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團青霉T3?1及其發(fā)酵化合物、提取純化方法和在抗過敏中的應用與流程

文檔序號:11259431閱讀:405來源:國知局

本發(fā)明屬于海洋真菌提取新化合物領域,更具體地說,本發(fā)明涉及一種新的團青霉t3-1(penicilliumcommunet3-1),及其發(fā)酵提取得到的一類青霉發(fā)酵化合物、相應的提取純化方法和青霉發(fā)酵化合物在抗過敏中的應用。



背景技術:

食物過敏,即食物變態(tài)反應,是指某些人在吃了某種食物之后,引起身體某一組織、某一器官甚至全身的強烈反應,以致出現(xiàn)各種各樣的功能障礙或組織損傷,嚴重者甚至可能引起過敏性休克。食物過敏威脅著人類生命健康,在過去幾十年內(nèi)其發(fā)病率逐漸增加,幾乎10%的兒童患有食物過敏。食品法典委員會指出常見的食物過敏原包括牛奶、雞蛋、魚類、甲殼類、貝類、花生、堅果、大豆、谷物等。其中,貝類過敏是最常見的食物過敏,原肌球蛋白(muscleproteintropomyosin,tm)已被確定為貝類的主要過敏原。食物過敏反應主要是血清免疫球蛋白(immunoglobuline,ige)介導的,而這種過敏反應通常伴隨著特異型免疫球蛋白ige含量的提高。

目前治療食物過敏的方案只有避免接觸過敏原或進行脫敏療法,還未找到抑制致敏食物抗原的活性藥物。膳食干預是食物過敏管理一個至關重要的組成部分,但卻會對人體的營養(yǎng)攝入和生活質(zhì)量產(chǎn)生負面影響;而使用抗組胺類藥物或激素類藥物容易產(chǎn)生耐藥性等副作用,所以尋找抗過敏活性化合物尤為重要。

天然化合物是創(chuàng)新藥物研究的重要源泉,據(jù)最新的一份統(tǒng)計表明,從1981年到2014年共三十多年的時間里批準的小分子藥物共有1211個,其中來自天然產(chǎn)物及其衍生物的占65%。上世紀五十年代,由于青霉素的發(fā)現(xiàn),導致了對陸地微生物持續(xù)50多年的集中研究和開發(fā)。時至今日,陸地微生物次級代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)的重復率已高達95%,因此人們將關注度轉(zhuǎn)向海洋,尤其是深海。目前,海洋微生物來源的代謝產(chǎn)物正迅速成為藥物研發(fā)的新源泉。目前已有多種海洋來源的微生物次級代謝產(chǎn)物被開發(fā)成用于治療包括腫瘤、病毒等在內(nèi)多種疾病的藥物。

因此,在海洋微生物中篩選發(fā)現(xiàn)具有抗過敏活性的天然產(chǎn)物對于抗過敏藥物研發(fā)具有重要意義。



技術實現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的在于:克服現(xiàn)有技術中存在的上述問題,提供一種新的深海團青霉t3-1(penicilliumcommunet3-1),由此發(fā)酵提取得到的、具有抗過敏活性的一類青霉發(fā)酵化合物以及相應的發(fā)酵提取純化方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明提供了一種團青霉t3-1(penicilliumcommunet3-1),其保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號為cctccno:m2017123,保藏地址為中國.武漢.武漢大學,保藏日期為2017年3月15日。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明還提供了一類青霉發(fā)酵化合物,這類青霉發(fā)酵化合物是由上述團青霉t3-1(penicilliumcommunet3-1)經(jīng)發(fā)酵提取純化而得;其結(jié)構(gòu)式如式(i)和式(ii)所示:

本發(fā)明另一目的在于提供上述青霉發(fā)酵化合物的提取純化方法,包括如下步驟:

(1)取深海真菌青霉屬t3-1,加入到培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng),然后加入有機溶劑萃取,將萃取液低壓濃縮得到青霉發(fā)酵粗提物;

(2)將青霉發(fā)酵粗提物進行ods色譜柱吸附,然后使用甲醇水溶液進行梯度洗脫;

(3)將步驟(2)所得活性部位進行葡聚糖凝膠lh-20吸附,然后使用體積比為1:1的氯仿/甲醇溶液進行洗脫;

