本發(fā)明涉及釀酒微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種耐高溫、耐酸接合酵母菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：乙醇是釀造酒中最重要也是最主要的成分之一，中國白酒中乙醇含量高達(dá)40％～55％(v/v)；黃酒中為14％～20％；啤酒中為2％～5％。酵母是產(chǎn)生乙醇的主要微生物，也是釀造酒工業(yè)中不可缺少的微生物。白酒不同產(chǎn)區(qū)特定的氣候環(huán)境是影響白酒釀造微生物群系及其代謝的關(guān)鍵因素。微生物群系是貫穿影響白酒釀造“一曲、二泥、三發(fā)酵”三方面的主體因素，而特定多樣的自然環(huán)境又影響了微生物群系的構(gòu)架、代謝及其風(fēng)味物質(zhì)的形成。所以，氣候環(huán)境是影響白酒品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。尤其是在夏季，由于夏季氣溫高和現(xiàn)有設(shè)備條件的限制，入窖溫度無法控制，有害微生物迅速繁殖，因而升溫過猛，酸度大幅度上升，酵母發(fā)酵力低下，導(dǎo)致產(chǎn)酒率低、酒質(zhì)差等問題。因此現(xiàn)有釀酒工藝中，夏季氣溫達(dá)到32℃以上，則入池溫度達(dá)可到27-30℃，頂溫最高可達(dá)35℃，這時(shí)生產(chǎn)的酒水味道苦，出酒率下降，酒醅酸度高，下次發(fā)酵就會(huì)掉排，就只能停產(chǎn)。而現(xiàn)有的降溫控酸的方法均治標(biāo)不治本，無法達(dá)到理想的效果，且會(huì)增加生產(chǎn)成本，因此，尋找一種能夠耐高溫、耐酸的釀酒微生物，是亟待解決的問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠耐高溫、耐酸的白酒發(fā)酵接合酵母。本發(fā)明一種耐高溫、耐酸接合酵母菌株，是由四川劍南春集團(tuán)有限責(zé)任公司的酒曲中分離得到的接合酵母新菌株，該接合酵母(zygosaccharomycessp)菌株已于2017年04月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101)，保藏號(hào)為cgmccno.14070。上述一種耐高溫、耐酸接合酵母菌株，所述菌株的dna序列如seqidno：1所示。上述耐高溫、耐酸接合酵母菌株，該菌株的細(xì)胞學(xué)特征為：菌體為圓形；菌落呈奶白色，不透明，表面濕潤(rùn)光滑，邊緣整齊不擴(kuò)散。上述耐高溫、耐酸接合酵母菌株，該菌株生理生化特征為：能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、蜜二糖五種糖；不能利用硝酸鉀和硫酸銨氮源；不能代謝產(chǎn)生類淀粉化合物；具有產(chǎn)酯功能；不能分泌脲酶，不能分解環(huán)境中的尿素。上述耐高溫、耐酸接合酵母菌株，所述菌株耐受最高溫度為58℃，耐受最低ph值為2.2，并能在環(huán)境溫度為48℃，ph為2.2的條件下正常發(fā)酵，產(chǎn)乙醇量為2.59％。本發(fā)明還提供一種酒曲，所述酒曲含有上述耐高溫、耐酸接合酵母菌株。上述耐高溫、耐酸接合酵母菌株在夏季釀酒生產(chǎn)中的應(yīng)用。進(jìn)一步的，上述耐高溫、耐酸接合酵母菌株在夏季釀酒生產(chǎn)中的應(yīng)用，是指在夏季高溫、高酸環(huán)境下釀造白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用。上述酒曲在夏季釀酒生產(chǎn)中的應(yīng)用。進(jìn)一步的，上述酒曲在夏季釀酒生產(chǎn)中的應(yīng)用，是指在夏季高溫、高酸環(huán)境下釀造白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明接合酵母新菌株的同時(shí)具有耐高溫、高酸的能力，耐受最高溫度為58℃，耐受最低ph值為2.2，并能在環(huán)境溫度為48℃，ph為2.2的條件下正常發(fā)酵，產(chǎn)乙醇量為2.59％，是一株能在高溫、高酸環(huán)境下產(chǎn)乙醇的新菌株，本發(fā)明為解決夏季白酒生產(chǎn)中因環(huán)境溫度高、窖池酸度高、酵母發(fā)酵力低下而導(dǎo)致產(chǎn)酒率低、酒質(zhì)差的問題提供了一種新的選擇，其可維持夏季正常生產(chǎn)，可減少污染生酸，具有廣闊的應(yīng)用前景和極大的應(yīng)用價(jià)值。