟苯丙氨酸抗性篩選

對氟苯丙氨酸抗性篩選培養(yǎng)基配方：6.7％ynb、20g/l葡萄糖、10g/l脯氨酸、對氟苯丙氨酸0.09g/l，營養(yǎng)瓊脂20g/l。

分別取紫外誘變菌懸液200μl涂布到對氟苯丙氨酸抗性篩選平板，用錫紙包好以避光。每個致死率下做3個平板，30℃培養(yǎng)72h。

(2)酒精耐受性篩選

酒精篩選培養(yǎng)基配方：酵母提取物10g/l、魚粉蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l，無菌乙醇10％。

1)96孔板每孔加入20μlypd液體培養(yǎng)基，將對氟苯丙氨酸抗性篩選后的突變菌株分別接種到孔中，30℃培養(yǎng)24h。

2)96孔板每孔加入200μl酒精篩選培養(yǎng)基，將上一步每孔的種子液按5％接種到此孔板，30℃靜止培養(yǎng)。分別在12h和24h用酶標(biāo)儀測定od600。

3)計算od60012h、od60024h以及od60024h-od60012h值，挑選數(shù)值相對較高的誘變酵母菌共計22株。

6、黃酒模擬液發(fā)酵篩選

黃酒模擬液的制備：1kg蒸熟米飯(含水率為70％)中加入水1l、麥曲0.05kg，攪拌均勻，60℃保溫8h，4500r/min離心5min，取上清液115℃滅菌15min。

(1)將22株突變菌株，分別劃線到y(tǒng)pd平板上，30℃培養(yǎng)24h。

(2)分別挑取單菌落，接種到含有10mlypd的50ml離心管中，30℃、200r/min培養(yǎng)12h。

(3)移取5％菌液，接種到含有20ml黃酒模擬液的50離心管中，30℃，靜止發(fā)酵7d，每組三個平行。

(4)高效液相色譜法測定黃酒模擬液中β-苯乙醇含量，篩選β-苯乙醇含量相對較高的菌株。

高效液相色譜分析：

1)將2ml樣品放入2ml離心管中離心去除菌體，離心條件為12000rpm、1min。

2)取上清液1ml過0.22μm水系膜，移入液相進(jìn)樣瓶中備用。

3)選用x-bridgec18柱，流動相為甲醇:純水＝1:1，在30℃條件下以1ml/min的流速進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10ul。

高效液相色譜測定黃酒模擬發(fā)酵液中β-苯乙醇含量，1-e4突變菌株的β-苯乙醇平均含量相對較高為185.032mg/l(如表1所示)，產(chǎn)酒精能力優(yōu)良，因此將此菌株作為下一輪常溫等壓等離子誘變的出發(fā)菌株。

表1紫外誘變后黃酒模擬發(fā)酵液中β-苯乙醇含量

實施例2：常溫等壓等離子誘變與篩選

1、常溫等壓等離子誘變與黃酒模擬液發(fā)酵篩選

第一輪紫外誘變后所選菌株1-e4作為常溫等壓等離子誘變出發(fā)菌株。1-e4菌株ypd搖瓶30℃培養(yǎng)24h，用生理鹽水制成od600為0.6-0.8的菌懸液，進(jìn)行常溫等壓等離子誘變，誘變時間為60s，功率為100w，將誘變后菌株重懸成菌液，稀釋涂布于ypd平板，30℃培養(yǎng)48h，將單菌落劃線到y(tǒng)nbp平板(對氟苯丙氨酸濃度為0.5g/l)，ynbp平板長勢良好菌株進(jìn)行黃酒模擬液發(fā)酵篩選。高效液相色譜法測定黃酒模擬液中β-苯乙醇含量，篩選β-苯乙醇含量相對較高的菌株。

高效液相色譜法測定發(fā)酵8d后的黃酒模擬發(fā)酵液中β-苯乙醇含量。3-c10、4-c7、5-f5突變菌株β-苯乙醇平均含量相對較高，分別為217.192mg/l、257.388mg/l、337.168mg/l，將該三株菌株分別命名為byc1、byc2、byc3。釀酒酵母β-苯乙醇產(chǎn)量增加，雖然誘變后釀酒酵母乙醇產(chǎn)量略有下降，但是所得釀酒酵母仍可良好進(jìn)行酒精發(fā)酵。

