一種抑制柑橘潰瘍病菌生長的化合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及化合物的新用途，闡明藥物化學結構與細菌的生物活性之間的關系， 更具體的說，是探索化合物對柑橘潰瘍病菌的抑菌和殺菌活性。
【背景技術】
[0002] 柑橘是重要的熱帶亞熱帶果樹，生產(chǎn)分布廣泛，全世界有145個國家生產(chǎn)柑橘，產(chǎn) 量居世界水果之首。據(jù)FA0統(tǒng)計，2011年世界W橘總產(chǎn)量達到1. 29億噸，占世界水果總產(chǎn) 量的21. 2%。中國是世界第一大柑橘生產(chǎn)國，據(jù)國家農(nóng)業(yè)統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2011年柑橘栽培面積達 3432. 5萬畝，產(chǎn)量達2944萬噸。柑橘在我國熱帶、亞熱帶地區(qū)的19個大陸地區(qū)?。ㄊ小^(qū)） 廣泛栽培，其中湖南是最大的柑橘生產(chǎn)省份，2011年面積達到586. 2萬畝，產(chǎn)量達到420. 4 萬噸。柑橘己經(jīng)成為我國南方最主要的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)支柱之一。然而，與其他農(nóng)作物一樣，柑橘 也受到各種病蟲生物的為害，目前在我國柑橘上為害最為嚴重的是黃龍病和潰瘍病。這兩 個病均是檢疫性細菌病害。黃龍病主要在熱量較高的華南柑橘產(chǎn)區(qū)為害嚴重，在湖南大多 數(shù)地區(qū)其傳播媒介一一木風不能越冬，所以該病僅在靠近華南的湘南地區(qū)有零星發(fā)病。柑 橘潰瘍病在我國最早于1919年有發(fā)病報道，隨后蔓延至多省柑橘主產(chǎn)區(qū)?，F(xiàn)在15個省區(qū) 有發(fā)生，其中廣東、廣西、福建、江西、浙江、湖南、臺灣等主產(chǎn)省及云南、貴州等柑橘產(chǎn)區(qū)發(fā) 生較普遍，在其他地區(qū)有零星分布。
[0003]柑橘潰瘍病最初在湖南僅少數(shù)地區(qū)發(fā)病嚴重，但是，隨著生產(chǎn)上感病的甜橙類品 種的大力發(fā)展，使得該病在全省范圍內(nèi)蔓延來。據(jù)調(diào)查，湖南省已有65個縣市發(fā)病，疫區(qū)縣 市占全省總縣市的57. 5%，甜橙和柚發(fā)病果園占43% (李大志等，2005)。目前，隨著甜橙等 高感病優(yōu)良品種的推廣，病害還在不斷擴展。
[0004] 柑橘潰瘍病為害后，在柑橘葉、枝和果實上形成火山口狀的病斑，嚴重時引起落 葉、落果，樹勢衰退，直接影響柑橘的生長結果，特別是果實感病后，失去鮮銷商品價值。由 于病原菌可以隨果實傳播，因此，受檢疫法的限制，潰瘍病疫區(qū)的果實不能出售到有柑橘生 產(chǎn)的非疫區(qū)的任何市場，嚴重制約了疫區(qū)果實的市場開拓。非疫區(qū)的歐盟2010年進口柑橘 鮮果876. 73萬噸，占世界柑橘鮮果進口總量的65. 3%，進口總值占世界的70. 5%，由于歐盟 有西班牙、意大利、法國等柑橘生產(chǎn)國，所有潰瘍病疫區(qū)的柑橘果實均無法進入歐盟，失去 了一個非常重要的國際市場。重慶是目前我國建設的第一個非疫區(qū)，嚴禁調(diào)入任何疫區(qū)包 括加工甜橙在內(nèi)的甜橙果實。因此，由該病害所造成的國內(nèi)外市場開拓的限制給我國柑橘 產(chǎn)業(yè)造成了較大的損失，該病已成為湖南等亞熱帶柑橘產(chǎn)區(qū)，特別是甜橙主栽產(chǎn)區(qū)最主要 的危險性病害，在南亞熱帶和熱帶地區(qū)也是與黃龍病具有相同重要性的危險性病害。
[0005] 前人研究表明，柑橘潰瘍病菌生長溫度范圍是12~40°C，在42°C時沒有病癥出現(xiàn)。 目前，多數(shù)報道認為最適宜潰瘍病菌的的生長溫度是20~30°C，極限溫度最低為5°C，最高 為35°C;最有利的濕度條件是50%以上。暴風雨和臺風過后，易發(fā)病。柑橘潰瘍病主要危 害柑橘地上部分的組織，包括幼嫩的葉片、莖段和果實。在適宜的發(fā)病條件下，病斑首先在 葉片遠軸面形成油狀突起，隨著病原菌誘導的組織增生，油狀凸起破裂，并繼續(xù)增長，繼而 形成火山口狀凸起，也就是典型的潰瘍病病斑。病斑影響果實外觀，嚴重時因為影響葉片光 和作用而使樹勢減退。如果環(huán)境條件不適宜，典型癥狀的出現(xiàn)至少需要60d以上。