附圖說明圖1為本發(fā)明接合酵母(zygosaccharomycessp)菌株形態(tài)圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于以下所述。實(shí)施例1菌株篩選1、菌株的初篩材料：四川劍南春(集團(tuán))有限責(zé)任公司使用的酒曲培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基：取大麥芽一定量，粉碎，加4倍于麥芽量的水，在55～60℃水浴中保溫糖化，不斷攪拌，經(jīng)3～4h后，至糖化液與碘液反應(yīng)不顯藍(lán)色為止。煮沸后過濾，將濾液稀釋至6°bé，備用。麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：將麥芽汁培養(yǎng)基加入2％瓊脂，于115℃滅菌20min，制成麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。ypd：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，蒸餾水配制，自然ph，121℃高壓滅菌20min。yepd：葡萄糖2％，蛋白胨2％，酵母膏1％，瓊脂2％，蒸餾水配制，自然ph，121℃高壓滅菌20min。試驗(yàn)方法：稱取一定量發(fā)酵了24h的酒曲，置于裝有150ml麥芽汁培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃，200rpm富集培養(yǎng)24h。將培養(yǎng)液10倍稀釋至10-6，取10-6的稀釋液1ml，麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基傾注平板，28℃培養(yǎng)24h，待菌落長(zhǎng)出后，挑取菌落形態(tài)不一的疑似酵母單菌落于yepd培養(yǎng)基中，編號(hào)并劃線純化，重復(fù)純化2～3次，直至平板上的菌落都為同一形態(tài)。挑去單一菌落制成水浸片，于電子顯微鏡下觀察菌體細(xì)胞形態(tài)，酒曲酵母分離純化完成。共分離純化出四株不同形態(tài)的酵母菌，編號(hào)為1#、2#、3#、4#。2、耐高溫酵母的篩選(1)用接種環(huán)分別將1#、2#、3#、4#四株酵母按相同的接種量接種到裝有100ml麥芽汁培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，置于搖床，28℃，200rpm培養(yǎng)過夜，進(jìn)行活化。(3)對(duì)活化后的菌液進(jìn)行鏡檢確認(rèn)無污染后，將1#、2#、3#、4#的菌液用無菌水稀釋10倍，分別取200μl稀釋液接種到2ml的ypd培養(yǎng)基中，接種后四株菌分別在55℃、58℃的水浴鍋中培養(yǎng)5h。(4)用無菌水將高溫培養(yǎng)過的酵母進(jìn)行梯度稀釋，分別取100μl原液、10-1、10-2、10-3稀釋液，涂布于yepd平板，28℃培養(yǎng)1～2d。待單菌落長(zhǎng)出后計(jì)數(shù)。結(jié)果如表1所示。表1耐高溫酵母篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果注：表中“多”表示“多不可計(jì)”。由表1可知，1#、2#、3#菌株均能耐受的最高溫度為58℃，且在此高溫條件下長(zhǎng)勢(shì)良好，致死溫度為59℃。4#菌株能耐受的最高溫度低于55℃，其耐高溫能力明顯低于1#、2#、3#。因此，選擇1#、2#、3#菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。3、耐酸酵母的篩選(1)用乳酸調(diào)節(jié)ypd培養(yǎng)基的酸度，獲得ph分別2.0、2.1、2.2、2.6、3.3、3.5的ypd培養(yǎng)基，將經(jīng)高溫初篩后的1#、2#、3#菌株進(jìn)行活化后，按相同接種量分別接種于上述yed培養(yǎng)基中，于28℃培養(yǎng)2～3天。(2)將培養(yǎng)的菌液按10倍梯度稀釋到10-4，取稀釋度為10-2、10-4、及原液各100μl的稀釋液，分別涂布于yepd平板上，28℃培養(yǎng)2～3d，待菌落長(zhǎng)出后計(jì)數(shù)，篩選耐酸能力最強(qiáng)的菌株。結(jié)果如表2所示。表2耐酸、耐高溫酵母篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果注：表中“多”表示“多不可計(jì)”。