本發(fā)明屬于生物技術和生物能源領域，具體涉及一種耐受低溫培養(yǎng)生產(chǎn)微藻油脂的柵藻及其培養(yǎng)應用。

背景技術：

近年來，隨著世界經(jīng)濟的高速發(fā)展、工業(yè)化的推進、人口的不斷增長，世界對石油燃料的需求日漸增加。同時，對于石油基燃料的大量使用，大量的工業(yè)廢氣、溫室氣體被排放到大氣中，造成了一系列的環(huán)境問題，如溫室效應，霧霾等。因此，對于石油替換性燃料，高效可再生能源的研究已成為當前研究的熱點。微藻結(jié)構簡單、整個生物體都能進行光合作用，具有光合效率高、生長周期短、速度快的特點。與陸生植物較低的光合效率（普遍低于0.5%）相比，微藻具有更高的光合作用效率，有些微藻的光合效率可高達10%。突出的光合效率使得微藻的生物周期大大縮短，其生物質(zhì)倍增時間平均為3至5天，在人工培養(yǎng)下的微藻每幾天就可以收獲一次，而且不因收獲而破壞生態(tài)系統(tǒng)同時獲得大量生物質(zhì)。某些微藻因含油量高、易于培養(yǎng)、單位面積產(chǎn)量大等優(yōu)點，被視為新一代能實現(xiàn)完全替代石化柴油的生物質(zhì)能源原料。

微藻生產(chǎn)油脂的培養(yǎng)溫度一般在15-35℃，在此培養(yǎng)溫度下，隨著培養(yǎng)溫度的降低，微藻生產(chǎn)油脂的能力一般會下降，普通微藻產(chǎn)量的下降較為明顯，例如從25℃下降至15℃時，油脂產(chǎn)量會下降20%左右。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中培養(yǎng)溫度下降時，微藻生產(chǎn)油脂的能力下降較明顯的不足，本發(fā)明提供一種可耐受低溫生產(chǎn)油脂的柵藻及其培養(yǎng)方法和應用。本發(fā)明的柵藻能夠耐受低溫10℃下生長，可利用含co2的氣體進行光照自養(yǎng)生長獲取生物質(zhì)，固碳效率高，所獲取的生物質(zhì)中附加價值高，能夠進行生物柴油的生產(chǎn)。

本發(fā)明的柵藻hcs-02，其分類命名為柵藻（scenedesmussp.），已于2015年4月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.10766。

本發(fā)明提供的柵藻hcs-02在顯微鏡下藻細胞呈綠色，常由4個細胞鏈接成單列，單個細胞呈橢圓形，細胞壁平滑具刺，色素體周生，每個細胞含有一個蛋白核，單個細胞長約8-14μm，寬約3.5-6μm。

本發(fā)明提供的柵藻hcs-02的18srdna基因測序分析結(jié)果見序列表。根據(jù)序列比對，本發(fā)明的柵藻hcs-02與已公布的柵藻藻株的18srdna數(shù)據(jù)存在差異。

本發(fā)明的柵藻hcs-02的培養(yǎng)方法，在光照生物反應器中，利用bg11培養(yǎng)基培養(yǎng)，在光照強度1500-15000lux，ph值為6-8，溫度為10-35℃下培養(yǎng)，從反應器底部通入空氣；培養(yǎng)7天以上進入穩(wěn)定期，結(jié)束培養(yǎng)，收獲藻細胞，藻細胞干重達到10g/l以上，細胞總脂含量占細胞干重的35%以上，多糖含量占細胞干重的20%以上。

本發(fā)明的柵藻可應用于生產(chǎn)微藻飼料。該藻株在適宜的生長條件下蛋白質(zhì)含量可占細胞干重的50%以上，多糖含量可占細胞干重20%以上。

本發(fā)明的柵藻可應用于生產(chǎn)微藻油脂。該柵藻藻株在適宜的生長條件下，細胞總脂含量可占細胞干重的40%以上，能夠進行生物柴油的生產(chǎn)。本發(fā)明的柵藻還能耐受低溫，在低至10~15℃的溫度下，油脂含量下降15~23%左右，此溫度下比普通微藻的生產(chǎn)能力提高5~20%。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明可以帶來以下有益效果：

1、本發(fā)明選育的柵藻可以利用co2進行自養(yǎng)生長，固定co2，緩解目前工業(yè)社會帶來的溫室效應問題；同時能夠收獲高淀粉、蛋白含量的生物質(zhì)。

