本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種基因無標(biāo)記缺失突變體的篩選方法，具體涉及一種柑橘潰瘍病菌hfq基因無標(biāo)記缺失突變體的篩選方法。
背景技術(shù)：
：柑橘潰瘍病菌(拉丁名：Xanthomonascitrisubsp.citri,Xcc)為假單胞菌目、黃單胞菌科、黃單胞桿菌屬，引起柑橘潰瘍病。革蘭氏陰性菌，好氣性，短桿菌。造成的病害主要發(fā)生在葉、小枝、刺、老枝和果實上，引起落果和落葉。目前在細菌中應(yīng)用的基因突變策略主要有三種：(1)攜帶目的基因部分片段的自殺載體通過單交換同源重組實現(xiàn)基因插入突變；(2)轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)目的基因體外突變，然后與目的基因雙交換同源重組實現(xiàn)基因插入或缺失；(3)自殺載體中引入負選擇標(biāo)記，實現(xiàn)目標(biāo)基因無標(biāo)記缺失，這種突變具有不引入抗生素基因，且一次可敲除多個基因等優(yōu)點。自殺載體是指能在一種宿主內(nèi)復(fù)制但在另一宿主中卻不能的質(zhì)粒或噬菌體?？莶菅挎邨U菌的SacB基因被引入至異源宿主(主要是革蘭氏陰性菌)時，其在外源蔗糖存在的情況下會導(dǎo)致宿主死亡。SacB基因介導(dǎo)的無標(biāo)記基因缺失突變體系已經(jīng)廣泛運用到多種革蘭氏陰性和陽性細菌中，其中常用的自殺載體就是pK18mobSacB。革蘭氏陰性植物病原菌在SacB基因的存在下，于5％-10％的蔗糖培養(yǎng)基上產(chǎn)生致死表型。該基因介導(dǎo)的無標(biāo)記基因缺失體系，需通過同源雙交換來進行，傳統(tǒng)的方法是先擴增缺失基因的上下游側(cè)翼序列，然后經(jīng)過酶切連接等手段將上下側(cè)翼序列連接到自殺載體pK18mobSacB(該載體上面還有卡那霉素抗性基因)，轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒到宿主細胞。經(jīng)卡那霉素和無糖固體培養(yǎng)基篩選經(jīng)電轉(zhuǎn)將質(zhì)粒整合到宿主基因組上的重組子。篩選的轉(zhuǎn)化子經(jīng)無糖培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到含5％-10％蔗糖的液體培養(yǎng)基，使其產(chǎn)生蔗糖篩選壓力。最后將蔗糖液體培養(yǎng)基的菌液涂布到蔗糖固體培養(yǎng)基，獲得單菌落，并將這些單菌落一一劃線到有抗和無抗平板上，對比有抗平板上不能生長而在無抗平板上能生長的菌落進行PCR檢測，尋找突變體，最后進行一系列驗證。傳統(tǒng)的篩選方法效率較低，且工作量大。并且，目前沒有關(guān)于柑橘潰瘍病菌hfq基因無標(biāo)記缺失突變體的相關(guān)研究報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對上述技術(shù)問題，提供一種柑橘潰瘍病菌hfq基因無標(biāo)記缺失突變體的篩選方法，包括如下步驟：(1)提取柑橘潰瘍病菌基因組DNA；(2)缺失hfq基因的重組自殺質(zhì)粒載體的構(gòu)建：A、分別擴增柑橘潰瘍病菌hfq基因上、下游側(cè)翼序列：以柑橘潰瘍病菌基因組DNA為模板，以引物Hfq-up-F、Hfq-up-R擴增柑橘潰瘍病菌hfq基因上游側(cè)翼序列，以引物Hfq-down-F、Hfq-down-R擴增柑橘潰瘍病菌hfq基因下游側(cè)翼序列；所述引物Hfq-up-F、Hfq-up-R、Hfq-down-F、Hfq-down-R的序列為：Hfq-up-F：TGGGATCCCGCGTGTTGAAGGTGGTATT，Hfq-up-R：TGGGTACCCGAAAAATCCTCTTCATTATTGT，Hfq-down-F：TGGGTACCCGGAGTAGTGCGTGTTTGATC，Hfq-down-R：GCTCTAGAAAGCCTCTGCACCGGTCAACA；B、分別回收步驟A得到的柑橘潰瘍病菌hfq基因上、下游側(cè)翼序列PCR擴增產(chǎn)物片段；C、將步驟B的回收產(chǎn)物分別與載體pEASY-T1vector連接，得到上游T-載體連接產(chǎn)物和下游T-載體連接產(chǎn)物；D、將步驟C得到的上游/下游T-載體連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌；E、提取步驟D中的陽性克隆的質(zhì)粒，分別得到上游T-載體重組質(zhì)粒和下游T-載體重組質(zhì)粒；F、用BamHI和KpnI雙酶切上游T-載體重組質(zhì)粒，用KpnI和XbaI雙酶切下游T-載體重組質(zhì)粒，用BamHI和XbaI雙酶切質(zhì)粒pK18mobSacB；G、將步驟F得到的上/下游T-載體重組質(zhì)粒與質(zhì)粒pK18mobSacB酶切后產(chǎn)物進行連接，將連接液轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌感受態(tài)，保存經(jīng)篩選獲得的陽性克隆即缺失hfq基因的重組自殺質(zhì)粒載體；(3)將步驟G構(gòu)建好的缺失hfq基因的重組自殺質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化柑橘潰瘍病菌感受態(tài)細胞，挑取轉(zhuǎn)化后經(jīng)Kan+無糖NA篩選的單菌落；(4)將步驟(3)挑取的單菌落用蔗糖培養(yǎng)基篩選，即得突變體。所述步驟A中分別擴增柑橘潰瘍病菌hfq基因上、下游側(cè)翼序列，擴增上、下游側(cè)翼序列的PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMix10μL、10mM的上下游引物各0.5μL、濃度為100～200ng/μL的柑橘潰瘍病菌基因組DNA0.5μL、加ddH2O補足至20μL；擴增上游側(cè)翼序列的PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，32個循環(huán)；72℃10min；擴增下游側(cè)翼序列的PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性15s，58℃退火15s，72℃延伸40s，32個循環(huán)；72℃10min。本發(fā)明的另一方面提供了一種用蔗糖培養(yǎng)基篩選柑橘潰瘍病菌hfq基因無標(biāo)記缺失突變體的方法，包括如下步驟：(1)挑取前述步驟(3)中缺失hfq基因的重組自殺質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化柑橘潰瘍病菌感受態(tài)細胞后經(jīng)Kan+無糖NA篩選的單菌落，接到無蔗糖的NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；(2)將步驟(1)擴繁的菌液轉(zhuǎn)接到新的無糖NB培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)4-5代；(3)將步驟(2)獲得的菌液，稀釋后涂布到Kan+無糖NA的篩選培養(yǎng)基上，28～30℃，放置24～36h；(4)將步驟(3)獲得的單菌落一一劃線到含有5～10％的蔗糖的NA培養(yǎng)基，28～30℃，培養(yǎng)68～72h；(5)將步驟(4)獲得的菌落，再一一劃線到對應(yīng)的Kan+無糖NA和5～10％蔗糖NA板上，放置24～36h；(6)將步驟(5)中抗性平板上不能生長而在無抗平板上能生長的菌落，進行初步驗證突變；(7)將步驟(6)獲得的疑似突變體菌落，挑到NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)傳代，將能穩(wěn)定遺傳的菌落進行驗證，得到柑橘潰瘍病菌hfq基因無標(biāo)記缺失突變體。