表2常溫等壓等離子誘變黃酒模擬發(fā)酵液中β-苯乙醇含量

2、黃酒發(fā)酵篩選

酒母制備：50mlypd搖瓶接種酵母菌株，30℃、200r/min培養(yǎng)24h。1kg蒸熟米飯(含水率為70％)中加入水1l、麥曲0.05kg，攪拌均勻，60℃保溫4h，冷卻后按5％接種酵母菌液，30℃、200r/min培養(yǎng)16h。

(1)配料

蒸熟米飯(含水率為70％)加入等重量清水，2％麥曲、5％酒母，攪拌均勻。

(2)發(fā)酵與攪拌

發(fā)酵溫度為28℃，在配料完成后18h、24h、30h、42h、54h、78h，126h攪拌并取樣。5000r/min離心10min得到上清液樣品，用于指標(biāo)檢測。

(3)指標(biāo)檢測

18h、24h、30h、42h、54h、78h、126h時所取樣品測定其總酸(以乳酸計)、酒精度、ph，觀察三項指標(biāo)變化情況，并用高效液相色譜法測定126h時樣品中β-苯乙醇含量。

用本輪誘變出發(fā)菌株和三株篩選后突變酵母菌株發(fā)酵黃酒，產(chǎn)酒精能力結(jié)果如圖4：三株正突變菌株和出發(fā)菌株相比，產(chǎn)酒精性能基本沒有差別，酒精度達(dá)13％-15％(v/v)，酒精發(fā)酵良好。三株酵母在前60h時酒精發(fā)酵迅速，在60h后酒精含量基本穩(wěn)定。酸度變化結(jié)果如圖5：三株突變酵母發(fā)酵黃酒酸度在3-4g/l之間，隨著發(fā)酵進(jìn)行酸度略顯上升且趨于平緩。ph變化如圖6：ph在3-4.5之間，釀酒酵母可以良好的進(jìn)行酒精發(fā)酵。

黃酒發(fā)酵液中β-苯乙醇含量如下表3所示，用byc1、byc2、byc3菌株發(fā)酵黃酒，β-苯乙醇含量為219.08、254.91、365.70mg/l，出發(fā)菌株發(fā)酵黃酒β-苯乙醇產(chǎn)量僅為188.07mg/l，三株菌株β-苯乙醇產(chǎn)量分別為出發(fā)菌株的1.16倍、1.35倍、1.94倍，有良好的高產(chǎn)β-苯乙醇能力。

表3常溫等壓等離子誘變黃酒發(fā)酵液中β-苯乙醇含量

黃酒發(fā)酵液中異丁醇、異戊醇、乙酸-2-苯乙酯、甘油作為風(fēng)味物質(zhì)，可以提高黃酒整體質(zhì)量，其含量見表4，通過比較，byc3菌株的乙酸-2-苯乙酯以及甘油含量明顯高于出發(fā)菌株以及byc1及byc2。

表4黃酒發(fā)酵液中異丁醇、異戊醇、乙酸-2-苯乙酯、甘油含量表

綜上比較結(jié)果，byc3的β-苯乙醇產(chǎn)量高，且異丁醇、異戊醇、乙酸-2-苯乙酯含量也較高。byc3菌株劃線到y(tǒng)pd固體培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)24h，菌落形態(tài)如圖7。將byc3菌株于保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctccno:m2016785。將byc3菌株接種于黃酒發(fā)酵體系，酒精發(fā)酵性能良好，所得黃酒中β-苯乙醇含量為365.70mg/l。

3、高產(chǎn)β-苯乙醇酵母菌株驗證性實驗

用byc3菌株、商業(yè)酵母菌株、野生酵母菌株進(jìn)行對比發(fā)酵實驗。三株菌株用ypd平板活化后接入ypd搖瓶，再分別按5％依次接入ypd搖瓶、ypd搖瓶(加入1g/l苯丙氨酸的)。

實驗結(jié)果如附圖8，釀酒酵母菌株byc3的β-苯乙醇產(chǎn)量明顯高于商業(yè)酵母菌株和野生酵母菌株，byc3酵母在ypd培養(yǎng)基中β-苯乙醇產(chǎn)量達(dá)31.6mg/l，是添加1g/l苯丙氨酸的ypd培養(yǎng)基的50.9％(而商業(yè)酵母為27％、野生酵母為22％左右)，酵母byc3高產(chǎn)β-苯乙醇性能得到驗證。