2、該藻株的生長速率快，生長周期短，僅為7天左右，所含的總脂含量高，適于生產(chǎn)生物柴油，可以解決生物柴油生產(chǎn)的油脂來源的問題，且可耐受低溫生長，在低至10~15℃的溫度下，油脂含量下降15~23%左右，此溫度下比普通微藻的生產(chǎn)能力提高5~20%。

3、該藻種培養(yǎng)穩(wěn)定期后沉降迅速，12小時內(nèi)，沉降基本完全，容易收集。

附圖說明

圖1是本發(fā)明方法選育的柵藻（scenedesmussp.）hcs-02的形態(tài)特征圖。

生物材料保藏說明

本發(fā)明提供的柵藻（scenedesmussp.）hcs-02，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；保藏編號：cgmccno.10766；保藏日期：2015年4月24日。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。

實施例1

分離和馴化篩選獲得柵藻hcs-02

（1）出發(fā)藻株的獲得：2011年6月從吉林琿春河上游取回水樣150ml，將水樣用紗布過濾，除去大的雜質(zhì)，取過濾后的水樣50ml接種到200ml的bg11培養(yǎng)基中進行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)的光照強度為5000lux，溫度為25℃，光暗周期為24h，光暗時間比為14:10，培養(yǎng)約半個月后，培養(yǎng)基呈現(xiàn)綠色。將富集培養(yǎng)的水樣稀釋至10^-5倍，在無菌條件下涂布到bg11固體平板上培養(yǎng)，培養(yǎng)的光照強度為5000lux，溫度為25℃，培養(yǎng)約10天后平板上出現(xiàn)綠色的單藻落，挑取單藻落在搖瓶上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度為5000lux，培養(yǎng)10天后，顯微鏡觀察確定是否為純藻種，若不是純種，重復上述步驟，直到確定為純培養(yǎng)藻株為止。經(jīng)過反復培養(yǎng)，獲得純藻株編號為hcs-2。

（2）低溫馴化培養(yǎng)：將步驟（1）中的搖瓶培養(yǎng)的純藻種經(jīng)自然沉降后濃縮，取0.25ml濃縮液配以1.5ml10-20%甘油/水保護劑置于-80℃環(huán)境下冷凍30天。

（3）將步驟（2）中的藻液解凍清洗后接入搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強度為5000lux，培養(yǎng)10天后重復步驟（2），反復馴化3次，收獲耐受低溫的藻液。

（4）將步驟（3）馴化得到的藻液采用平板劃線的方式獲得純藻落，培養(yǎng)步驟同（1），培養(yǎng)結(jié)束后，挑選較大的藻落進行搖瓶培養(yǎng)，獲得目的藻株命名為hcs-02。

實施例2

藻株的鑒定

將獲得hcs-02藻細胞的dna的提取采用ctab法，并采用18srdna基因克隆，將得到的3個陽性克隆送至上海生工公司測序。18srdna基因測序分析結(jié)果見序列表。將18srdna序列登錄到genbank數(shù)據(jù)庫進行blast比對，結(jié)果顯示與scenedesmussp.有最大的相似性，其blastn值為2610，maxindex值為99%，可以確定hcs-02為柵藻（scenedesmussp.）。

實施例3

柵藻hcs-02的應用

將對數(shù)生長期的hcs-02的藻液接種在bg11培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，bg11培養(yǎng)基的配方見表2和表3，培養(yǎng)在500ml搖瓶中進行，接種后培養(yǎng)液的od689.5為0.1。培養(yǎng)過程中光照強度為5000lux，培養(yǎng)溫度為25℃，光照周期為24h，光暗時間比為14:10，每8小時晃動搖瓶使沉淀上浮，培養(yǎng)時間為20天處于穩(wěn)定期。培養(yǎng)結(jié)束，離心收集藻液，使用酶/超聲破碎細胞壁后采用淀粉酶水解法測定藻細胞淀粉含量。測得培養(yǎng)20天的hcs-02生物質(zhì)參量為2.0337g/l，藻細胞淀粉含量占細胞干重20.40%。

