本發(fā)明屬于植物保護(hù)和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因過(guò)表達(dá)菌株降低對(duì)pH敏感性的方法。
背景技術(shù)：
：一些真菌在其與環(huán)境持久的互作過(guò)程中已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制識(shí)別和響應(yīng)其周圍的pH變化。另外，一些真菌依據(jù)其周圍不同pH，能分泌不同的蛋白。為了成功侵入寄主，在侵染過(guò)程中(Botrytiscinerea)灰葡萄孢菌在寄主的不同組織分泌不同的蛋白。盡管只有一些“真正的”毒性因子是成功抑制寄主防御響應(yīng)的，但仍需要不同的胞外分泌蛋白協(xié)同起作用。構(gòu)巢曲霉菌中的7個(gè)蛋白與pH識(shí)別相關(guān)(etal.,2008)，其中的兩個(gè)蛋白PalH和PalI是推測(cè)膜蛋白，PalH(7個(gè)預(yù)測(cè)跨膜螺旋)攜帶有pH識(shí)別活性。通過(guò)對(duì)PACC缺失菌株的研究表明，pH信號(hào)途徑在各種致病真菌毒性中的作用。PACC的缺失會(huì)對(duì)真菌分泌代謝產(chǎn)物或裂解酶產(chǎn)生極大地負(fù)作用。因此，pH信號(hào)途徑似乎控制許多細(xì)胞功能，而這些細(xì)胞功能與病菌的各種侵染過(guò)程相關(guān)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問(wèn)題而提供一種稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因過(guò)表達(dá)菌株降低對(duì)pH敏感性的方法。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)上述目的：本發(fā)明包括以下步驟：(1)分別將稻瘟病菌效應(yīng)蛋白過(guò)表達(dá)菌株接種于pH5和pH8的蕃茄燕麥培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天；(2)用滅菌棉簽將培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿的菌絲刮掉，再將刮掉菌絲的培養(yǎng)基放置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行12小時(shí)黑暗12小時(shí)光照處理3天；(3)用滅菌水清洗培養(yǎng)基表面的孢子，取10μl孢子懸浮液于載玻片上于顯微鏡下進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢量；(4)分別用pH5和pH8的緩沖液清洗孢子，將孢子懸浮液置于洋蔥表皮于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于6h時(shí)于顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)率及附著胞形成率。進(jìn)一步，所述步驟(4)中用pH5和pH8的緩沖液清洗孢子處的孢子是在未經(jīng)調(diào)整pH的蕃茄燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)的孢子。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明是一種稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因過(guò)表達(dá)菌株降低對(duì)pH敏感性的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供一種更為簡(jiǎn)便、有效準(zhǔn)確地確定稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因過(guò)表達(dá)菌株對(duì)不同pH的敏感性，為快速了解過(guò)病原菌效應(yīng)蛋白基因過(guò)表達(dá)菌株的致病性提供了重要的參考依據(jù)。具體實(shí)施方式下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：本發(fā)明包括以下步驟：(1)分別將稻瘟病菌效應(yīng)蛋白過(guò)表達(dá)菌株接種于pH5和pH8的蕃茄燕麥培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天；(2)用滅菌棉簽將培養(yǎng)基表面長(zhǎng)滿的菌絲刮掉，再將刮掉菌絲的培養(yǎng)基放置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行12小時(shí)黑暗12小時(shí)光照處理3天；(3)用滅菌水清洗培養(yǎng)基表面的孢子，取10μl孢子懸浮液于載玻片上于顯微鏡下進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢量；(4)分別用pH5和pH8的緩沖液清洗孢子，將孢子懸浮液置于洋蔥表皮于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于6h時(shí)于顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)率及附著胞形成率。進(jìn)一步，所述步驟(4)中用pH5和pH8的緩沖液清洗孢子處的孢子是在未經(jīng)調(diào)整pH的蕃茄燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)的孢子。分別用pH5和pH8處理稻瘟病菌效應(yīng)蛋白基因過(guò)表達(dá)菌株孢子，統(tǒng)計(jì)產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率及附著胞形成率。本發(fā)明中稻瘟病菌孢子培養(yǎng)、培養(yǎng)及配制、統(tǒng)計(jì)等方法均與常規(guī)相同。本發(fā)明中稻瘟病菌孢子培養(yǎng)、培養(yǎng)及配制、統(tǒng)計(jì)等方法均與常規(guī)相同本發(fā)明的有益效果是全面而準(zhǔn)確地通過(guò)檢測(cè)稻瘟菌效應(yīng)蛋白基因過(guò)表達(dá)菌株孢子的產(chǎn)孢率、孢子萌發(fā)率和附著胞形成率，明確病原菌效應(yīng)蛋白、非生物因子和病原菌三者間的關(guān)系，即病原菌效應(yīng)蛋白基因在稻瘟病菌株內(nèi)過(guò)表達(dá)后對(duì)菌株形態(tài)學(xué)的影響及其對(duì)非生物因子的響應(yīng)?？朔艘延性谘芯糠巧镆蜃印⒉≡?yīng)蛋白基因與病原菌三者關(guān)系時(shí)不確定及無(wú)法開展的弊端，最終達(dá)到為今后研究非生物因子、病原菌效應(yīng)蛋白基因及病原菌三者關(guān)系提供了簡(jiǎn)便清晰地思路方法。具體方法是配制pH5和pH8的培養(yǎng)基，將過(guò)表達(dá)菌株菌絲接種于培養(yǎng)基上，待到10天左右進(jìn)行產(chǎn)孢數(shù)統(tǒng)計(jì)，同時(shí)用pH5和pH8處理過(guò)表達(dá)菌株的孢子，顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)率和附著胞形成率等?？煽焖?、簡(jiǎn)便準(zhǔn)確地了解病原菌效應(yīng)蛋白基因過(guò)表達(dá)菌株產(chǎn)孢率、萌發(fā)率和附著胞形成率對(duì)pH的敏感程度，克服了已有研究病原菌效應(yīng)蛋白基因過(guò)表達(dá)菌株致病機(jī)制的弊端。實(shí)施例一：配制pH5和pH8的培養(yǎng)基，將過(guò)表達(dá)菌株菌絲接種于培養(yǎng)基上，待到10天左右進(jìn)行產(chǎn)孢數(shù)統(tǒng)計(jì)，同時(shí)用pH5和pH8處理過(guò)表達(dá)菌株的孢子，顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)率和附著胞形成率等(表2)。表1pH5處理稻瘟菌效應(yīng)蛋白過(guò)表達(dá)菌株孢子產(chǎn)孢率、萌發(fā)率和附著胞形成率類別產(chǎn)孢率(％)萌發(fā)率(％)附著胞形成率(％)處理(pH5)97.695.898.6對(duì)照①85.684.379.8表2pH8處理稻瘟菌效應(yīng)蛋白過(guò)表達(dá)菌株孢子產(chǎn)孢率、萌發(fā)率和附著胞形成率類別產(chǎn)孢率(％)萌發(fā)率(％)附著胞形成率(％)處理(pH8)94.696.895.6對(duì)照①85.684.379.8以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3