本發(fā)明涉及一種產(chǎn)酪醇的重組菌株及其構(gòu)建方法，屬于微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

酪醇(4-(2-Hydroxyethyl)phenol)是一種天然的抗氧化劑，來源于橄欖油，是苯乙醇的一種衍生物。作為一種抗氧化劑，它可以保護細(xì)胞免受氧化傷害。對于酚類化合物，它具有很大工業(yè)價值。酪醇，以及它的衍生物，是合成各種有機物化合物的合成子。例如，酪醇可被用于制備商業(yè)上能得到的醫(yī)藥劑，如，倍他洛爾和美托洛爾，這些藥劑是選擇性的β1受體阻滯劑，同時可被用于治療高血壓、心絞痛、心力衰竭和青光眼。此外，酪醇可能是羥基酪醇的前體物質(zhì)，羥基酪醇(2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethanol)是一種對于人類健康有益的抗氧化劑，較酪醇而言，它的抗氧化性強于酪醇，同時，它也可以合成很多聚合物。據(jù)有關(guān)研究表明，它具有很多生物性能，它預(yù)防心血管、骨質(zhì)缺乏等疾病的發(fā)生。此外，酪醇還可以用作食品添加劑去改善食品的風(fēng)味，如日本米酒。

由于酪醇巨大的工業(yè)價值，它漸漸得到了工業(yè)界人士的注意。目前，工業(yè)制備酪醇，主要是通過化學(xué)工藝法。現(xiàn)存的化學(xué)合成工藝有很多，例如，苯酚及其苯酚衍生物合成法、羧酸合成法、苯乙醇醇合成法、對硝基甲苯合成法等工藝。對羥基苯乙醇的合成方法很多，但目前國內(nèi)真正實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的僅有以苯酚及其衍生物和苯乙醇為原料進(jìn)行合成，兩種合成方法在工藝研究上比較成熟。以苯乙醇醇合成法為例，大多是采用先保護羥基，然后硝化、還原、重氮化、水解得到對羥基苯乙醇，收率為70％。此途徑中，在硝基還原成氨基的過程中，研究者用不同催化劑可以得到不同產(chǎn)率的胺，主要的催化劑有鉑黑和二氯化錫，所得到的產(chǎn)率分別為90％和88％。這種工藝產(chǎn)率高，但是它的弊端是原料苯乙醇的價格貴，供應(yīng)緊張。其他化學(xué)合成工藝，如對硝基甲苯合成法原料價格相對低廉，貨源較多，成本較低，但步驟較長，產(chǎn)率低，不利于環(huán)境的保護；對羥基苯乙烯合成法產(chǎn)率96％，純度99％，產(chǎn)率和純度都很高，具有一定的價值，但原料成本的大量投入同樣制約了大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。

為了解決上文提到的這些問題，生物合成法合成酪醇已成為研究熱點，2014年天津工業(yè)所Yanfen Bai等將釀酒酵母中的丙酮酸脫羧酶基因ARO10在E.coli MG1655中異源表達(dá)，成功構(gòu)建了產(chǎn)酪醇的重組微生物。隨后，對染色體的改造，成功構(gòu)建了高效合成酪醇的工程菌，產(chǎn)量可達(dá)6.8mM。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一株產(chǎn)酪醇的大腸桿菌(Escherichia coli)BE2，于2016年9月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M2016462，保藏地址為中國武漢，武漢大學(xué)。

本發(fā)明提供的大腸桿菌BE2，將源于釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶基因ARO10、芳香族氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因ARO8，利用基因工程技術(shù)導(dǎo)入經(jīng)過基因工程改造的敲除基因feaB與pheA大腸桿菌BL21(DE3)，在強啟動子T7控制下表達(dá)，成功構(gòu)建大腸桿菌工程菌BE0，在此株菌的基礎(chǔ)上，進(jìn)行化學(xué)誘變，篩選出性能性能優(yōu)化的以酪氨酸為底物過量合成酪醇的重組大腸桿菌突變株BE2。