由表2可知，1#菌株耐酸能力最強(qiáng)，其次是2#菌株，均可耐受ph為2.2的酸度，但1#菌株的耐受能力明顯高于2#；最后是3#菌株，可耐受ph為2.6的酸度，且在此酸度條件下其長(zhǎng)勢(shì)較好，耐受性較強(qiáng)。其中1#、2#的致死ph為2.1。因此，根據(jù)耐高溫和耐酸實(shí)驗(yàn)選育出的1#、2#菌株為耐酸、耐高溫能力強(qiáng)的菌株。4、目標(biāo)菌株產(chǎn)乙醇能力測(cè)定4.1目標(biāo)菌株正常發(fā)酵最低ph用乳酸調(diào)節(jié)麥芽汁培養(yǎng)基的酸度，獲得ph分別2.2、2.4、2.5、2.6、2.8、3.5的麥芽汁培養(yǎng)基，分裝于250ml三角瓶中，每個(gè)瓶子裝100ml，115℃滅菌20min。將經(jīng)高溫、高酸初篩后的1#、2#菌株進(jìn)行活化后，按相同的的接種量分別接種于上述麥芽汁培養(yǎng)基中，塞上發(fā)酵栓，于28℃培養(yǎng)72h。發(fā)酵前稱瓶子重量并做記錄，稱發(fā)酵后瓶子重量，計(jì)算每個(gè)瓶子發(fā)酵前后重量差。取發(fā)酵液利用液相測(cè)定其中乙醇含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。表3菌株正常發(fā)酵最低ph實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表3可知，在培養(yǎng)基ph為3.5，發(fā)酵溫度為28℃的正常條件下，1#菌株的發(fā)酵力明顯高于2#菌株。隨著發(fā)酵ph值的降低，1#菌株重量差的變化及乙醇的產(chǎn)生量有所減少，但差異不顯著，因此，1#菌株在ph值為2.2(文獻(xiàn)報(bào)道最高發(fā)酵酸度的ph值為2.5)的高酸環(huán)境下仍能正常發(fā)酵，環(huán)境酸度的變化對(duì)其發(fā)酵力的影響不大。而2#菌株隨著ph值的降低，發(fā)酵力顯著降低，當(dāng)ph值為2.2時(shí)發(fā)酵力幾乎可以忽略不計(jì)，因此2#菌株雖然能耐受ph為2.2的高酸，但不能在高酸環(huán)境中正常發(fā)酵。4.2目標(biāo)菌株正常發(fā)酵最高溫度根據(jù)4.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇1#菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用乳酸調(diào)節(jié)麥芽汁培養(yǎng)基的酸度，獲得ph分別2.2培養(yǎng)基，分裝于250ml三角瓶中，每個(gè)瓶子裝100ml，115℃滅菌20min。將1#菌株進(jìn)行活化后，按相同的的接種量分別接種于上述麥芽汁培養(yǎng)基中，塞上發(fā)酵栓，分別于28℃、35℃、40℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃培養(yǎng)72h。發(fā)酵前稱瓶子重量并做記錄，稱發(fā)酵后瓶子重量，計(jì)算每個(gè)瓶子發(fā)酵前后重量差。取發(fā)酵液利用液相測(cè)定其中乙醇含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示表4菌株正常發(fā)酵最高溫度實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表4可知，當(dāng)溫度≦48℃時(shí)，隨著溫度的升高，1#菌株的發(fā)酵力有所降低，但變化不顯著；當(dāng)溫度﹥48℃時(shí)，1#菌株發(fā)酵力明顯降低。因此1#菌株的所能耐受的最高溫度為58℃，但在酸度ph為2.2的條件下的正常發(fā)酵溫度為48℃(高于文獻(xiàn)報(bào)道的最高正常發(fā)酵溫度45℃)。綜上所述，1#菌株為一株耐高溫、耐酸能力強(qiáng)的菌株，且在高溫、高酸的條件下有很強(qiáng)的產(chǎn)乙醇能力。耐受最高溫度為58℃，耐受最低ph值為2.2，并能在環(huán)境溫度為48℃，ph為2.2的條件下正常發(fā)酵，產(chǎn)乙醇量為2.59％。