[0006] 病原菌在病葉、病枝或病果內(nèi)潛伏，遇水從病部溢出，并通過風雨條件擴散至沒有 感染的部位，經(jīng)氣孔，傷口等通道侵入寄主葉肉細胞間隙。葉片、果實和嫩枝均能感病，形成 的病斑遇到風雨天氣后加速生長，病原菌最終從病斑處溢出至寄主表面，遇到合適的環(huán)境 條件形成新一輪侵染。在不同地區(qū)，由于氣候條件和柑橘物候期的不同，發(fā)病時間會有較大 差異。在亞熱帶地區(qū)，以前春梢和秋梢很少發(fā)病，主要是夏梢易發(fā)病，生產(chǎn)上常釆用抹除夏 稍的辦法來控制潰瘍病。但是，最近幾年來，大多數(shù)甜橙園春梢也發(fā)病，部分地區(qū)的冰糖橙 果園有時候還很嚴重?，F(xiàn)在栽培上多釆用控夏梢促早秋梢的措施，以獲得大量好的結果母 枝，避免夏梢感病和引起落果的增加。各地放秋梢的時間不一，但多在7~8月份抽生秋梢， 最遲在9月上旬。這樣一來，秋稍抽生期也恰逢高溫季節(jié)，故秋梢現(xiàn)在也易發(fā)病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明采用體外抗菌試驗，研究化合物對柑橘潰瘍病菌的生物活性。
[0008] 本發(fā)明的具體技術方案如下： 本發(fā)明的創(chuàng)新點是發(fā)現(xiàn)化合物對柑橘潰瘍病菌有良好的抑菌和殺菌活性，并測量得到 其最小抑菌濃度MIC值和最小殺菌濃度MBC值，屬于首次公開。
[0009] 所述化合物結構特征如下式所示：

【具體實施方式】
[0010] 下面結合具體實施實例，進一步詳細地說明本發(fā)明。應理解下面實施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明范圍。
[0011] 實施實例1 測量最小抑菌濃度MIC值。
[0012] (1)營養(yǎng)肉湯的配制：取營養(yǎng)肉湯30g加1000mL蒸餾水即得。使用前121°C高壓 蒸汽滅菌20min待用。
[0013] (2)營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基的配制：取營養(yǎng)瓊脂45g加1000mL蒸餾水即得。使用前 121°C高壓蒸汽滅菌20min待用。
[0014] (3)菌株的培養(yǎng)：操作于超凈工作臺上進行。吸取已滅菌的液體培養(yǎng)基10mL，放在 已滅菌的試管中，然后用接菌環(huán)挑取一個菌落，加到液體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細 菌培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為28°C。
[0015] (4)菌液配制及計數(shù)：將培養(yǎng)后的菌液，釆用10倍稀釋法用液體培養(yǎng)基稀釋，并 用血球計數(shù)板在顯微鏡上初步觀察計數(shù)，然后將菌液用液體培養(yǎng)基稀釋，作為加入供試品 中的菌液。細菌采用平板計數(shù)法進行計數(shù)，將以上菌液用無菌生理鹽水再稀釋100倍，取 50 y L，均勻涂于已鋪有固體培養(yǎng)基的平皿中，培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為28°C。培養(yǎng)后，單個活 細菌生長形成一個菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可計算出樣品中的含菌數(shù)。
[0016] 計算公式為：菌液濃度=nX20X100cfu/mL (5)藥品溶液的配制：稱取化合物，加入滅菌生理鹽水，搖勾，得均勻溶液，備用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0017] (6)最小抑菌濃度（MIC)與最小殺菌濃度（MBC)的測定：采用微量肉湯稀釋法測定 最小抑菌濃度MIC(MinimalInhibitoryConcentration)。MIC為最小抑菌濃度，即藥物 與一定濃度的菌液作用后，能夠抑制可見菌生長的最低濃度。
[0018] 采用二倍稀釋法將藥液用無菌生理鹽水將藥液稀釋系列濃度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同濃度的藥液和100yL 菌液，使最終菌液濃度為1~5X105cfu/mL，第11行以無菌生理鹽水加菌液作為陽性對照，第 12行以不加菌液的無菌生理鹽水為陰性對照，混勻后于28°C培養(yǎng)24h，以肉眼觀察藥物最 低濃度管中無細菌生長者為該試驗藥物的MIC，每個實驗重復三次。