所述芳香族氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因核苷酸序列如GenBank 852672所示；所述丙酮酸脫羧酶編碼基因核苷酸序列GenBank 851987所示。

所述大腸桿菌BE2的構(gòu)建步驟包括：

a)從釀酒酵母基因組擴增得到含有BamHⅠ和NcoⅠ酶切位點序列的ARO10基因片段；

b)構(gòu)建pRSFDuet-ARO10重組載體：用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、NcoⅠ分別酶切pRSFDuet-1質(zhì)粒以及步驟a)得到的ARO10基因片段，并采用T4DNA連接酶連接反應(yīng)，得到pRSFDuet-ARO10重組載體；

c)從釀酒酵母基因組擴增得到含有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點序列的ARO 8基因片段；

d)構(gòu)建重組載體pRSFDuet-ARO10-ARO8：用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ分別酶切步驟b)得到的重組載體pRSFDuet-ARO10以及步驟c)得到的基因片段ARO8，并采用T4DNA連接酶連接反應(yīng)，得到重組載體pRSFDuet-ARO10-ARO8；

e)用CaCl₂轉(zhuǎn)化法將重組載體pRSFDuet-ARO10-ARO8導(dǎo)入敲除pheA和feaB的大腸桿菌，得到大腸桿菌工程菌BE0；

f)誘變得到重組大腸桿菌突變株BE2。

本發(fā)明還提供應(yīng)用所述大腸桿菌BE2生產(chǎn)酪醇的方法，是以酪氨酸為底物，以大腸桿菌BE2全細(xì)胞作為催化劑合成酪醇。

具體地，培養(yǎng)、收集大腸桿菌BE2菌體，將其置于全細(xì)胞反應(yīng)液中，使其OD₆₀₀約為18，反應(yīng)20h左右。

本發(fā)明提供了生物合成法合成酪醇，將源于釀酒酵母的丙酮酸脫羧酶基因ARO10、芳香族氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因ARO8，在強啟動子T7控制下，使其過表達(dá)，利用基因工程技術(shù)導(dǎo)入敲除基因feaB與pheA的大腸桿菌BL21(DE3)，成功構(gòu)建大腸桿菌工程菌BE0，在此株菌的基礎(chǔ)上，進(jìn)行化學(xué)誘變，篩選出性能優(yōu)化的以酪氨酸為底物過量合成酪醇的重組大腸桿菌突變株BE2，以酪氨酸為底物，用全細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的方法合成酪醇，這種方法具有操作簡單，污染小，產(chǎn)率較高的特點；以10mM酪氨酸為底物，發(fā)酵20h可產(chǎn)酪醇達(dá)8.71mM，酪氨酸轉(zhuǎn)化率可達(dá)87.1％。

生物材料保藏

大腸桿菌(Escherichia coli)BE2，于2016年9月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2016462，保藏地址為中國武漢，武漢大學(xué)。

附圖說明

圖1為大腸桿菌工程菌合成酪醇的途徑；

圖2為實施例1所得的含有特異性酶切位點序列的ARO10基因片段的電泳圖，其中，1為ARO10基因，M為標(biāo)記；

圖3為重組質(zhì)粒pRSFDuet-ARO10的酶切鑒定電泳圖，其中1、2為pRSFDuet-ARO10酶切產(chǎn)物，M為標(biāo)記；

圖4為實施例1所得的含有特異性酶切位點序列的ARO8基因片段電泳圖，其中，1為ARO8基因，M為標(biāo)記；

圖5為所得pRSFDuet-ARO10-ARO8重組質(zhì)粒的酶切鑒定電泳圖，其中1-2：為pRSFDuet-ARO10-ARO8，M為標(biāo)記；

圖6為高效液相色譜測酪醇標(biāo)準(zhǔn)樣品所得到的色譜圖，酪醇的出峰時間在6.02分鐘左右；

圖7為高效液相色譜測重組菌的發(fā)酵液所得到的色譜圖。

具體實施方式

實施例1

一、含有丙酮酸脫羧酶的編碼基因的重組質(zhì)粒pRSFDuet-ARO10的構(gòu)建

根據(jù)已報道的釀酒酵母丙酮酸脫羧酶的編碼基因ARO10核苷酸序列(ARO10基因序列的GenBank號為851987)，設(shè)計如下引物，在上游引物中引入NcoⅠ酶切位點(用下劃線標(biāo)出)，在下游引物中引入BamHⅠ酶切位點(用下劃線標(biāo)出)。