(4)將步驟(3)所得活性部位進行硅膠柱層析吸附,然后采用體積比為10:0~1:1的氯仿/甲醇溶液進行梯度洗脫;

(5)根據(jù)tlc檢測結(jié)果,收集合并步驟(4)中的氯仿/甲醇溶液洗脫液,減壓濃縮蒸干后得到權(quán)利要求1或2所述兩種青霉發(fā)酵化合物。

本發(fā)明經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn),上述青霉發(fā)酵化合物具有較強的抗過敏活性,因此,本發(fā)明的另一目的在于提供上述青霉發(fā)酵化合物在制備抗過敏活性藥物中的應用。

本發(fā)明還有一個目的在于提供一種新的抗過敏活性藥物,其包括有效劑量的作為活性成分的上述青霉發(fā)酵化合物及其鹽類中的一種或幾種的組合,以及藥學上可接受的載體。

相對于現(xiàn)有技術,本發(fā)明青霉發(fā)酵化合物由深海真菌團青霉t3-1(penicilliumcommunet3-1)發(fā)酵提取純化得到,經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn),其具有較強的抗過敏活性,可用于制備和開發(fā)抗過敏藥物。本發(fā)明為研發(fā)抗過敏藥物提供了新的化合物來源,對我國海洋藥物開發(fā)具有重要意義,還可促進深海生物資源的有效應用,具有良好的應用前景。

一種團青霉t3-1(penicilliumcommunet3-1),保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號為cctccno:m2017123,保藏地址為中國.武漢.武漢大學,保藏日期為2017年3月15日。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益技術效果更加清晰,以下結(jié)合實施例,對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解的是,本說明書中描述的實施例僅僅是為了解釋本發(fā)明,并非為了限定本發(fā)明,實施例的參數(shù)、比例等可因地制宜做出選擇而對結(jié)果并無實質(zhì)性影響。

實施例1

本實施例以深海真菌中的團青霉t3-1(penicilliumcommunet3-1)為原料,制備式(i)和式(ii)所示的青霉發(fā)酵化合物,具體步驟如下:

(1)取團青霉t3-1(penicilliumcommunet3-1),加入到培養(yǎng)基中,靜置35天,加有機溶劑萃取三次,合并得到的萃取液,將萃取液低壓濃縮,得到28.6g青霉發(fā)酵粗提物;

(2)將步驟(1)中青霉發(fā)酵粗提物進行c18ods色譜柱吸附,采用甲醇水溶液進行梯度洗脫;

(3)將步驟(2)中所得活性部位用葡聚糖凝膠lh-20吸附,使用1:1的氯仿-甲醇溶液進行洗脫;

(4)將步驟(3)中得到的活性部位進行100-200目硅膠柱層析吸附,采用10:0至1:1的氯仿-甲醇溶液進行梯度洗脫;

(5)根據(jù)tlc檢測結(jié)果,收集和合并步驟(4)中氯仿-甲醇溶液洗脫液,減壓濃縮蒸干后得到兩種化合物分別為1、2,重量分別為5.7mg、3.0mg,化合物1為白色粉末,化合物2為淡黃色油狀物質(zhì)。

將上述所得化合物分別用1h-nmr和13c-nmr譜分析?;衔?高分辨質(zhì)譜(hresims)給出分子式為c32h41no3。在1hnmr譜中,3個低場質(zhì)子信號[(δh6.58,d,j=7.2hz,h-21),(δh6.75,t,j=7.8hz,h-22),(δh7.01,d,j=7.9hz,h-23)]表明結(jié)構(gòu)中存在1,2,3-三取代苯環(huán)片段;此外還存在2個烯質(zhì)子[(δh5.26,qq,j=6.9,1.4hz,h-31),[(δh5.62,dd,j=6.0,1.4hz)]、3個含氧次甲基質(zhì)子(δh3.76,3.87,4.51)、1個末端烯雙鍵(δh4.84,5.04)和5個甲基質(zhì)子信號(δh0.97,1.22,1.63,1.66,1.70)。13cnmr譜中顯示32個碳共振信號,其中包括10個季碳[8個sp2(δc116.1,125.6,131.9,133.3,141.6,143.6,149.8,153.8)和2個sp3(δc43.8,51.8)]、10個次甲基[6個sp2(δc110.5,118.7,119.0,120.3,120.8,125.7)和4個sp3(δc51.4,64.5,75.2,80.8;其中3個含氧次甲基)]、7個亞甲基[1個sp2(δc111.4)和6個sp3(δc22.4,28.2,29.4,30.3,33.2,35.0)]、以及5個甲基(δc16.6,18.1,20.1,20.2,26.0)。結(jié)構(gòu)如式(i)所示。