在上述技術(shù)方案中，所述步驟(6)中驗證突變的方法為PCR驗證：提取突變體的基因組DNA，用檢測突變的引物Hfq-F/Hfq-R驗證缺失片段的大小是否與目的基因hfq的大小一致，所述引物Hfq-F/Hfq-R的序列為：Hfq-F：GCTTCAGGCGTGTAACATCC，Hfq-R：GCGAACTCCTCCAACACATC。作為優(yōu)選地，所述步驟(6)中驗證突變的方法為測序驗證或者Southernblot驗證。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明首次成功篩選出了柑橘潰瘍病菌hfq基因無標(biāo)記缺失突變體，為進一步研究hfq的致病機理、鑒定hfq直接調(diào)控靶標(biāo)，以及發(fā)掘與hfq相互作用的sRNA等奠定基礎(chǔ)，同時為柑橘潰瘍病菌的防治研究工作奠定了良好的基礎(chǔ)。本發(fā)明的蔗糖培養(yǎng)基篩選柑橘潰瘍病菌hfq基因無標(biāo)記缺失突變體的方法成功地得到了突變體，解決了傳統(tǒng)蔗糖培養(yǎng)基篩選方法找不到突變體或者需要大量的挑單菌落劃線才能找到很少的突變體的問題，本發(fā)明方法工作量大大減少、篩選效率更高。附圖說明圖1是本發(fā)明方法的流程示意圖，1：擴增側(cè)翼序列；2：側(cè)翼序列融合；3：缺失載體；4、5：第一次交換；6：第二次交換；7：缺失突變體。圖2是缺失hfq基因的重組自殺質(zhì)粒載體的PCR產(chǎn)物電泳圖譜，M：maker2000；1、2、3、4、5、6、7、8為缺失hfq基因的重組質(zhì)粒樣品；9為負對照；10為基因組DNA對照。圖3是篩選出的疑似突變體菌落用引物Hfq-F/Hfq-R驗證的PCR產(chǎn)物電泳圖譜，M：maker5000；1-37為菌落樣品，其中驗證發(fā)現(xiàn)13、14、34為缺失突變體，38為缺失重組質(zhì)粒正對照。圖4是突變體基因組DNA用引物SacBF/SacBRPCR擴增后的電泳檢測圖譜，M：maker2000；1-8為突變體樣品；9為負對照；10為重組質(zhì)粒載體。圖5是突變體Southernblot檢測結(jié)果，1、2：突變體，3：Xcc野生型對照。圖6是突變體生長曲線測定結(jié)果圖。圖7是突變體游動性檢測結(jié)果圖。圖8是傳統(tǒng)的蔗糖培養(yǎng)基篩選突變體的部分PCR產(chǎn)物電泳圖譜，M：maker2000；1-38為篩選出的菌落樣品。具體實施方式實施例一、準(zhǔn)備實驗材料一、培養(yǎng)基的配置用于E.coli培養(yǎng)的液體和固體培養(yǎng)基的各組分為：Tryptone10g/L、NaCl10g/L、YeastExtract5g/L，加水溶解，最后定容至1000mL，調(diào)pH7.0-7.2，分裝后高壓滅菌。LB固體培養(yǎng)基另加Agar15g/L。用于黃單胞菌培養(yǎng)的NA固體和NB液體培養(yǎng)基的各組分為：Polypeptone5g/L、Sucrose10g/L、YeastExtract1g/L、牛肉浸膏3g/L、Agar15g/L，加水溶解，最后定容至1000mL，調(diào)pH7.0-7.2，分裝后高壓滅菌，NB液體培養(yǎng)基去掉Agar。二、主要試劑及來源細菌基因組DNA提取試劑盒：美國Axygen公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒：美國Promega公司；Southern雜交試劑盒：德國Roche公司；BamHI、KpnI、KpnI、XbaI、BMJM109感受態(tài)細胞、DH5α大腸桿菌：日本Takara公司；SphI、instantsticky-endligasematermix：美國NEB公司；2×TaqPCRMix：北京艾德萊公司生物科技有限公司；pEASY-T1vector：北京全氏金生物技術(shù)有限公司；pK18mobSacB質(zhì)粒：福建農(nóng)林大學(xué)鄒華松教授惠贈；本實施例使用的柑橘潰瘍病菌株是29-1：上海交通大學(xué)陳功友教授惠贈。