aro101：CATGCCATGGGCATGTCTGAAATTACTTTGGGT

aro102：GGCGCCGCGGATCCTATTTTTTATTTCTTTTA

以釀酒酵母Eby100基因組DNA為模板，以aro101、aro102為引物，進(jìn)行PCR擴增。將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖2所示，得到一條約1908bp的特異性條帶，其大小與GenBank已公布的基因長度一致，經(jīng)進(jìn)一步DNA測序表明擴增得到丙酮酸脫羧酶基因。將擴增得到的ARO10基因和表達(dá)載體pRSFDUet-1重組載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶NcoⅠ與BamHⅠ雙酶切，并采用T4DNA連接酶連接反應(yīng)，構(gòu)建了pRSFDUet-ARO10重組質(zhì)粒。利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切驗證，結(jié)果見圖4，酶切得到大小約3829bp和1908bp的帶，與預(yù)期相當(dāng)，酶切驗證結(jié)果證明的pRSFDUet-ARO10結(jié)構(gòu)正確。圖2中，泳道M為DL 5000DNA Marker，泳道1為ARO10的PCR產(chǎn)物；圖3中，泳道M為DL 5000DNA Marker，泳道1、2為限制性內(nèi)切酶NcoⅠ與BamHⅠ雙酶切后的重組質(zhì)粒pRSFDUet-ARO10。

二、含有芳香族氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶編碼基因的pRSFDUet-ARO10-ARO8重組載體的構(gòu)建

根據(jù)已報道的釀酒酵母芳香族氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因ARO8核苷酸序列(ARO8基因序列的GenBank號為852672)，設(shè)計如下引物，在上游引物中引入NdeⅠ酶切位點(用下劃線標(biāo)出)，在下游引物中引入XhoⅠ酶切位點(用下劃線標(biāo)出)。

aro81：GGAATTCCATATGACTTTACCTGAATCAAAAGAC

aro82：CCGCTCGAGCTATTTGGAAATACCAAATTCTTCGT

以釀酒酵母Eby100基因組DNA為模板，以aro81、aro82為引物，進(jìn)行PCR擴增。將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1泳道2所示，得到一條約1503bp的特異性條帶，其大小與GenBank已公布的基因長度一致，經(jīng)進(jìn)一步DNA測序表明擴增得到丙酮酸脫羧酶基因。將擴增得到的ARO8基因和b步驟一獲得重組載體pRSFDUet-ARO10經(jīng)限制性內(nèi)切酶NdeⅠ與XhoⅠ雙酶切，并采用T4DNA連接酶連接反應(yīng)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pRSFDUet-ARO10-ARO8。利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切驗證，結(jié)果見圖4，酶切得到大小約5737bp和1503bp的帶，與預(yù)期相當(dāng)，酶切驗證結(jié)果證明pRSFDUet-ARO10-ARO8的結(jié)構(gòu)正確。圖4中，泳道M為DL 5000DNA Marker，泳道1為ARO8的PCR產(chǎn)物；圖5中，泳道M為DL 5000DNA Marker，泳道1、2為限制性內(nèi)切酶NdeⅠ與XhoⅠ雙酶切后的重組質(zhì)粒pRSFDUet-ARO10-ARO8。

三、Red同源重組技術(shù)敲除大腸桿菌BL21(DE3)的基因feaB

根據(jù)NCBI公布的基因feaB核苷酸序列(feaB基因序列的GenBank號為945933)，及質(zhì)粒pKD13序列，設(shè)計如下引物，在上游引物中引入與基因序列同源的50bp序列，在下游引物中引入與基因序列同源的50bp序列。