化合物2,hresims給出分子式為c15h16o2。1hnmr譜中顯示8個芳香質(zhì)子信號,其中3個芳香質(zhì)子信號δh6.36(t,j=2.1hz,h-4),δh6.62(brs,h-2)及δh6.66(brs,h-6)表明存在1,3,5-三取代苯環(huán)片段;另外5個芳香質(zhì)子信號(δh7.28,7.36,7.36,7.51,7.51)揭示存在1個單取代苯環(huán)片段;此外1hnmr譜中還存在兩個鄰位烯質(zhì)子信號δh7.01(dd,j=16.3hz,h-7)和δh7.08(dd,j=16.3hz,h-8)以及1個甲氧基質(zhì)子δh3.83。13cnmr譜中存在15個碳共振信號,包括4個季碳(δc137.0,139.7,156.8,161.1)、10個sp2次甲基(δc100.8,104.9,105.9,126.6,126.6,127.8,128.3,128.7,128.7,129.4)、1個甲氧基δc55.4?;衔?的結(jié)構(gòu)如式(ii)所示。

表1本發(fā)明化合物1的1h、13c-nmr數(shù)據(jù)

表2本發(fā)明化合物2的1h、13c-nmr數(shù)據(jù)

實施例2實施例1制備得到的化合物1、2的體外抗過敏活性篩選

本實施例選擇ige介導的rbl-2h3細胞模型,檢測細胞致敏后的脫顆粒效率,計算化合物樣品對細胞脫顆粒效率的抑制率,從而檢測實施例1中化合物1、2的抗過敏活性。

本實施例分為以下3組:

(1)陽性對照組,氯雷他定;

(2)化合物1實驗組:實施例1中步驟(5)所得深海真菌化合物1;

(3)化合物2實驗組:實施例1中步驟(5)所得深海真菌化合物2;

本實施例采用如下操作:

(1)胰酶消化回收rbl-2h3細胞,6×105cells/ml,每孔加100μl(即6×104cells/孔)入96孔板,同時添加anti-dnp-ige至1μg/ml的終濃度,培養(yǎng)箱(37℃,5%co2)孵育過夜;

(2)用pbs洗孔3遍,將樣品溶于pbs中,分別取5μl樣品加95μltyrode’s緩沖液混勻(粗樣終濃度100μg/ml),陰性對照為5μlpbs+95μltyrode’s緩沖液,分別取95μl加到培養(yǎng)板中,繼續(xù)培養(yǎng)1h。用1μg/mldnp-bsa刺激rbl-2h3細胞6小時;

(3)β-氨基己糖苷酶的活性利用4-methylumbellife-ryl-n-acetyl-β-d-glucosaminide底物進行檢測,回收細胞培養(yǎng)上清后,向培養(yǎng)板中加100μltyrode’s緩沖液(含0.1%tritonx-100)裂解細胞;最后用25μl上清或細胞裂解液分別入96孔熒光板,每孔加100μl4-methylumbellife-ryl-n-acetyl-β-d-glucosaminide試劑(1.2mm),反應30min(37℃),用酶標儀獲取每孔溶液360nm激發(fā),450nm發(fā)射的熒光值。

(4)脫顆粒效率計算公式:

脫顆粒效率=(上清的熒光值/(上清的熒光值+細胞裂解液的熒光值))×100%。

結(jié)果顯示化合物1、2有較明顯的抗過敏活性,其ic50分別為:10.36μg/ml和20.66μg/ml,優(yōu)于陽性對照氯雷他定的35.01μg/ml,可用于制備相應的治療藥物。

根據(jù)上述說明書的揭示和教導,本發(fā)明所屬領域的技術人員還可以對上述實施方式進行適當?shù)淖兏托薷?。因此,本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的具體實施方式,對本發(fā)明的一些修改和變更也應當落入本發(fā)明的權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。此外,盡管本說明書中使用了一些特定的術語,但這些術語只是為了方便說明,并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制。

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