將對數(shù)生長期的hcs-02的藻液接種在bg11培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，bg11培養(yǎng)基的配方見表1和表2，培養(yǎng)在實驗室自制的柱式反應器（內(nèi)徑為40mm，高度為500mm）中進行，接種后培養(yǎng)液的od689.5為0.2。從反應器底部通入0.5升/分鐘的空氣。培養(yǎng)過程中光照強度為5000lux，培養(yǎng)溫度為25℃，ph值控制在6-8之間，光照周期為24h，光暗時間比為14:10，培養(yǎng)時間為7天處于穩(wěn)定期。結(jié)束培養(yǎng)，離心收集藻液，在-60℃條件下真空冷凍干燥至恒重后測量藻粉干重，計算生物質(zhì)產(chǎn)量；并采用正己烷：乙酸乙酯法測得總脂含量。測得培養(yǎng)7天的hcs-02藻株的生物質(zhì)產(chǎn)量為6.1082g/l，細胞總脂含量占細胞干重的40.73%。

表1bg11培養(yǎng)基

*表2表1中a5+co溶液的組成

實施例4

hcs-02和hcs-2的生長與油脂產(chǎn)率的比較

將對數(shù)生長期的hcs-02和初始藻株hcs-2的藻液分別接種在bg11培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)在實驗室自制的柱式反應器（內(nèi)徑為40mm，高度為500mm）中進行，接種后的密度調(diào)整為od689.5為0.2。根據(jù)試驗需要，組配不同溫度環(huán)境。培養(yǎng)過程中光照強度為5000lux，ph值控制在7-9之間，光照周期為24h，光暗時間比為14:10，培養(yǎng)時間為7天，培養(yǎng)結(jié)束后收集藻細胞，測定細胞干重，結(jié)果如下表3。從結(jié)果可以看出，經(jīng)過馴化篩選的hcs-02比初始藻株hcs-2對co2和so2有較好的耐受性。

表3不同co2和so2含量的效果比較

從結(jié)果可以看出，經(jīng)過馴化篩選的柵藻hcs-02比初始藻株hcs-2對低溫培養(yǎng)環(huán)境有更好的耐受性，生物量與油脂含量穩(wěn)定性好。

實施例5

hcs-02沉降效果檢測

將培養(yǎng)7天后處于穩(wěn)定期的hcs-02藻液靜置大約8小時，上清液清澈，基本上所有藻細胞都沉降到容器底部，說明hcs-02易于沉降，比較容易收集。

sequencelisting

<110>中國石油化工股份有限公司

中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院

<120>一種附加價值高的柵藻及其培養(yǎng)應用

<130>新專利申請

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1418

<212>dna

<213>scenedesmussp.

<400>1

gtagtcatatcttgtctcaaagattaagccatgcatgtctaagtataaactgcttatact60

gtgaaactgcgaatggctcattaaatcagttatagtttatttggtggtaccttcttactc120

ggaataaccgtaagaaaattagagctaatacgtgcgtaaatcccgacttctggaagggac180

gtatatattagataaaaggccgaccggactttgtccgacccgcggtgaatcatgatatct240

tcacgaagcgcatggccttgtgccggcgctgttccattcaaatttctgccctatcaactt300

tcgatggtaggatagaggcctaccatggtggtaacgggtgacggaggattagggttcgat360

tccggagagggagcctgagaaacggctaccacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaat420

tacccaatcctgatacggggaggtagtgacaataaataacaataccgggcattttatgtc480

tggtaattggaatgagtacaatctaaatcccttaacgaggatccattggagggcaagtct540

ggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatatttaagttgttgcagttaa600

aaagctcgtagttggatttcgggtgggtttcagcggtccgcctatggtgagcactgctgt660

ggccttccttactgtcggggacctgcttctgggcttcattgtccgggacagggattcggc720

atggtcactttgagtaaattagagtgttcaaagcaggcttacgccgtgaatactttagca780

tggaataacacgataggactctgccctattctgttggcctgtaggagtggagtaatgatt840

aagaggaacagtcgggggcattcgtatttcattgtcaaaggtgaaattcttggatttatg900

aaagacgaactactgcgaaagcatttgccaaggatgttttcattaatcaagaacgaaagt960

tgggggctcgaagacgattagataccgtcgtagtctcaaccataaacgatgccgactagg1020

gattggcggacgtttttgcatgactccgtcagcaccttgagagaaatcaaagtttttggg1080

ttccggggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaaggaattgacggaagggcaccacc1140

aggcgtggagcctgcggcttaatttgactcaacacgggaaaacttaccaggtccagacat1200

aggaaggattgacagattgagagctctttcttgattctatgggtggtggtgcatggccgt1260

tcttagttggtgggttgtcttgtcaggttgattccggtaacgaacgagacctcagccttt1320

aaatagtcacagtcgctttttgcgggtggtttgacttcttagagggacagttggcgttta1380

gtcaacggaagtatgaggcaataacaggtctgtgatgc1418