[0019] 測得最小抑菌濃度MIC值為8yg/mL。
[0020] 實施實例2 測量最小殺菌濃度MBC值。
[0021] (1)營養(yǎng)肉湯的配制：取營養(yǎng)肉湯30g加1000mL蒸餾水即得。使用前121°C高壓 蒸汽滅菌20min待用。
[0022] (2)營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基的配制：取營養(yǎng)瓊脂45g加1000mL蒸餾水即得。使用前 121°C高壓蒸汽滅菌20min待用。
[0023] (3)菌株的培養(yǎng)：操作于超凈工作臺上進行。吸取已滅菌的液體培養(yǎng)基10mL，放在 已滅菌的試管中，然后用接菌環(huán)挑取一個菌落，加到液體培養(yǎng)基中，放于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細 菌培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為28°C。
[0024] (4)菌液配制及計數(shù)：將培養(yǎng)后的菌液，釆用10倍稀釋法用液體培養(yǎng)基稀釋，并 用血球計數(shù)板在顯微鏡上初步觀察計數(shù)，然后將菌液用液體培養(yǎng)基稀釋，作為加入供試品 中的菌液。細菌采用平板計數(shù)法進行計數(shù)，將以上菌液用無菌生理鹽水再稀釋100倍，取 50 y L，均勻涂于已鋪有固體培養(yǎng)基的平皿中，培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度為28°C。培養(yǎng)后，單個活 細菌生長形成一個菌落，統(tǒng)計菌落數(shù)目，即可計算出樣品中的含菌數(shù)；計算公式為：菌液濃 度=nX20X 100cfu/mL。
[0025] (5)藥品溶液的配制：稱取化合物，加入滅菌生理鹽水，搖勾，得均勻溶液，備用。存 放于4°C冰箱保存待用。
[0026] (6)最小抑菌濃度（MIC)與最小殺菌濃度（MBC)的測定：采用微量肉湯稀釋法測定 最小殺菌濃度MBC(MinimalBactericidalConcentration)。在MIC基礎上，從每管吸取 10yL溶液，點于固體培養(yǎng)基上，繼續(xù)按MIC培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，以完全殺滅細菌的最低濃度 為最小殺菌濃度(菌落數(shù)小于等于5)。
[0027] 采用二倍稀釋法將藥液用無菌生理鹽水將藥液稀釋系列濃度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256 yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加lOOyL不同濃度的藥液和lOOyL 菌液，使最終菌液濃度為l~5X105cfu/mL，第11行以無菌生理鹽水加菌液作為陽性對照， 第12行以不加菌液的無菌生理鹽水為陰性對照，混勻后于28°C培養(yǎng)24h，以肉眼觀察藥物 最低濃度管中無細菌生長者為該試驗藥物的MIC。將上述未見生長細菌的各孔中的肉湯取 10 y L接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，做好標記，于28°C培養(yǎng)24h，以仍無細菌生長的管內(nèi)藥物濃 度記為該藥的MBC，每個實驗重復三次。
[0028] 測得最小殺菌濃度MBC值為32 y g/mL。
【主權項】
1. 一種抑制柑橘潰瘍病菌生長的化合物，其特征在于： (1) 結構特征如下式所示：(2) 其可作為柑橘潰瘍病菌的抑制劑和殺菌劑； (3) 其對柑橘潰瘍病菌的最小抑菌濃度MIC值為8 μ g/mL ; (4) 其對柑橘潰瘍病菌的最小殺菌濃度MBC值為32 μ g/mL。
【專利摘要】本發(fā)明發(fā)現(xiàn)對柑橘潰瘍病菌具有抑菌和殺菌活性的化合物。其柑橘潰瘍病菌的最小抑菌濃度MIC值為8μg/mL，最小殺菌濃度MBC值為32μg/mL。
【IPC分類】A01N43/86, C07D413/04, A01P3/00
【公開號】CN105153140
【申請?zhí)枴緾N201510730268
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請人】許自協(xié)
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年11月2日