實施例二、柑橘潰瘍病菌hfq基因無標(biāo)記缺失突變體的篩選其流程如圖1所示，具體按照如下步驟操作：一、提取柑橘潰瘍病菌基因組DNA采用Axygen公司細菌基因組DNA提取試劑盒來提取柑橘潰瘍病菌細菌培養(yǎng)物的總DNA。二、缺失hfq基因的重組自殺質(zhì)粒載體的構(gòu)建1、擴增柑橘潰瘍病菌hfq基因上下游側(cè)翼序列(1)擴增柑橘潰瘍病菌hfq基因上游側(cè)翼序列，擴增引物為：Hfq-up-F：TGGGATCCCGCGTGTTGAAGGTGGTATT(SEQIDNo:1，下劃線處為BamHI酶切位點)Hfq-up-R：TGGGTACCCGAAAAATCCTCTTCATTATTGT(SEQIDNo:2，下劃線處為KpnI酶切位點)以前面提取的柑橘潰瘍病菌基因組DNA為模板，用引物Hfq-up-F、Hfq-up-R擴增柑橘潰瘍病菌hfq基因上游側(cè)翼序列，反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMix(含染料2)10μLHfq-up-F(10mM)0.5μLHfq-up-R(10mM)0.5μLddH2O8.5μL柑橘潰瘍病菌基因組DNA(100-200ng/μL)0.5μLPCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s，32個循環(huán)；72℃10min。將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，擴增出的正確片段長度為480bp。(2)擴增柑橘潰瘍病菌hfq基因下游側(cè)翼序列，擴增引物為：Hfq-down-F：TGGGTACCCGGAGTAGTGCGTGTTTGATC(SEQIDNo:3，下劃線處為KpnI酶切位點)Hfq-down-R：GCTCTAGAAAGCCTCTGCACCGGTCAACA(SEQIDNo:4，下劃線處為XbaI酶切位點)以前面提取的柑橘潰瘍病菌基因組DNA為模板，用引物Hfq-down-F、Hfq-down-R擴增柑橘潰瘍病菌hfq基因下游側(cè)翼序列，反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMix(含染料2)10μLHfq-down-F(10mM)0.5μLHfq-down-R(10mM)0.5μLddH2O8.5μL柑橘潰瘍病菌基因組DNA(100-200ng/μL)0.5μLPCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性15s，58℃退火15s，72℃延伸40s，32個循環(huán)；72℃10min。將擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，擴增出的正確片段長度為680bp。2、柑橘潰瘍病菌hfq基因上、下游側(cè)翼序列的PCR產(chǎn)物回收將前述的柑橘潰瘍病菌hfq基因上、下游側(cè)翼序列PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳后用Promega公司的膠回收試劑盒進行回收，分別得到回收的上、下游側(cè)翼序列PCR產(chǎn)物。3、PCR純化產(chǎn)物連接用pEASY-T1vector將前述回收得到的上、下游側(cè)翼序列PCR產(chǎn)物分別直接與載體連接，連接體系如下：pEASY-T1vector1μL上/下游側(cè)翼序列PCR回收產(chǎn)物0.5-4μL加ddH2O至3-5μL輕輕混合，室溫反應(yīng)10min，分別得到上游T-載體連接產(chǎn)物和下游T-載體連接產(chǎn)物。