YFeaB1:ATGACAGAGCCGCATGTAGCAGTATTAAGCCAGGTCCAACAGTTTCTCGAGTGTGGCTGGAGCTGCTTC

YFeaB2:TTAATACCGTACACACACCGCTTAGTTTCACACCAACCGTCCAGCCAGTATTCCGGGGATCCGTCGACC

以質(zhì)粒pKD13為模板，以為YFeaB1、YFeaB2引物，進(jìn)行PCR擴增。將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1泳道2所示，得到一條約1503bp的特異性條帶，其大小與GenBank已公布的基因長度一致，經(jīng)進(jìn)一步DNA測序表明擴增得到含有同源臂的基因片段。將擴增得到的基因片段導(dǎo)入含有質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)抗性平板篩選，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR驗證，擴增得到了1780bp的片段，得到整合上抗性標(biāo)記基因的陽性轉(zhuǎn)化子。在42℃消除溫敏型質(zhì)粒pKD46，經(jīng)抗性平板篩選，得到在卡那霉素抗性平板長而不能在氨芐青霉素抗性平板上生長的轉(zhuǎn)化子，在將質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)化上述得到的陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)抗性平板篩選，經(jīng)菌落PCR驗證，擴增得到274bp的片段，鑒定為陽性轉(zhuǎn)化子。將得到的陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)42℃過夜培養(yǎng)，消除質(zhì)粒pCP20，將長出的單菌落經(jīng)抗性平板篩選，得到在卡那霉素抗性平板與氨芐青霉素抗性平板均不長的轉(zhuǎn)化子，此轉(zhuǎn)化子為刪除基因基因feaB的突變株。

四、Red同源重組技術(shù)敲除已刪除基因feaB的大腸桿菌BL21(DE3)的基因pheA

根據(jù)NCBI公布的基因pheA核苷酸序列(pheA基因序列的GenBank號為947081)，及質(zhì)粒pKD13序列，設(shè)計如下引物，在上游引物中引入與基因序列同源的50bp序列，在下游引物中引入與基因序列同源的50bp序列。

YPheA1:AGGCAACACTATGACATCGGAAAACCCGTTACTGGCGCTGCGAGAGAAAAGTGTGGCTGGAGCTGCTTC

YPheA2:TCAGGTTGGATCAACAGGCACTACGTTCTCACTTGGGTAACAGCCCAATAATTCCGGGGATCCGTCGACC

以質(zhì)粒pKD13為模板，以YPheA1、YPheA2為引物，進(jìn)行PCR擴增。將得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％的瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1泳道2所示，得到一條約1503bp的特異性條帶，其大小與GenBank已公布的基因長度一致，經(jīng)進(jìn)一步DNA測序表明擴增得到含有同源臂的基因片段。將擴增得到的基因片段導(dǎo)入含有質(zhì)粒pKD46的已刪除基因feaB的大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)抗性平板篩選，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR驗證，擴增得到了1658bp的片段，得到整合上抗性標(biāo)記基因的陽性轉(zhuǎn)化子。在42℃消除溫敏型質(zhì)粒pKD46，經(jīng)抗性平板篩選，得到在卡那霉素抗性平板長而不能在氨芐青霉素抗性平板上生長的轉(zhuǎn)化子，在將質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)化上述得到的陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)抗性平板篩選，經(jīng)菌落PCR驗證，擴增得到499bp的片段，鑒定為陽性轉(zhuǎn)化子。將得到的陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)42℃過夜培養(yǎng)，消除質(zhì)粒pCP20，將長出的單菌落經(jīng)抗性平板篩選，得到在卡那霉素抗性平板與氨芐青霉素抗性平板均不長的轉(zhuǎn)化子，此轉(zhuǎn)化子即為刪除基因feaB和基因pheA的突變株。命名為BE0。