實(shí)施例2目標(biāo)菌株的鑒定自動(dòng)微生物鑒定議鑒定利用美國biolog公司全自動(dòng)微生物鑒定儀，biolog公司獨(dú)創(chuàng)的碳源利用方法，利用微生物對(duì)不同碳源代謝率的差異，針對(duì)每一類微生物篩選95種不同碳源，配合四唑類顯色物質(zhì)(如ttc、tv)，固定于96孔板上(a1孔為陰性對(duì)照)，接種菌懸液后培養(yǎng)一定時(shí)間，通過檢測(cè)微生物細(xì)胞利用不同碳源進(jìn)行新陳代謝過程中產(chǎn)生的氧化還原酶與顯色物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致的顏色變化(吸光度)以及由于微生物生長(zhǎng)造成的濁度差異(濁度)，與標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，即可得出最終鑒定結(jié)果。測(cè)試步驟：①、在buy培養(yǎng)基上，26℃培養(yǎng)待鑒定的酵母菌(即耐高溫又耐酸的菌株)。②、樣品準(zhǔn)備及觀察特征，利用濕法制備(水片法)或革蘭氏染色來確認(rèn)待鑒定菌株是酵母菌。③、接種準(zhǔn)備以裝有空白無菌水玻璃管調(diào)100％t透光率，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管校正，制備特定濃度菌懸液，調(diào)為47％t，接種到y(tǒng)t微平板，每孔100ul菌懸液。④、微平板培養(yǎng)于26℃培養(yǎng)鑒定板，將板放入一個(gè)密閉的塑料袋或其他盒中，加入浸濕的紙團(tuán)或毛巾，用以保持濕度，避免在培養(yǎng)過程中使鑒定板中菌懸液因蒸發(fā)而減少影響結(jié)果。培養(yǎng)鑒定板24，48或72h，直到得到鑒定結(jié)果。該菌株的碳源同化試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。表5本發(fā)明1#新菌株的碳源同化試驗(yàn)結(jié)果注：“+”為陽性，“－”為陰性。該菌株鑒定結(jié)果如表6所示。表6篩選的酵母菌鑒定結(jié)果英文名參考中文名可能性相似性位距zygosaccharomycessp接合酵母100％0.8821.75經(jīng)ncbi數(shù)據(jù)庫比對(duì)鑒定，篩選得到的耐酸、耐高溫能力最強(qiáng)的菌株為接合酵母(zygosaccharomycessp)新菌株，其信息包括耐受最高溫度為58℃，耐受最低ph值為2.2，并能在環(huán)境溫度為48℃，ph為2.2的條件下正常發(fā)酵，產(chǎn)乙醇量為2.59％。實(shí)施例3本發(fā)明接合酵母菌株的形態(tài)特征及生物學(xué)特性鑒定下述各試驗(yàn)中均要用到新活化的菌體，挑取少量菌體接種于麥芽汁固體培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)1～2d。1、菌落及菌體形態(tài)觀察將經(jīng)活化的接合酵母菌株用接種環(huán)劃線接種于麥芽汁瓊脂平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)1～2d，觀察菌落形態(tài)；用接種針挑取少許菌體，利用超高放大倍率視頻顯微鏡觀察菌體形態(tài)。菌落觀察結(jié)果：菌落呈奶白色、不透明，表面光滑濕潤(rùn)，菌落邊緣整齊不擴(kuò)散。菌體觀察結(jié)果：菌體呈圓形，出芽方式繁殖。如附圖1所示。2、糖類發(fā)酵試驗(yàn)培養(yǎng)基：12.5％豆芽汁黃豆芽125g，加水1l，煮沸30min，過濾后補(bǔ)足水至1l.。測(cè)試糖溶液：分別稱取適量的葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、蜜二糖，用無菌水配制成10％的糖溶液，煮沸15min，冷卻，備用。12.5％的豆芽汁中分裝于無菌的杜氏管中，分別用無菌移液管加入待測(cè)試糖溶液，混合均勻，接入已活化的接合酵母，置28℃下培養(yǎng)2-3d，每天觀察產(chǎn)氣情況，有氣體產(chǎn)生，表明接合酵母可以發(fā)酵此類糖，試驗(yàn)為陽性，否則為陰性。結(jié)果見表7。3、氮源同化試驗(yàn)培養(yǎng)基——同化氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖2％，kh2po40.1％，mgso4.7h2o，酵母膏0.02％，水洗瓊脂2％。用蒸餾水配制，過濾后裝試管，每管5ml。取出4根試管，一根加入適量的硝酸鹽，另一根加入適量的銨鹽，剩余2根不加，115℃滅菌20min，制成斜面，將活化的接合酵母接入到4根試管中，置于28℃下恒溫培養(yǎng)一周，觀察生長(zhǎng)情況。若加氮源的試管有長(zhǎng)出菌落，對(duì)照試管沒有，表明接合酵母可以利用這種氮源，試驗(yàn)為陽性，否則為陰性。