實施例3：高產(chǎn)β-苯乙醇酵母在黃酒中的應(yīng)用

1、黃酒釀造工藝一

(1)酒母制作：50mlypd搖瓶接種酵母菌株，30℃、200r/min培養(yǎng)24h。1kg蒸熟米飯(含水率為70％)中加入水1l、麥曲0.05kg，攪拌均勻，60℃保溫4h，冷卻后按5％接種酵母菌液，30℃、200r/min培養(yǎng)16h；酵母選用高產(chǎn)β-苯乙醇釀酒酵母byc3(即cctccno:m2016785)。

(2)蒸熟米飯(含水率為70％)，加入等重量清水，2％麥曲、5％酒母，攪拌均勻。

(3)發(fā)酵與攪拌：發(fā)酵溫度為28℃，落料完成后開始計時，每隔8h進(jìn)行攪拌，至48h時共攪拌6次。發(fā)酵5-7天，檢測酒精度指標(biāo)不再升高時結(jié)束發(fā)酵。

(4)壓榨：發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵醪液過板框過濾機(jī)進(jìn)行壓榨得到清酒。

(5)煎酒：清酒過煎酒滅菌機(jī)85℃滅菌30min。

(6)陳釀：煎酒后清酒入陳釀罐陳釀6個月。

(7)過濾：陳釀后清酒用硅藻土過濾機(jī)和膜過濾機(jī)過濾除去雜菌及雜質(zhì)。

(8)滅菌灌裝：過滅菌機(jī)，85℃滅菌30min，熱灌裝。

所得產(chǎn)品用高效液相法檢測β-苯乙醇含量高達(dá)152mg/l，酒精度為12％(v/v)，乙酸乙酯含量為12mg/l，乙酸-2-苯乙酯含量為22μg/l。

2、黃酒釀造工藝二

(1)酒母制作：如本實施例上述工藝一。

(2)糯米粉碎，加入糯米質(zhì)量2.5倍的清水，高溫淀粉酶110℃高溫糊化40min，降溫到35℃加入糖化酶糖化40min，降溫到28℃，按總體積4％加入麥曲、按總體積10％加入酒母，攪拌均勻。

(3)其余步驟如本實施例的工藝一所述。

所得產(chǎn)品用高效液相法檢測β-苯乙醇含量高達(dá)410mg/l，酒精度為14％(v/v)，乙酸乙酯含量為24mg/l，乙酸-2-苯乙酯含量為56μg/l。

實施例4：高產(chǎn)β-苯乙醇酵母在料酒中的應(yīng)用

1、料酒釀造工藝一

按實施例3中釀造工藝一獲得黃酒，加入食鹽10％，過滅菌機(jī)85℃滅菌30min熱灌裝。β-苯乙醇含量高達(dá)140mg/l，酒精度為10％(v/v)，乙酸乙酯含量為10mg/l，乙酸-2-苯乙酯含量為20μg/l。

2、黃酒釀造工藝二

按實施例3中釀造工藝二獲得黃酒，加入食鹽10％，過煎酒滅菌機(jī)85℃滅菌30min熱灌裝。

所得產(chǎn)品用高效液相法檢測β-苯乙醇含量高達(dá)450mg/l，酒精度為13％(v/v)，乙酸乙酯含量為20mg/l，乙酸-2-苯乙酯含量為50μg/l。

實施例5：高產(chǎn)β-苯乙醇酵母在釀造食醋固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用

以實施例3中工藝二發(fā)酵黃酒，作為醋酸發(fā)酵原料。

醋酸發(fā)酵采用固態(tài)發(fā)酵工藝：將大糠、麩皮、黃酒按照1:4:10的比例拌勻，接入5％醋醅，接種后1-2天內(nèi)每天從物料表面翻醅，溫度為35-40℃。到6-8天時翻到物料底部。第8-12天，每天從底部翻醅，溫度自然下降。從醋醅中分離后得生醋，在經(jīng)過85℃滅菌30min后陳釀12個月。在灌裝前經(jīng)過高溫滅菌后熱灌裝。

所得固態(tài)發(fā)酵釀造食醋中醋酸含量為60g/l，β-苯乙醇含量高達(dá)300mg/l，乙酸-2-苯乙酯含量為45μg/l。

實施例6：高產(chǎn)β-苯乙醇酵母在釀造食醋液態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用