4、將上游/下游T-載體連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌，按照如下步驟操作：(1)將上游/下游T-載體連接產(chǎn)物稍許離心后加到置于冰上的1.5mL離心管中；(2)取出BMJM109感受態(tài)細胞，放置在冰水浴中直至融化，輕輕振動離心管使之混勻；(3)在準(zhǔn)備的每個轉(zhuǎn)化管中加入50μL感受態(tài)細胞；(4)輕輕振動小管混勻，冰水浴30min，在42℃水浴中熱擊60～90s；(5)迅速冰水浴2min；(6)向轉(zhuǎn)化細胞中加平衡至室溫的800μLLB液體培養(yǎng)基，在37℃，150rpm搖床中復(fù)蘇培養(yǎng)1～1.5h；(7)室溫4000rpm離心5min，倒去上清液，余下100～150μL上清重懸菌體，將重懸菌體涂到IPTG、X-Gal加入到預(yù)先加入了卡那霉素的固體LB培養(yǎng)平板上，將平板于37℃倒置過夜培養(yǎng)，至藍、白斑區(qū)分明顯為止。轉(zhuǎn)化子檢測及測序：(1)菌落平均直徑2mm左右時，取出平板正置于4℃1h使藍白斑清晰；用火焰滅菌的鑷子夾取滅菌10μL槍頭挑取白色單克隆菌斑，涂抹至PCR管底，再接種至1mLLB+Kan液體培養(yǎng)基(按1mLLB液體培養(yǎng)基加1μL50mg/mLKan)，37℃恒溫條件下220rmp振蕩培養(yǎng)8h。(2)選菌液PCR陽性樣品2-3個進行雙向測序(每管取500μL菌液)，剩余菌液可加40％滅菌甘油使其終濃度為20％，-20℃保存。5、重組白斑質(zhì)粒的提取將送基因測序正確的陽性克隆的菌液擴大培養(yǎng)，取5mL用Promega公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，得到上游T-載體重組質(zhì)粒和下游T-載體重組質(zhì)粒。6、上、下游T-載體重組質(zhì)粒及自殺載體的雙酶切(1)上游T-載體重組質(zhì)粒的酶切位點是BamHI和KpnI，下游T-載體重組質(zhì)粒的酶切位點是KpnI和XbaI。在1μg的上/下游T-載體重組質(zhì)粒中添加10U的限制性內(nèi)切酶，在50μL的反應(yīng)體系中，37℃下反應(yīng)1h可以完全降解DNA。上游T-載體重組質(zhì)粒的酶切體系為：下游T-載體重組質(zhì)粒酶切體系為：(2)pK18mobSacB質(zhì)粒的提取、酶切、與回收(BamHI和XbaI)(見NEB雙酶切試劑盒)。將上/下游T-載體重組質(zhì)粒與pK18mobSacB質(zhì)粒酶切的目的片段分別回收，備用。7、將前述回收得到的上/下游T-載體重組質(zhì)粒與pK18mobSacB質(zhì)粒酶切的目的片段進行連接，構(gòu)建缺失hfq的重組質(zhì)粒。連接體系為：上/下游T-載體重組質(zhì)粒酶切的目的片段(10ng/μL)各2.5μL，instantsticky-endligasematermix2μL，用移液槍混7-10次，然后加0.5μLpK18mobSacB質(zhì)粒酶切的目的片段和3μL的instantsticky-endligasematermix，用移液槍混7-10次。最后將連接液轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌感受態(tài)中，并用卡那霉素(Kan)篩選重組質(zhì)粒，挑選單克隆搖菌，做菌液PCR，并送菌液進行基因測序，將陽性克隆的菌液以40％的甘油保存在-80℃，即得到缺失hfq基因的重組自殺質(zhì)粒載體。重組質(zhì)粒的提取、驗證方法參考前述步驟“5、重組白斑質(zhì)粒的提取”。缺失hfq基因的重組自殺質(zhì)粒載體PCR驗證結(jié)果，如圖2所示，與野生型相比，重組自殺質(zhì)粒載體剛剛?cè)笔У鬶fq基因279bp的片段，說明成功構(gòu)建了缺失質(zhì)粒。