結(jié)果見表7。4、類淀粉化合物形成的測(cè)定試驗(yàn)培養(yǎng)基:(nh4)2so40.1％，kh2po40.1％，mgso4.7h2o0.05％,葡萄糖1％，水洗瓊脂2.5％。ph4.5，115℃滅菌20min。將滅菌的培養(yǎng)基制成平板，在其上接入已活化的接合酵母，置于28℃條件下培養(yǎng)一周后，在表面上滴1-2滴的路哥氏碘液，觀察酵母菌落的周圍培養(yǎng)基的顏色變化，若菌落周圍呈現(xiàn)藍(lán)色，表明接合酵母可以產(chǎn)生類淀粉類化合物，試驗(yàn)為陽性，否則為陰性。結(jié)果見表7。5、產(chǎn)酯試驗(yàn)培養(yǎng)基：葡萄糖5g，10％豆芽汁100ml，分裝于100ml的三角瓶中，每瓶裝20ml，115℃滅菌20min。用接種環(huán)將活化的接合酵母接入到三角瓶中，28℃條件培養(yǎng)5d，用嗅覺檢查酯類的生成與否。若有酯香味產(chǎn)生，表明接合酵母有產(chǎn)酯功能，試驗(yàn)為陽性，否則為陰性。結(jié)果見表7。6、尿素分解試驗(yàn)培養(yǎng)基：蛋白胨0.1g，nacl0.5g，kh2po40.2g，酚紅0.0012g，蒸餾水100ml，瓊脂2g，調(diào)整ph至6.8。將配好的培養(yǎng)基分裝于試管中，每根試管裝2.7ml，再向試管中加入0.3ml的20％的尿素溶液，混勻后115℃滅菌20min，擱置制成斜面。將活化的接合酵母接入斜面上，28℃條件培養(yǎng)4-5d，，每天觀察生長(zhǎng)情況。若斜面呈淡紅色，則表明接合酵母可以產(chǎn)生脲酶，分解尿素，試驗(yàn)為陽性，否則為陰性。結(jié)果見表7。表7接合酵母菌株的生理生化特征綜上可知：本發(fā)明接合酵母(zygosaccharomycessp)菌株的細(xì)胞學(xué)特征為：菌體為圓形；菌落呈奶白色，不透明，表面濕潤(rùn)光滑，邊緣整齊不擴(kuò)散。生理生化特征為：能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖、蜜二糖五種糖；不能利用硝酸鉀和硫酸銨氮源；不能代謝產(chǎn)生類淀粉化合物；具有產(chǎn)酯功能；不能分泌脲酶，分解環(huán)境中的尿素。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對(duì)其他實(shí)施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識(shí)進(jìn)行改動(dòng)。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動(dòng)和變化不脫離本發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。<110>四川劍南春（集團(tuán)）有限責(zé)任公司<120>一種耐高溫、耐酸接合酵母菌株及其應(yīng)用<160>1<210>1<211>600<212>dna<213>接合酵母菌（zygosaccharomycessp）<400>1tcctgaagatttattagaagatggtcaattaagattattagatactgatacttctatagt60tgtacctgttgatactcatattaaacatggacaaactattgaaattatttgaactatttt120tccagctgtagtattattaacaactgcataatagtcagctgaaatttggaatgtattcct180gctgggtacgcagggtcattaggttatgaagacatggacgctgccacttttgccagctgg240gatgtcgattatttgaaatacgataattgctacaataaaggtgagttcgggacaccagaa300atatcttataagagatacaaggctatgtctgatgcactgaataaaactggccgtcccata360ttttactcattatgtaactggggtcaggatttaactttttattggggatccgccatctct420aactcatggagaatgagtggcgatgtttaccctcaatttgacaggcctgacagtagatgt480ccttgctcaggcgatgaatatgactgctcttaccctggattccactgctccataatgaat540atcctaaataaagcagctccaatgggtcaaaatgctgcacctggtggttggaatgattta600當(dāng)前第1頁12