五、以酪氨酸為底物全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成酪醇的工藝

以得到的宿主BE0，通過全細(xì)胞催化，以酪氨酸為底物，合成酪醇。將重組突變菌BE2接種到20mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，1％的接種量轉(zhuǎn)接50mL新鮮液體LB培養(yǎng)基，以經(jīng)過優(yōu)化的最優(yōu)條件OD₆₀₀＝0.6，加入0.2mM IPTG誘導(dǎo)劑，在25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，收集菌體，將其置于全細(xì)胞反應(yīng)液(100mM Tris-HCl buffer(pH 7.4),10mM MgCl₂,2mM NADH,2mM thiamine pyrophosphate,0.2mM pyridoxal phosphate)中，使其OD₆₀₀約為18，發(fā)酵20h，適當(dāng)時間收集發(fā)酵液，離心取上清，將其用作高效液相色譜分析。

高效液相所用色譜柱為Cosmosil5C18-MS-II column，所用流動相為純甲醇和0.1％三氟乙酸，甲醇的濃度在0～5min從20％增加到80％，之后保持80％濃度10min。高效液相色譜檢測酪醇所用檢測器為紫外檢測器，所用條件洗脫流速為0.4ml/min，檢測波長為222nm。

六、獲得性能優(yōu)化的以酪氨酸為底物過量合成酪醇的重組大腸桿菌突變株

劃出發(fā)菌株大腸桿菌BE0單菌落接種于盛有5ml肉湯培養(yǎng)液的三角瓶中，37℃培養(yǎng)過夜。第二天添加5ml新鮮的肉湯培養(yǎng)液，充分混勻后，分裝成2只三角瓶，繼續(xù)培養(yǎng)5h。將兩只三角瓶的菌液分別倒入離心管中，3500rpm離心10min，棄去上清液，打勻沉淀，其中一管吸入5ml生理鹽水，然后倒入另一離心管，二管并成一管。吸取菌液1ml于離心管中，冰凍1h，制成靜止細(xì)胞。加入5ml醋酸緩沖液(pH＝4.0)，再加入13.8mg亞硝酸鈉，于37℃下誘變處理5～8min。加入0.1mol/LNaOH中和至pH＝7.0，中止亞硝酸作用。處理后的菌液經(jīng)過處理，后培養(yǎng)后，涂布于含有青霉素的平板上，培養(yǎng)12h，通過青霉素法淘汰野生型，篩選得到500個突變株。將得到500個突變株接種到10mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，1％的接種量轉(zhuǎn)接10mL新鮮液體LB培養(yǎng)基，以經(jīng)過優(yōu)化的最優(yōu)條件OD₆₀₀＝0.6，加入0.2mM IPTG誘導(dǎo)劑，在25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8h，收集菌體，將其置于全細(xì)胞反應(yīng)液中，使其OD₆₀₀約為18，發(fā)酵20h，收集發(fā)酵液，離心取上清，將其用作高效液相色譜分析。

經(jīng)發(fā)酵實驗，篩選出一株性能優(yōu)化的以酪氨酸為底物過量合成酪醇的重組大腸桿菌突變株。以10mM酪氨酸為底物，重組菌株BE0可產(chǎn)酪醇達(dá)6.7mM，在重組菌株BE0基礎(chǔ)上，經(jīng)過化學(xué)誘變得到的菌株BE2，可產(chǎn)酪醇達(dá)8.71mM。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種產(chǎn)酪醇的重組菌株及其構(gòu)建方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 1

catgccatgg gcatgtctga aattactttg ggt 33

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 2

ggcgccgcgg atcctatttt ttatttcttt ta 32

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 3

ggaattccat atgactttac ctgaatcaaa agac 34

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 4

ccgctcgagc tatttggaaa taccaaattc ttcgt 35

<210> 5

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 5

atgacagagc cgcatgtagc agtattaagc caggtccaac agtttctcga gtgtggctgg 60

agctgcttc 69

<210> 6

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 6

ttaataccgt acacacaccg cttagtttca caccaaccgt ccagccagta ttccggggat 60

ccgtcgacc 69

<210> 7

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 7

aggcaacact atgacatcgg aaaacccgtt actggcgctg cgagagaaaa gtgtggctgg 60

agctgcttc 69

<210> 8

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列，用于PCR

<400> 8

tcaggttgga tcaacaggca ctacgttctc acttgggtaa cagcccaata attccgggga 60

tccgtcgacc 70