三、制備柑橘潰瘍病菌的感受態(tài)細胞按照如下步驟操作：(1)柑橘潰瘍病菌在NA平板上28℃生長活化,將單菌落細胞接入3mLNB液體培養(yǎng)基中；(2)28℃震蕩培養(yǎng)(180rpm)24h至OD600＝1.0，吸取1mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入100mL新的NB液體培養(yǎng)基中28℃繼續(xù)培養(yǎng)8-14h，至OD600＝0.6左右；(3)將菌液轉(zhuǎn)至預(yù)先冷卻的50mL滅菌的離心管中，冰上放置l0min，冰上冷凍10min，使其停止生長(后面步驟需在冰浴條件完成)；(4)4℃,6000rpm離心l0min收集菌體，倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min使殘留的痕量培養(yǎng)液流盡；(5)收集的菌體細胞用30mL10％的甘油(滅菌預(yù)冷)于4℃,6000rpm離心l0min，洗滌三次；(6)最后的菌體細胞用0.5mL10％預(yù)冷的甘油定容，使感受體細胞濃度達到l08cfu/mL，感受態(tài)細胞分裝為90μL/管，儲存在-70℃下備用。四、重組自殺質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化柑橘潰瘍病菌將前述步驟二中構(gòu)建好的缺失hfq基因的重組自殺質(zhì)粒載體通過電擊轉(zhuǎn)化到柑橘潰瘍病菌的感受態(tài)中，按照如下步驟操作(除電擊步驟，其他均需無菌操作)：(1)將制備好的感受態(tài)放在冰盒中解凍，同時將經(jīng)過滅菌處理過的電擊杯和重組子放在冰上預(yù)冷。(2)加10μL待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒到融化的90μL感受態(tài)中，放置30min，吸入電擊杯中，注意不要有氣泡。(3)將儀器電壓升到2.0KV。(4)把裝好細胞的電脈沖杯外壁檫干，并放入接應(yīng)器上，把接應(yīng)器推至電極之間，用食指和中指同時按住兩個脈沖鍵，聽到“吱”聲放電完畢后放手，脈沖時間一般為3ms；(5)立即取出電脈沖杯，并在10s內(nèi)加入1mL的無糖NB培養(yǎng)基。(6)無菌條件下降混合物轉(zhuǎn)入2mL離心管中，28℃180rpm振蕩培養(yǎng)3h，濃度盡量大一些。(7)5000rpm離心3min，吸去部分上清，留100-200μL菌液混合后均勻涂布到不含蔗糖含Km50μg/mLNA培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)3天觀察是否長出單菌落。五、利用同源雙交換篩選突變體(1)挑取電轉(zhuǎn)后經(jīng)Kan+無糖NA篩選的單菌落，接到3mL無蔗糖的NB培養(yǎng)基中28℃，200rmp培養(yǎng)過夜，使得菌液濃度盡量大一些。(2)轉(zhuǎn)接30μL菌液到新的3mL無糖NB里面，連續(xù)培養(yǎng)4-5代，至OD＝0.5。(3)將前面獲得的OD＝0.5的菌液，按照10倍比稀釋105，吸取60μL涂布到Kan+無糖NA的篩選培養(yǎng)基上，28℃，放置24h。(4)將獲得的單菌落一一劃線到含有10％的蔗糖的NA培養(yǎng)基，劃100單菌落，28℃，培養(yǎng)72h，觀察菌落的生長情況。(5)將獲得10％蔗糖NA板上的菌落，再一一劃線到對應(yīng)的10％蔗糖NA和Kan+無糖NA板上，放置24h，觀察兩個板上菌落生長情況。(6)將抗性板上不能生長而在10％蔗糖NA板上生長的菌落，進行菌落PCR初步驗證突變。(7)將獲得的疑似突變體菌落，挑到NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)傳代5次，看是否能穩(wěn)定遺傳，將能夠穩(wěn)定遺傳的保存菌液。六、缺失突變體的驗證1、采用PCR驗證A、參照NCBI中XanthomonasaxonopodisXac29-1全基因組設(shè)計hfq的上下游引物：hfq基因上游引物Hfq-F:GCTTCAGGCGTGTAACATCC(SEQIDNo:5)，hfq基因下游引物Hfq-R:GCGAACTCCTCCAACACATC(SEQIDNo:6)。提取步驟“五、利用同源雙交換篩選突變體”中步驟(7)中能夠穩(wěn)定遺傳的菌液的基因組DNA，用檢測突變的引物Hfq-F/Hfq-R驗證缺失片段的大小是否與目的基因一致。在100個菌落中篩選到6個突變體，100個菌落的部分PCR電泳圖譜如圖3所示，圖中13、14、34為缺失突變體，38為缺失重組質(zhì)粒正對照。