以實施例3中工藝二發(fā)酵黃酒，作為醋酸發(fā)酵原料。

醋酸發(fā)酵采用液態(tài)發(fā)酵工藝：將黃酒用清水稀釋4倍后，接入5％培養(yǎng)好的醋酸菌菌液，通氧1l/min并進(jìn)行攪拌，待發(fā)酵體系中酒精含量少于1％時，分批次加入黃酒，醋酸發(fā)酵體系中酒精含量控制在為1％-4％，發(fā)酵體系中醋酸含量約80g/l時離心分離，得到液態(tài)食醋。經(jīng)過高溫滅菌后熱灌裝。所得液態(tài)發(fā)酵釀造食醋中β-苯乙醇含量達(dá)100mg/l，乙酸-2-苯乙酯含量為36μg/l。

實施例7：高產(chǎn)β-苯乙醇酵母在釀造醬油高鹽稀態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用

釀造醬油選用高鹽稀態(tài)法發(fā)酵，豆粕和小麥按1:1比例混勻蒸熟。米曲霉接種量為10％，控制溫度為30℃，加入2倍物料質(zhì)量的鹽水，醬醪含鹽量為18％、含水量為65％，攪拌混勻。byc3酵母用ypd搖瓶培養(yǎng)，按5％接種量接入部分蒸熟冷卻后的豆粕和小麥中，加入2倍體積清水，30℃、200r/min培養(yǎng)24h制成byc3酒母，等待加入醬醪中。醬醅起始發(fā)酵溫度為15℃，隨著發(fā)酵進(jìn)行溫度升高為15-35℃，在溫度升高到20℃時接入byc3酒母。發(fā)酵時間為5個月。

發(fā)酵結(jié)束后的醬醪經(jīng)過板框壓榨，去除醬醅。壓榨結(jié)束后進(jìn)行硅藻土過濾和膜過濾，去除沉淀。過濾澄清的醬油經(jīng)過85℃滅菌30min熱灌裝。高產(chǎn)β-苯乙醇酵母用于高鹽稀態(tài)法發(fā)酵，所得醬油產(chǎn)品中含有β-苯乙醇200mg/l。

實施例8：高產(chǎn)β-苯乙醇酵母在釀造醬油低鹽固態(tài)發(fā)酵中的應(yīng)用

釀造醬油選用低鹽固態(tài)發(fā)酵，豆粕和小麥按1:1比例混勻蒸熟。米曲霉接種量為10％，控制溫度為30℃，加入2倍物料質(zhì)量的鹽水，醬醪含鹽量為7％、含水量為40％，攪拌混勻。byc3酵母用ypd搖瓶培養(yǎng)，按5％接種量接入部分蒸熟冷卻后的豆粕和小麥中，加入1倍體積的清水，30℃、200r/min培養(yǎng)24h，制成byc3酒母接入醬醪發(fā)酵體系，品溫控制在40℃。發(fā)酵時間為15d。

發(fā)酵結(jié)束后的醬醪去除雜質(zhì)和沉淀。過濾澄清的醬油經(jīng)過85℃滅菌30min熱灌裝。高產(chǎn)β-苯乙醇酵母用于高鹽稀態(tài)法發(fā)酵，所得醬油產(chǎn)品中含有β-苯乙醇50mg/l。

實施例9：高產(chǎn)β-苯乙醇酵母在白酒中的應(yīng)用

1、白酒釀造工藝一

采用兩輪發(fā)酵法，第一輪發(fā)酵時高粱蒸熟后，風(fēng)冷降溫至28℃，添加4％米曲霉，28℃培養(yǎng)24h。添加稻殼10％、曲15％、麩皮8％、按1％接入ypd搖瓶培養(yǎng)的byc3酵母，密閉發(fā)酵30天后蒸酒。二次發(fā)酵時添加中溫大曲10％、按1％接入ypd搖瓶培養(yǎng)的byc3酵母，發(fā)酵15天后蒸酒。兩種酒勾兌成酒精度60％(v/v)，β-苯乙醇含量為110mg/l，乙酸-2-苯乙酯含量為64μg/l。

2、白酒釀造工藝二

高粱40％、小麥10％、玉米5％、大米25％、糯米20％蒸熟后，風(fēng)冷后溫度25℃，大糠使用量20％、曲20％、水分30％，按1％接入ypd搖瓶培養(yǎng)的byc3酵母。溫度在20℃，濕度在70％，發(fā)酵60天，蒸餾獲得38％白酒。β-苯乙醇含量為50mg/l，乙酸-2-苯乙酯含量為26μg/l。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。