B、用pK18mobSacB的引物SacBF/SacBR驗證自殺載體是否存在，引物序列為：SacBF：GATCTAGAAAGAAACGAACCAAAAGGCCATATAAG(SEQIDNo:7)；SacBR：CAGTCGACCTATTTGTTAACTGTTAATTGTCC(SEQIDNo:8)。在突變體中不能檢測到SacB基因，與預(yù)期一致，部分檢測結(jié)果如圖4所示。2、測序驗證用引物Hfq-F/Hfq-R擴增突變體的基因組DNA，并將目的片段進行測序，結(jié)果顯示缺失片段剛好是目的基因。3、Southernblot驗證主要實驗步驟如下：(1)提取柑橘潰瘍病菌基因組DNA操作步驟參照細菌基因組DNA小量提取試劑盒(Axygen)。nanodrop檢測基因組DNA的濃度，1％的瓊脂糖電泳純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?2)基因組DNA酶切使用NEB公司SphI限制性內(nèi)切酶于37℃下酶切4h，具體的酶切體系如下：(3)DNA酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳(4)探針制備設(shè)計探針引物，進行常規(guī)PCR擴增，做瓊脂糖凝膠電泳，對目的帶切膠回收，進行地高辛(DIG)標(biāo)記。各個樣品加樣量如下：移液槍吹打，充分混勻，37℃處理20h，65℃處理10min終止反應(yīng)，得到探針。(5)探針標(biāo)記效率(濃度)檢測。(6)轉(zhuǎn)膜。(7)雜交。(8)洗膜。(9)免疫檢測。檢測結(jié)果如圖5所示，突變體和野生型對照相比缺失了hfq基因片段大小。4、生長曲線測定挑選活化后野生型、突變體單菌落，采用新鮮的NB液體培養(yǎng)基，28℃，200rpm，過夜培養(yǎng)，調(diào)節(jié)三者OD600＝0.6，按照1:1000的比例轉(zhuǎn)接至5mL新鮮的NB液體培養(yǎng)基。28℃，200rpm每隔2h測一次OD600值，試驗設(shè)置3個重復(fù)，取平均值作圖，結(jié)果如圖6所示，可見，缺失hfq基因能引起Xcc菌株在NB培養(yǎng)基中的對數(shù)期和平臺期都較野生型菌株晚，同時也表明缺失該基因會影響Xcc的生長。5、游動性檢測挑選活化后野生型、突變體單菌落，采用新鮮的NB液體培養(yǎng)基，28℃，200rpm，過夜培養(yǎng)，調(diào)節(jié)三者OD600＝0.6，吸取2μL菌液于0.3％瓊脂糖NA固體培養(yǎng)基上，28℃，培養(yǎng)48h，觀察菌落生長情況，并測量菌落直徑，拍照。試驗設(shè)置3個重復(fù)，重復(fù)3次實驗。結(jié)果如圖7所示，可見，突變體游動性明顯降低，該基因?qū)cc的鞭毛有重要作用。實施例三、傳統(tǒng)的和改進后的蔗糖培養(yǎng)基篩選突變體方法的對比一、傳統(tǒng)的蔗糖培養(yǎng)基篩選突變體步驟為：(1)挑取電轉(zhuǎn)后經(jīng)Kan+無糖NA篩選的單菌落，接到3mL無蔗糖的NB培養(yǎng)基中28℃，200rmp培養(yǎng)過夜。(2)將上一步擴繁的菌液按照1:100的比例，轉(zhuǎn)接到10％的蔗糖NB培養(yǎng)基中28℃，200rmp傳代3-4次；(3)將傳代后OD600＝0.5的菌液稀釋101、102、103、104、105，吸取60μL涂在10％的蔗糖NA板上，28℃，培養(yǎng)72h；(4)將10％蔗糖NA板上的單菌落一一劃線到Kan+無糖NA(有抗)和10％蔗糖NA(無抗)的平板上，劃100單菌落，28℃，培養(yǎng)36h，觀察菌落的生長情況。(5)對無抗平板上能生長，有抗平板上不能生長的菌落進行PCR驗證。(6)將獲得的疑似突變體菌落，挑到NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)傳代5次，看是否能穩(wěn)定遺傳，并保存菌液。二、改進后的蔗糖培養(yǎng)基篩選突變體步驟為：(1)挑取電轉(zhuǎn)后經(jīng)Kan+無糖NA篩選的單菌落，接到3mL無蔗糖的NB培養(yǎng)基中28℃，200rmp培養(yǎng)過夜。(2)將上一步擴繁的菌液按照1:100的比例轉(zhuǎn)接到新的無糖NB里面，連續(xù)培養(yǎng)4-5代，至OD600＝0.5。(3)將前面獲得的OD600＝0.5的菌液，按照10倍比稀釋101、102、103、104、105，吸取60μL涂布到Kan+無糖NA的篩選培養(yǎng)基上，28℃，放置24h。(4)將Kan+無糖NA獲得的單菌落一一劃線到含有10％的蔗糖的NA培養(yǎng)基，劃100單菌落，28℃，培養(yǎng)72h，觀察菌落的生長情況。(5)將獲得10％蔗糖NA板上的菌落，再一一劃線到對應(yīng)的Kan+無糖NA(有抗)和10％蔗糖NA(無抗)板上，放置24h，觀察兩個板上菌落生長情況。(6)將抗性板上不能生長而在無抗板上生長的菌落，進行菌落PCR初步驗證突變。(7)將獲得的疑似突變體菌落，挑到NB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，連續(xù)傳代5次，看是否能穩(wěn)定遺傳，并保存菌液。三、將兩種方法對比，可以發(fā)現(xiàn)改進后的篩選方法更能降低第一次交換成功的菌株，在蔗糖存在下，發(fā)生第二次交換并回復(fù)為野生型菌株的數(shù)量。進而增加篩選缺失突變體的概率。改進后的方法較傳統(tǒng)方法的優(yōu)點主要體現(xiàn)在：(1)篩選效率更高傳統(tǒng)的方法，就Xcc中hfq基因做了1000個以上的單菌落劃線沒有找到一個突變體，發(fā)現(xiàn)一半以上在蔗糖壓力下回復(fù)到野生型，另外一部分則不發(fā)生第二次交換，部分篩選結(jié)果如圖8所示。改進后的方法100個單菌落劃線可以找到5-10個突變體(部分篩選結(jié)果如圖3所示)，另有少數(shù)幾個不發(fā)生雙交換，另外的恢復(fù)到野生型。(2)減少工作量傳統(tǒng)的方法需要大量的挑單菌落劃線，優(yōu)化后只需要最多劃線100個就能篩選到突變體。序列表<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所<120>柑橘潰瘍病菌hfq基因無標(biāo)記缺失突變體的篩選方法<130>1<160>8<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<223>Hfq-up-F<400>1tgggatcccgcgtgttgaaggtggtatt28<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<223>Hfq-up-R<400>2tgggtacccgaaaaatcctcttcattattgt31<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<223>Hfq-down-F<400>3tgggtacccggagtagtgcgtgtttgatc29<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<223>Hfq-down-R<400>4gctctagaaagcctctgcaccggtcaaca29<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>Hfq-F<400>5gcttcaggcgtgtaacatcc20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>Hfq-R<400>6gcgaactcctccaacacatc20<210>7<211>35<212>DNA<213>人工序列<223>SacBF<400>7gatctagaaagaaacgaaccaaaaggccatataag35<210>8<211>32<212>DNA<213>人工序列<223>SacBR<400>8cagtcgacctatttgttaactgttaattgtcc32當(dāng)前第1頁1 2 3